嗜鹽菌Salicola marasensis TG-5的色素積聚、組成及鑒定研究

孫 鑫, 侍亞敏,張港生, 朱大玲

(1.天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院,天津 300457;2.天津市鹵水化工與資源生態(tài)化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

1 前言

嗜鹽微生物,作為極端微生物的代表之一,是一類能夠生長(zhǎng)于中、高濃度鹽環(huán)境中的微生物,通常包括古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物三個(gè)分支。多數(shù)嗜鹽微生物分布于海洋、鹽湖、鹽礦、鹽堿土壤以及腌制品中[1-2]。獨(dú)特的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝機(jī)制使它們能夠在極端鹽度環(huán)境中生存和繁殖,并在維持生存環(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮積極作用。其中,嗜鹽細(xì)菌具有耐受性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn),在高鹽廢水生化處理、高值產(chǎn)品開發(fā)等領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用,具有較好的應(yīng)用前景[3-4]。

已有報(bào)道表明許多高鹽環(huán)境中的嗜鹽微生物富含類胡蘿卜素,如嗜鹽古菌和細(xì)菌中富含C50類胡蘿卜素(菌紅素)、杜氏鹽藻(Dunaliellasalina)富含β-胡蘿卜素[5]等。類胡蘿卜素具有較強(qiáng)的抗氧化性,可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的抑制,維持細(xì)胞的正常代謝[6]。類胡蘿卜素還作為維生素a原,在人類健康中發(fā)揮重要作用,預(yù)防黃斑退行性疾病和癌癥,這使得類胡蘿卜素在食品、制藥和化妝品行業(yè)非常有價(jià)值[7-8]。嗜鹽菌所產(chǎn)的類胡蘿卜素已在保健品、飼料添加劑、化妝品抗氧化劑等方面具有較好的應(yīng)用前景[9-11],如現(xiàn)已開發(fā)出天然類胡蘿卜素膠囊、β-胡蘿卜素含片等產(chǎn)品[12]。通常不同微生物中含有的色素種類并不單一,色素的代謝與細(xì)胞所處環(huán)境條件密切相關(guān)。

大多數(shù)嗜鹽菌菌落顏色呈紅色、橘紅色、粉色等,這是因?yàn)槭塞}菌需要積累大量類胡蘿卜素,來(lái)保護(hù)細(xì)胞不被高鹽或高輻射等環(huán)境條件所破壞[13-14],通常在脅迫條件下可促進(jìn)類胡蘿卜素在細(xì)胞內(nèi)的積聚。眾多研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌/細(xì)菌中色素主要由大量的菌紅素及其衍生物和少量的β-胡蘿卜素、番茄紅素等組成。菌紅素及其衍生物為C50類胡蘿卜素,它們不僅可以提高細(xì)胞膜的剛性和流動(dòng)性[15],而且由于其較強(qiáng)的抗氧化特性,可保護(hù)細(xì)胞免受輻射能量的有害影響和中低鹽度產(chǎn)生的滲透脅迫[16-17]。Kushwaha等[18]利用薄層層析法和全光譜掃描確定嗜鹽古菌Halobacteriumcutirubrum中的色素為菌紅素,主要為單脫水菌紅素和雙脫水菌紅素;Fang等[19]提取了嗜鹽古菌Haloferaxmediterranei中的色素,發(fā)現(xiàn)其中含有C45類胡蘿卜素和菌紅素;Jehlicka等[20]對(duì)嗜鹽細(xì)菌Salinibacterrubers色素進(jìn)行定性分析,發(fā)現(xiàn)主要色素為α-菌紅素。文章以嗜鹽菌SalicolamarasensisTG-5為研究對(duì)象,對(duì)其在不同鹽度條件下的色素積聚量進(jìn)行分析,并對(duì)其所產(chǎn)色素進(jìn)行鑒定,以期該菌株為色素生產(chǎn)菌株的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 菌種來(lái)源

嗜鹽菌SalicolamarasensisTG-5為實(shí)驗(yàn)室從天津?yàn)I海新區(qū)某鹽場(chǎng)結(jié)晶池中篩選獲得并保存?zhèn)溆?。該菌株耐逆性?qiáng)且生長(zhǎng)速度快,在高鹽廢水處理和高值產(chǎn)品開發(fā)等應(yīng)用方面具有良好的潛力。

2.2 液體培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母粉1 g/L,檸檬酸鐵0.01 g/L,NaCl 120 g/L(根據(jù)鹽度需要添加),加入陳海水充分?jǐn)嚢?調(diào)節(jié)至pH值7.6～7.8,定容至1 L。121 ℃ 1×105Pa高壓滅菌20 min備用。陳海水的制備:將取自天津?yàn)I海新區(qū)海邊的自然海水靜置12 h后,使用脫脂棉過(guò)濾掉海水中的大顆粒雜質(zhì)和生物體后備用。

2.3 實(shí)驗(yàn)藥品和儀器

AL204精密電子天平,賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司,FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì),梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司;WZS A3鹽度計(jì),上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司;UV-1800紫外分光光度計(jì),日本島津有限公司;TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HNY-200B,恒溫培養(yǎng)振蕩器,天津市歐諾儀器儀表有限公司;YXQ-LS-50SII,立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LCMS-IT-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀,日本島津有限公司。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將菌株TG-5分別接種于鹽度梯度為0%～30%、間隔5 %的2216E液體培養(yǎng)基(pH值7.5、接種量10%)中,37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)數(shù)天,直至達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行。每隔6 h,取菌液進(jìn)行生物量測(cè)定。生物量的測(cè)定方法采用分光光度法,即測(cè)定菌液在波長(zhǎng)為600 nm時(shí)的光吸收值OD600。

2.4.2 培養(yǎng)鹽度對(duì)色素積聚的影響

分別設(shè)置培養(yǎng)鹽度為12%、15%、18%、21%、24%、27%、30%七個(gè)實(shí)驗(yàn)組,按接種量10%(體積比),分別將活化的菌液接種至100 mL 相應(yīng)鹽度的2216E培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)7 d,觀察菌株生長(zhǎng)情況和色素積聚情況。

色素的提取方法采用有機(jī)溶劑提取法,具體操作參照惠壽年等方法[21],并稍作修改。取20 mL菌液,5 000 r/min、4 ℃冷凍離心15 min,棄去上清液,收集菌體。加入適量混合溶劑甲醇 ∶氯仿(0.8 ∶2.1,體積比)反復(fù)浸提直至沉淀變?yōu)榘咨?向紅色上清液中加入1.5 mL氯仿和1.5 mL水,劇烈振蕩30 min,10 000 r/min、4 ℃冷凍離心10 min,收集上層紅色上清液,提取全程進(jìn)行避光操作,避免色素的降解。最后,將色素粗提液置于暗處,待有機(jī)溶劑揮發(fā)干后,用少許丙酮溶解,低溫避光保存?zhèn)溆?。用于后續(xù)的色素的連續(xù)廣譜分析、薄層層析分析等。

2.4.3 色素的連續(xù)光譜分析

將色素粗提液稀釋至一定濃度,以丙酮溶液做空白對(duì)照,采用紫外可見分光光度計(jì)分析色素粗提液在200～1 000 nm區(qū)間內(nèi)的連續(xù)光譜,確定色素的最大吸收波長(zhǎng)。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制出色素的連續(xù)吸收光譜圖。

根據(jù)連續(xù)吸收光譜圖測(cè)定的特殊峰值,測(cè)定色素粗提液在這些特定峰值下的相應(yīng)OD值,通過(guò)比較分析可得到不同鹽度條件下菌株TG-5的色素積聚量的差異。

2.4.4 色素的薄層層析分析

取10 cm×20 cm的硅膠板GF 254(100 mm×200 mm,青島鼎康硅膠有限公司),切成10 cm×10 cm的規(guī)格大小,先在硅膠板距離最下方1.8 cm處用鉛筆畫一條直線作為點(diǎn)樣處,每隔一定距離做樣品標(biāo)記,吸取嗜鹽菌色素粗提液于劃線處點(diǎn)樣,點(diǎn)的直徑不大于2～3 mm,樣品點(diǎn)樣間隔距離為1.5～2 cm。點(diǎn)樣完成后,靜置幾秒鐘待其晾干,將硅膠板緩慢放置于盛有展開劑為石油醚 ∶丙酮=1.5 ∶1(體積比)的層析缸內(nèi)(層析缸內(nèi)需提前放入展開劑使層析缸內(nèi)的空氣飽和),浸入深度約為0.5 cm[22]。待展開劑前沿距離頂端約0.5 cm時(shí),將色譜板取出、晾干。平行實(shí)驗(yàn)三次并拍照記錄。

2.4.5 色素的鑒定分析

將硅膠板上的條帶分別刮下,用適量丙酮溶液重懸洗脫色素,經(jīng)10 000 r/min離心10 min,取上清,重復(fù)2～3次洗脫后收集上清液,置于陰暗干燥處待其揮發(fā)干后,復(fù)溶于甲醇溶液。使用有機(jī)濾膜過(guò)濾去除溶液中的雜質(zhì),稀釋1倍即得到待測(cè)樣品。

色譜的鑒定分析采用質(zhì)譜直接進(jìn)樣法。利用三氟乙酸調(diào)諧液進(jìn)行調(diào)諧,以保證準(zhǔn)確性。具體操作條件如下:進(jìn)樣量和進(jìn)樣流速分別為0.3 μL和0.2 mL/min;采用正離子模式采集,霧化氣體和干燥氣體為氮?dú)?。參?shù)設(shè)置為MS1的質(zhì)量掃描范圍為100～1 000m/z;噴霧室電壓分別為4.5、-3.5 kV;霧化氣體(N2)流量1.5 L/min;干燥氣體壓力106 kPa;檢測(cè)電壓1.57 kV;曲型脫溶劑管(CDL)溫度200 ℃,加熱模塊溫度200 ℃,數(shù)據(jù)處理采用LCMS solution Version 1.1軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同鹽度條件下菌株TG-5的生長(zhǎng)曲線比較

不同鹽度條件下菌株TG-5生長(zhǎng)曲線見圖1。

圖1 不同鹽度條件下菌株TG-5的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curves of strain TG-5 under different salinities

在0%～5%鹽度條件下,菌株TG-5生長(zhǎng)處于停滯狀態(tài),生物量低于0.2。而在10%較低鹽度和30%較高鹽度條件下,培養(yǎng)初期菌株生長(zhǎng)迅速,22 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,生物量分別穩(wěn)定在0.3和0.6左右,在此鹽度條件下菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較短且生物量較低。而在15%～20%鹽度條件下,培養(yǎng)初期菌體迅速生長(zhǎng),且對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng),無(wú)明顯穩(wěn)定期。培養(yǎng)4 d后,生物量的增長(zhǎng)速度放緩,生物量分別可達(dá)1.2、1.1左右。15 %鹽度條件下,培養(yǎng)5 d時(shí),菌株的生長(zhǎng)速率和生物量積聚分別為0.26/d和1.4,所以菌株TG-5對(duì)培養(yǎng)鹽度要求寬泛,最佳生長(zhǎng)鹽度條件為15 %。當(dāng)鹽度低于10 %時(shí),菌株TG-5的生長(zhǎng)明顯受到抑制,這表明此時(shí)細(xì)胞正耐受低滲壓力,已經(jīng)影響到細(xì)胞的正常代謝。汪雪婷等[23]發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌HalobacillusfaecisZSTB203在鹽度0%～20%范圍內(nèi)均可生長(zhǎng),且在10 %鹽度時(shí)生長(zhǎng)最好;劉翠華等[24]發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌HalomonassubterraneaYZ1的最適生長(zhǎng)鹽濃度范圍為30～150 g/L;而研究中菌株TG-5的生長(zhǎng)鹽度范圍和最佳生長(zhǎng)鹽度分別為10%～30%和15%,因此培養(yǎng)鹽度對(duì)不同嗜鹽菌株的影響是有差異的,這可能與菌株分離自何種環(huán)境有關(guān)。

3.2 培養(yǎng)鹽度對(duì)菌株TG-5色素積累的影響

培養(yǎng)鹽度對(duì)菌株TG-5胞內(nèi)色素積聚影響明顯,結(jié)果見圖2。菌株TG-5在不同鹽度培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)7 d后,菌液顏色出現(xiàn)明顯的差異。在培養(yǎng)鹽度為2%～10%區(qū)間內(nèi),菌液呈淡黃色;當(dāng)培養(yǎng)鹽度升至12%時(shí),菌液顏色發(fā)生明顯變化,呈紅色,這表明菌株TG-5從該鹽度開始積累紅色色素。隨著培養(yǎng)鹽度升高,菌液顏色逐漸加深。因此,后續(xù)色素分析實(shí)驗(yàn)選取鹽度從12%開始,間隔3%,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組采用薄層層析技術(shù)進(jìn)行色素組成分析。

圖2 不同鹽度條件下菌株TG-5的菌液狀態(tài)Fig.2 Bacterial liquid state of the strain TG-5 under different salinity conditions

不同鹽度條件下菌株色素提取液的連續(xù)吸收光譜分析結(jié)果表明,不同鹽度條件下,色素的連續(xù)廣譜圖和其中的特征吸收峰都相似,因此文章中只列出一張圖譜,見圖3。色素的丙酮提取液的連續(xù)廣譜圖中共有3個(gè)特征吸收峰,分別位于388、495、528 nm波長(zhǎng)處。Britton等[25]指出菌紅素的吸收峰為465、491、522 nm;Strand等[26]發(fā)觀Micrococcusroseue中的脫水菌紅素在丙酮中的吸收峰為370、388、467、493、525 nm;Fong等[27]對(duì)Arthrobacteragilis進(jìn)行色素分析,發(fā)現(xiàn)菌紅素的吸收峰為468、494、527 nm。與這些已有研究結(jié)果相比,推斷菌株TG-5在鹽度12%～30%條件下積累的紅色色素可能為菌紅素或者脫水菌紅素。

圖3 菌株TG-5色素的連續(xù)吸收光譜圖Fig.3 Pigment continuous absorption spectra pattern of the strain TG-5

在連續(xù)吸收光譜圖的基礎(chǔ)上,針對(duì)388、495、528 nm處三個(gè)吸收峰,比較分析了不同鹽度條件下菌株TG-5的色素積聚量差異,結(jié)果見圖4。

圖4 不同鹽度條件下菌株TG-5的色素積聚量差異Fig.4 Difference of pigment accumulation of the strain TG-5 under different salinity conditions

隨著鹽度的升高,色素積累量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。色素在波長(zhǎng)495 nm處吸光度值較高,當(dāng)鹽度為18%時(shí),色素粗提液的吸光值達(dá)到最大值0.98,高于15%和21%鹽度條件下的色素積累量。其中,鹽度30%條件下菌株的色素積累量最少,僅為鹽度18%條件下色素積累量的1/5,這可能是由于極高鹽條件下,細(xì)胞處于極端逆境脅迫狀態(tài),胞內(nèi)代謝活動(dòng)變緩,色素代謝也受到影響。Kushwaha等[28]發(fā)現(xiàn)Haloferaxmediterranei在鹽度15%的培養(yǎng)基中菌株的菌紅素含量是鹽度35%培養(yǎng)基中的14倍;Sui等[29]發(fā)現(xiàn),與20%鹽度相比,在15%鹽度條件下HalobacteriumstrainSP-2和HalorubrumstrainSP-4兩菌株可以積累更多的C50菌紅素。研究菌株TG-5在15%、18%鹽度條件下積累色素較多,其次是21%鹽度條件,鹽度過(guò)低或過(guò)高都不適宜色素的積累。鹽度對(duì)色素的影響與對(duì)生長(zhǎng)的影響情況相近。

菌株TG-5色素提取液薄層層析圖譜見圖5。

圖5 不同鹽度條件下菌株TG-5的色素薄層層析圖譜Fig.5 Pigment thin-layer chromatography pattern of the strain TG-5 at different salinity conditions

TLC結(jié)果表明在12%、21%、24%、27%、30%鹽度條件下,色素條帶只有2條,即T5和T6,硅膠板從上至下,顏色分別為淡粉色和紅色;而在15%和18%鹽度條件下,色素條帶有4條,即T1、T2、T3和T4,硅膠板從上至下,顏色依次為黃色、淡紅色、淡紅色和紅色。不同鹽度條件下色素的積聚種類有差別,且積聚量也有差異。在較低鹽度條件下,色素由4條條帶組成,其中T4條帶的顏色最紅,表明含量高。而在較高鹽度條件下,色素由2條條帶組成,其中T6條帶較紅,表明含量高。根據(jù)色素的遷移速率,可知,T5條帶和T2條帶的位置一致,T6條帶和T3條帶的位置一致。

3.3 色素的鑒定分析

采用質(zhì)譜分析法對(duì)菌株TG-5色素的TLC圖譜中的條帶進(jìn)行定性分析,圖中T1、T2、T3、T4條帶相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖分別見圖6。結(jié)果表明4條條帶質(zhì)譜圖中特征峰的差別不大,這說(shuō)明4條條帶為同一種物質(zhì),且為結(jié)構(gòu)相近的衍生物。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),可知響應(yīng)值701m/z代表C50菌紅素分子脫掉2分子H2O的結(jié)果,故推測(cè)T1組分含有雙脫水菌紅素[26-27]。T2、T3、T4條帶的MS結(jié)果中皆含有701m/z的峰值,表明這三種條帶為雙脫水菌紅素的衍生物,這與路萬(wàn)龍[22]和侯靖等[30]對(duì)嗜鹽古菌的色素成分分析結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)LC-MS結(jié)果中均含有響應(yīng)值704m/z或705m/z,表明含有雙脫水菌紅素成分。因此,菌株TG-5胞內(nèi)積聚的色素為C50類胡蘿卜素,主要為雙脫水菌紅素及其衍生物。

圖6 不同條帶的MS分析(a)T1條帶;(b)T2條帶;(c)T3條帶;(d)T4條帶Fig.6 MS analysis of different bands (a)T1 band; (b)T2 band;(c)T3 band; (d)T4 band

4 結(jié)論

1)通過(guò)比較不同鹽度條件下嗜鹽菌SalicolamarasensisTG-5的生長(zhǎng)曲線,發(fā)現(xiàn)該菌株的鹽度生長(zhǎng)范圍為10%～30%,最佳的生長(zhǎng)鹽度為15%。

2)色素粗提液的連續(xù)吸收光譜分析結(jié)果表明色素在388、495、528 nm三個(gè)波長(zhǎng)處有特征吸收峰,推測(cè)色素為菌紅素及其衍生物;根據(jù)特征峰的峰值比較,培養(yǎng)鹽度對(duì)色素積累的影響明顯,鹽度18%時(shí)菌株色素積聚量最大。

3)利用薄層層析法分析結(jié)果表明:不同培養(yǎng)鹽度條件下色素組分也有一定的差異。在較低鹽度條件下和較高鹽度條件下,色素的組分分別為四種和兩種。分別對(duì)色素組分進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,結(jié)果表明四種組分皆為雙脫水菌紅素及其衍生物。