DNA 分子標記技術(shù)及其在犬品種鑒定中的應用

李 強 李 濤 魏榮興 余傳剛

隨著社會科技和經(jīng)濟的發(fā)展，犬在人類社會中發(fā)揮著越來越大的作用。它們既可以作為人類忠實的伴侶輔助完成其日常的工作如陪伴、導盲、心理疾病治療等，也可以作為警犬在巡邏、追蹤、搜毒、搜爆等社會公共安全領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。然而，由于傳統(tǒng)上犬的品種是根據(jù)它們在人類活動中的作用、身體表型和歷史記錄進行分組的，所以不同品種的犬，性情和工作性能也不一樣，尤其是在目前社會上涉犬案件的增多以及國家對于本土優(yōu)秀犬種的種質(zhì)資源保存與開發(fā)日益重視，因此開展犬品種鑒定工作迫在眉睫。

傳統(tǒng)的犬品種鑒定方法是根據(jù)系譜或者體型外貌特征來判斷，然而建立犬的系譜是一項漫長煩瑣的工作，當前市場上許多養(yǎng)犬商家并沒有意識和能力建立完善的系譜，導致品種鑒定不精準，系譜參考意義不大。此外，由于犬的品種眾多，體型外貌特征復雜且有許多相似之處，想要依此來鑒定犬品種頗有難度。而DNA 分子標記技術(shù)近年來發(fā)展迅速，被廣泛運用于各物種的品種鑒定的研究，相較于傳統(tǒng)鑒定方法其特點在于可以在各個發(fā)育階段、各個組織類別進行鑒定，不受環(huán)境與基因表達與否的影響，分子標記數(shù)量多，遺傳穩(wěn)定，具有較高的多態(tài)性，分布在有機體的整個基因組。同時不同犬品種之間的基因差異性和同一犬品種之間的基因同質(zhì)性，以及犬基因種間差異大于種內(nèi)差異，使得可以通過對犬品種的基因差異性和保守性的研究為犬的品種鑒定工作提供良好的條件，因此可以用DNA 分子標記技術(shù)來進行犬品種鑒定以獲得更加準確的結(jié)果。

一、DNA 分子標記技術(shù)研究進展

DNA 分子標記是指以生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA 的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標記，是基因組特定區(qū)域的一段脫氧核糖核酸序列，這些序列根據(jù)孟德爾遺傳定律，在群體中遺傳生物體的基因特征。DNA 分子標記被用于識別種群內(nèi)部和種群之間的基因變異，以及繪制許多物種的遺傳圖譜，在物種分類中占據(jù)主導地位，經(jīng)過不斷發(fā)展完善，已在各個生物體中大規(guī)模運用于遺傳育種、疾病篩查、品種鑒定、法醫(yī)鑒定等。根據(jù)DNA 檢測方法的不同，主要分為三代：第一代以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，主要有限制性片段長度多態(tài)（RFLP）和數(shù)目可變串聯(lián)重復多態(tài)性（VNTR）；第二代是以PCR 為基礎(chǔ)的分子標記，主要包含隨機擴增多態(tài)性（RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP)、簡單重復序列（SSR)；第三代主要是以高通量測序和DNA 芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，主要包含單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和DNA 條形碼技術(shù)(DNA barcode)，這些DNA 分子標記技術(shù)都各有優(yōu)缺點和適用范圍，目前最常用的分子標記主要是基于PCR 技術(shù)的SSR，以及基于DNA 測序的SNP。根據(jù)各個DNA 分子標記技術(shù)的特點及運用，以下主要介紹SSR 和SNP 在犬品種鑒定中的運用。

二、SSR 和SNP 在犬品種鑒定中運用

（一）SSR 在犬品種鑒定中運用

SSR 即微衛(wèi)星DNA，又稱短串聯(lián)重復序列（STR），廣泛分布于真核生物基因組內(nèi)，突變率高，數(shù)量多，是一類由2～6個堿基組成的多次重復的序列，重復次數(shù)達10～60 次，使得片段長度變化極大，導致SSR 多態(tài)性極其豐富，而SSR 極高的多態(tài)性能夠為犬品種鑒定提供更多的遺傳多樣性信息量，同時在傳遞過程中遵循孟德爾遺傳規(guī)律，并呈共顯性遺傳，還具有靈敏度高、結(jié)果準確、操作簡單等優(yōu)點，所以被廣泛應用到犬品種鑒定、遺傳病篩查、繁殖育種、案件偵破等領(lǐng)域。

目前已有多人利用微衛(wèi)星位點進行犬品種鑒定。Irion 等嘗試利用分布在犬基因組中的100 個常染色體微衛(wèi)星標記來檢測美國養(yǎng)犬俱樂部(AKC)28 個品種內(nèi)和品種間的基因型變異，根據(jù)由此產(chǎn)生的品種特異性等位基因頻率來闡明系統(tǒng)發(fā)育和品種之間的遺傳距離，進行品種鑒定。Koskinen 等研究探討了基于10 個微衛(wèi)星位點的聚類方法在鑒定5 個品種包括貝德林頓、德國牧羊犬、金毛尋回犬、威爾士柯基犬、臘腸犬共250 頭家犬個體起源品種中的有效性，該研究表明，基于微衛(wèi)星DNA 和現(xiàn)代聚類方法可以以非常高的準確率確定犬的品種。Parker 等通過對代表85 個品種的414 頭純種犬的96 個微衛(wèi)星位點進行了基因分型，研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星基因型可以被用來正確地分配99%的犬的品種，同時結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析能將幾個具有古代起源的品種與其他具有現(xiàn)代歐洲起源的品種區(qū)分開來。薛政通過利用已公布的65 個微衛(wèi)星位點采用位點頻率法、貝葉斯法和遺傳距離法對39 個市場上常見寵物犬品種進行鑒定，貝葉斯方法的準確率最高，達到 97.91%，同時還計算出當檢測位點從1個增加到25 個時，品種鑒定準確率迅速上升，之后增加檢測位點，準確率基本穩(wěn)定，隨后采樣本地12 個品種共15 頭犬來進行驗證，品種全部鑒定成功。韓宏曉等通過利用犬基因組數(shù)據(jù)庫中的微衛(wèi)星位點信息從中篩選出60 多個位點采用貝葉斯法、位點頻率法和遺傳距離法等方法對26 種常見寵物犬品種共128 頭個體進行品種鑒定，發(fā)現(xiàn)篩選出的微衛(wèi)星遺傳位點可用于犬的品種鑒定，并通過后期從寵物醫(yī)院選取的10 個品種合計50 頭犬進行驗證，結(jié)果顯示所篩選得到的微衛(wèi)星遺傳標記位點可初步用于常見寵物犬種的鑒定。

（二）SNP 在犬品種鑒定中運用

SNP 主要是指基因組DNA 序列上單個堿基的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，包括單堿基轉(zhuǎn)換、顛換、插入和缺失等多種形式，廣泛分布于整個基因組，具有數(shù)量多，多態(tài)性高，突變率低，遺傳穩(wěn)定，易于實現(xiàn)高通量自動化檢測的優(yōu)點，尤其是隨著下一代測序技術(shù)的不斷優(yōu)化，SNP 正變得越來越容易開發(fā)，成本也越來越低，因此SNP 作為分子標記已經(jīng)有了應用于犬的品種鑒定中的基礎(chǔ)。

Brouillette 等于2002 年在比格犬、杜賓犬和蘇格蘭約四十余頭犬中對四種SNP 進行基因分型，并與哈代溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡下的預期基因型頻率進行比較，結(jié)果表明SNP 位點可以在犬中用來作為品種鑒定的分子標記。Lindblad 等在2005 年通過鳥槍法測序，從11個犬種與參考序列的部分序列比較獲得了250 萬個SNP 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)拳師犬的品種內(nèi)SNP 差異性遠小于與其他犬品種的差異性，表明了SNP 具有作為犬品種鑒定的分子標記的基礎(chǔ)。劉毓文等在2017 年基于犬類22 萬個DNA SNP 標記信息，開發(fā)了一種遺傳算法，用以通過犬類 DNA SNP 數(shù)據(jù)來判斷犬的品系組成，并通過實驗驗證，準確鑒定出來了犬的品種。羅晗等在通過篩選已公開的SNP 數(shù)據(jù)，開發(fā)一款專門為家犬品種分類制作的、低成本的、高效的SNP 芯片，只需要約1 萬或者5 萬個SNP 位點即可達成97%及最高可達99%以上正確率。

三、展望

犬一直不斷地深入到人類的生活中，是人類生活中不可或缺的一分子，這就要求加強對犬的管理。通過DNA分子標記技術(shù)，我們可以從犬的分子水平對犬進行品種鑒定、繁殖育種、法醫(yī)鑒定等，讓犬更好地為人類服務。而SSR 和SNP 是目前最常用也是最有發(fā)展?jié)摿Φ腄NA 分子標記，其開發(fā)檢測技術(shù)仍要朝著高效、便捷和低廉的方向發(fā)展，以期將來為犬的品種鑒定工作發(fā)揮更大的作用。