GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討地錦草藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其抗炎作用機(jī)制

陳迪路，姚思凡，孫伍慧，張 藝，趙碧清*，周小江，3

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023；3.湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208

炎癥是機(jī)體對感染或組織損傷做出的天然防御機(jī)制，是一個復(fù)雜的病理過程[1]，疼痛、發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和浮腫是炎癥的基本癥狀[2]。 機(jī)體免疫像一把“雙刃劍”：一方面，可以防御機(jī)體免受感染等刺激帶來的損傷，有助于疾病的痊愈；另一方面，控制不當(dāng)則會對機(jī)體功能造成損傷[3]。 非甾體抗炎藥常用于治療炎癥，但長期使用這些藥物會導(dǎo)致胃腸道潰瘍、腎功能不全和出血[4-5]。 現(xiàn)代研究表明，中藥憑借其多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在抗炎方面發(fā)揮重要的作用[6-7]。因此，從中藥中尋找療效顯著、不良反應(yīng)小的炎癥抑制劑具有重要意義。

地錦草現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》2020年版，為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.或斑地錦Euphorbia maculate L.的干燥全草，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的功效[8]，臨床上用于治療痢疾、泄瀉、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等，具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用。 其化學(xué)成分主要為黃酮類、三萜類、鞣質(zhì)及酚酸類化合物[9]。 其中，槲皮素、山柰酚等黃酮類和棕櫚酸等酚酸類成分均具有抗炎活性[10-12]。 研究發(fā)現(xiàn)，地錦草總黃酮可保護(hù)膿毒癥大鼠的腸道屏障功能，降低炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，控制炎癥并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展[13-15]。 然而，關(guān)于地錦草化學(xué)成分種類，尤其是體內(nèi)抗炎活性物質(zhì)的研究較少，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)的理論為基礎(chǔ)，通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的角度闡述藥物與疾病的關(guān)聯(lián)性，對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制研究的發(fā)展起到了重要作用[16-18]。 本研究采用GC-MS、UPLC-Q-TOFMS/MS 分析地錦草的化學(xué)成分，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其活性成分抗炎作用的靶點(diǎn)和通路，為地錦草這一藥用資源的合理開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Sciex ExionLC AD 液相色譜儀（美國SCIEX 公司）；SCIEX X500R QTOF（美國SCIEX 公司）；ISQTM 7000 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（德國賽默飛世爾科技公司）；TRACE 1300 氣相色譜儀（德國賽默飛世爾科技公司）；CP214 分析天平（美國奧豪斯公司）；SorvaLL ST8R 高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

地錦草采于湖南中醫(yī)藥大學(xué)周邊，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)許光明教授鑒定為大戟科植物地錦Euphorbia humifusa Willd.的干燥全草。色譜甲醇購自德國默克公司（批號：I1099407026）；色譜甲酸購自德國CNW 公司（批號：71140180）；純凈水購自華潤怡寶飲料有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP,https://tcmspw.com/index.php）；PubChem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）；DrugBank 數(shù)據(jù)庫（http://go.drugbank.com）；DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/home/）；STRING 11.5數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）；DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape 3.9.0 軟件。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取地錦草藥材適量，加10 倍量70%乙醇，浸泡1 h 后回流提取1.5 h，冷卻過濾后再加8 倍量70%乙醇，提取1 h，過濾，合并2 次濾液，濃縮至無醇味，備用。

2.1.1 GC-MS 溶液制備 將提取后的樣品用石油醚萃取，充分搖勻靜止后，取石油醚層，減壓干燥得浸膏。 精密稱取0.266 5 g 地錦草石油醚層浸膏，用石油醚溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半徑6 cm 條件下離心15 min，取上清液分析。

2.1.2 LC-MS 溶液制備 將提取后的樣品用乙酸乙酯和正丁醇分別萃取，減壓干燥得浸膏。 分別精密稱取0.2 572 g、0.2 391 g，用色譜甲醇溶解，定容至25 mL 容量瓶，在12 000 r/min、半徑6 cm 條件下離心15 min，取上清液分析。

2.2 GC-MS 條件

2.2.1 色譜條件 以Thermo scientific TG-5SILMS GC Column（30 m×0.25 mm×0.25 μm）型色譜柱為固定相，進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積為1.0 μL；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至280 ℃，保持4 min。

2.2.2 質(zhì)譜條件 EI 源(70 eV)，質(zhì)譜轉(zhuǎn)換線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃，全程掃描，掃描間歇0.2 s，質(zhì)量范圍45～350 m/z。

2.3 LC-MS 條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm×1.7 μm）色譜柱，流動相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫：0～25 min，10%～30% B；25～26 min，30%～50% B；26～35 min，50%～65% B；35～36 min，65%～85% B；36～50 min，85%～100% B；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.3 mL/min。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧正、 負(fù)離子模式，各化合物IDA 模式母離子多重離子掃描，一級錐孔電壓分別為80 V、-80 V，碰撞電壓分別為10 V、-10 V，一級質(zhì)譜母離子掃描范圍為100～1 000 m/z。

2.4 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測地錦草抗炎作用機(jī)制

基于GC-MS、UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析得到地錦草化學(xué)成分信息，結(jié)合TCMSP 和地錦草相關(guān)文獻(xiàn)，采用PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取化合物的結(jié)構(gòu)圖，將所獲取的化合物結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target ADME 數(shù)據(jù)庫篩選其活性成分。 篩選標(biāo)準(zhǔn)：腸胃吸收（gatrointesti nal absortion；GIabsortion）為“high”；Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 結(jié)果中有2 個及2 個以上為“yes”[19]。采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測成分靶點(diǎn)，合并去重后獲得地錦草成分靶點(diǎn)。 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 個數(shù)據(jù)庫中搜索“anti-inflammatory”“inflammation”，獲得與之相關(guān)的基因，合并數(shù)據(jù)庫的查找結(jié)果并刪除重復(fù)靶點(diǎn)，所得靶點(diǎn)即為相關(guān)靶點(diǎn)。將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)。 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，獲得靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系并導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，對各靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行分析，以度值（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值進(jìn)行篩選，獲得核心靶點(diǎn)，采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程富集分析和KEGG通路分析。 最終，構(gòu)建地錦草抗炎作用的“活性成分-核心靶點(diǎn)-通路”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

3 結(jié)果

3.1 地錦草化學(xué)成分鑒定

3.1.1 GC-MS 分析結(jié)果 通過Thermo Chromeleon數(shù)據(jù)分析軟件結(jié)合NIST14 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫和相對保留指數(shù)，對總離子流圖中的各峰進(jìn)行分析，以面積歸一化法測得地錦草石油醚層中各組分相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果共鑒別出50 個化合物。 詳見圖1 與表1。

表1 地錦草GC-MS 化學(xué)成分分析鑒定

圖1 地錦草石油醚層GC-MS 總離子流圖

3.1.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析結(jié)果 采用UPLCQ-TOF-MS/MS 技術(shù)分別對地錦草中的乙酸乙酯和正丁醇部位的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖2。通過一級和二級質(zhì)譜信息分析并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，從地錦草圖譜中共鑒定出76個化學(xué)成分，主要為黃酮類、有機(jī)酸類成分。 詳見表2。

表2 地錦草UPLC-Q-TOF-MS 化學(xué)成分分析鑒定

圖2 地錦草UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析的總離子流圖

3.2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的地錦草抗炎作用機(jī)制預(yù)測結(jié)果

3.2.1 地錦草有效成分的獲得 基于“2.4”項(xiàng)下的篩選原則，共篩選獲得活性成分12 個。詳見表3。進(jìn)一步采用SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，獲得成分靶點(diǎn)1 001 個，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后共得到成分靶點(diǎn)214 個。

表3 地錦草有效成分信息

3.2.2 疾病靶點(diǎn)的獲得 在GeneCards、DrugBank、DisGeNET 3 個數(shù)據(jù)庫中搜索“Anti-inflammatory”“Inflammation”，獲得與之相關(guān)的靶點(diǎn)，合并數(shù)據(jù)庫的查找結(jié)果，并刪除重復(fù)項(xiàng)后得到10 688 靶點(diǎn)。 將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得交集靶點(diǎn)198 個，作為地錦草抗炎作用的潛在靶點(diǎn)。 詳見圖3。

圖3 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

3.2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫，獲得靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，保存為TSV 文件。 進(jìn)一步將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.9.0 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。 詳見圖4。 對各靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行分析，以度值（Degree）、介數(shù)中心性（Betweenness）、接近中心性（Closeness）均大于其平均值進(jìn)行篩選，其中Degree>318.548 2，Betweenness>257.126 9，Closeness>0.002 2，篩選出37 個靶點(diǎn)。其中，排名靠前的蛋白激酶B 1（kinases-protein kinase B 1, Akt1）、表皮生長因子受體A（epidermal growth factor receptor A, EGFRA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、SRC、ESR1、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2,PTGS2）、過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARG)可能為地錦草抗炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖4 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)

3.2.4 富集分析及成分靶標(biāo)通路功能網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對地錦草抗炎的37 個核心靶點(diǎn)進(jìn)行功能注釋分析（GO 分析），包含生物學(xué)過程（bioprogress, BP），細(xì)胞組分（cell components, CC）和分子功能（molicular function, MF）3 個方面，選取其P 值最小的前10 個數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理，見圖5A。DAVID 網(wǎng)站分析共得到66 條KEGG 通路，選取P值最小的且與炎癥密切相關(guān)的前10 個通路進(jìn)行可視化處理，見圖5B。結(jié)果表明，與地錦草抗炎作用密切相關(guān)的信號通路主要包括磷脂酰肌-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B, PI3K/PKB）信號通路、Ras 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）信號通路、鈣信號通路、Ras 相關(guān)蛋白1（Rasrelated protein 1, Rap1）信號通路等。將KEGG 通路圖進(jìn)行深度分析和整合，構(gòu)建抗炎調(diào)控機(jī)制圖，詳見圖6。

圖5 GO(A)和KEGG(B)富集分析結(jié)果

圖6 地錦草抗炎調(diào)控機(jī)制圖

4 討論

GC-MS 聯(lián)用儀具有靈敏度好、分辨率較好、有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫等優(yōu)點(diǎn)，適合中藥樣品中復(fù)雜的揮發(fā)性成分分析，鑒定化合物快捷且簡便[20-21]。 結(jié)果顯示，地錦草石油醚層共鑒定出50 個化學(xué)成分，揮發(fā)性主要成分為酸類、酯類、酮類等物質(zhì)，主要揮發(fā)性成分為棕櫚酸等[22]。 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術(shù)共從地錦草乙酸乙酯和正丁醇提取物中鑒定出76 個化學(xué)成分，主要為黃酮類、有機(jī)酸類成分[23-24]。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在中藥及復(fù)方有效成分篩選、靶點(diǎn)及通路的預(yù)測方面得到了廣泛應(yīng)用[25-26]。 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測中藥活性成分、作用靶點(diǎn)及作用通路，能夠節(jié)約藥物開發(fā)成本，同時也為中藥的機(jī)制研究提供新思路[27-28]。 本研究通過地錦草“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，挖掘地錦草抗炎作用的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，探索潛在的抗炎機(jī)制。 黃酮類和酚酸類化合物是地錦草中主要化學(xué)成分，大量研究表明，此類化合物具有抗炎作用。 本研究篩選出的12 個活性成分，也主要為黃酮類成分，具體包括鞣花酸、山柰酚、芹菜素、槲皮素、柚皮素、木犀草素等。 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選得出的部分化合物未能采用質(zhì)譜從植物中鑒定，可能與化合物在地錦草中含量較低，以及提取時的溶劑極性、溫度等不符有關(guān)，但其類藥性和口服生物利用度均高于其他被鑒定出來的提取物。且由于這些高活性化合物在低濃度下也有顯著的藥理活性，故結(jié)合TCMSP 數(shù)據(jù)庫，將這些成藥性較高，但含量較低的化合物納入了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。

地錦草抗炎作用的核心靶點(diǎn)包括KT1、EGFR、VEGFA、SRC、ESR1、ERBB2、PTGS2、PPARG 等。 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮素可以負(fù)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)和脂多糖誘導(dǎo)的腹膜炎，對炎癥介質(zhì)的釋放以及SRC 的酶活性具有抑制作用[29]。 芹菜素可提升肺炎鏈球菌腦膜炎大鼠神經(jīng)系統(tǒng)評分，減輕炎癥反應(yīng)，抑制大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，對肺炎鏈球菌腦膜炎大鼠腦損傷起保護(hù)作用[30]。 鞣花酸可以明顯改善腦缺血再灌注大鼠的血腦屏障、腦組織損傷、運(yùn)動和探索行為，有效抑制炎癥反應(yīng)[31]。 此外，鞣花酸還能夠修復(fù)腸黏膜屏障，抑制NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 炎癥小體活化，下調(diào)胱天蛋白酶-1表達(dá)水平，顯著改善脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性腸道炎癥[32]。結(jié)合文獻(xiàn)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明，地錦草中的黃酮類成分芹菜素、槲皮素、木犀草素等，以及鞣花酸等多酚類化合物可能為抗炎的關(guān)鍵成分，VEGFA、SRC、ESR1 等可能為抗炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

根據(jù)KEGG 分析，地錦草抗炎作用與PI3K/Akt、ErbB、VEGF、甲狀腺激素、雌激素等信號通路有關(guān)。PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是經(jīng)典的調(diào)控細(xì)胞分化、促細(xì)胞存活、抗細(xì)胞凋亡的通路，Akt 是PI3K/Akt 信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，PI3K/Akt 信號通路對多種生命活動的調(diào)控均有賴于Akt 的磷酸化[33]。PI3K/Akt 信號通路參與NDMA 誘導(dǎo)的肺纖維化的病因，通過PTEN介導(dǎo)抑制PI3K/Akt、NF-κB 和MDM2-p53 信號通路，發(fā)揮抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[34]。研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素以劑量依賴方式抑制Akt 的磷酸化，減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)， 通過NF-κB/AP-1/PI3K/Akt信號通路顯著抑制NO 和PGE-2 的產(chǎn)生[35]。VEGFA能夠介導(dǎo)炎性細(xì)胞的募集，并增強(qiáng)募集和駐留的單核細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)[36]。研究表明，槲皮素可以減輕膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥，提高對關(guān)節(jié)軟骨和骨的保護(hù)作用，通過抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜VEGFA 的表達(dá)，發(fā)揮抗血管新生作用[37]。本研究結(jié)果提示，地錦草可能通過作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)，調(diào)控以上信號通路發(fā)揮抗炎作用。

地錦草通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用發(fā)揮抗炎作用，為后續(xù)地錦草抗炎作用的靶點(diǎn)和通路研究奠定基礎(chǔ)，為其深入研究與應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐，對深入闡述中藥的活性成分、藥效學(xué)作用及相關(guān)機(jī)制具有重要作用。 今后可以加強(qiáng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證地錦草對關(guān)鍵靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用以及藥物對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。