基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的土沉香遺傳多樣性分析

于 彤，申文輝，覃日亮，韋文龍，李俊曉，譚長(zhǎng)強(qiáng)，滕維超，曹艷云，郝海坤

（1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧 530002；2.廣西大學(xué)，廣西南寧 530004；3.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530002；4.柳江區(qū)沖馬嶺林場(chǎng)，廣西柳州 545100；5.浦北縣綠化工作站，廣西浦北 535300；6.齊齊哈爾大學(xué)，黑龍江齊齊哈爾 161000）

土沉香（Aquilariasinensis）是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬多年生常綠喬木，又名牙香樹、沉香和白木香，是我國(guó)特有的珍貴樹種，分布于我國(guó)廣東、海南、廣西和福建等地[1]。土沉香以含樹脂的心材入藥，具有較好的醫(yī)療價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益[2]。由于無(wú)節(jié)制地砍伐，野生土沉香資源受到嚴(yán)重破壞，現(xiàn)已被列為國(guó)家珍稀瀕危三級(jí)保護(hù)植物及國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[3]。

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展為物種的遺傳變異、親緣關(guān)系及種質(zhì)資源多樣性等研究提供支持。簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）是一種基于簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple Sequence Repeat，SSR）特征開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)，其特點(diǎn)在于能高效地?cái)U(kuò)增簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間，產(chǎn)生高度多態(tài)性，具有很好的穩(wěn)定性和操作簡(jiǎn)便性。目前該技術(shù)在植物的品種鑒定[4]、遺傳作圖[5]和遺傳多樣性[6]等研究中得到了廣泛應(yīng)用。

土沉香的研究主要集中在組織培養(yǎng)[7-8]和植物生理[9]等方面，對(duì)土沉香種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究較少。本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，分析廣西3個(gè)居群、云南1個(gè)居群和海南9個(gè)居群共13個(gè)居群147 個(gè)土沉香家系的遺傳分化，探討居群間的親緣關(guān)系及家系間的遺傳差異，為我國(guó)野生土沉香資源的保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年6月，在廣西、海南和云南選取樹齡10～20年、生長(zhǎng)健壯且具有代表性的土沉香單株；2017年7月，在廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院苗圃（108°35′E，22°92′N）內(nèi)嫁接。試驗(yàn)材料包括來(lái)自廣西馬山（MS）、浦北（PB）和北流（BL）3 個(gè)居群的40個(gè)家系，海南儋州（DZ）、瓊中（QZ）、瓊海（QH）、萬(wàn)寧（WN）、屯昌（TC）、澄邁（CM）、海口（HK）、樂東（LD）和陵水（LS）9個(gè)居群的92個(gè)家系及云南（YN）1個(gè)居群的15個(gè)家系，共147個(gè)家系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè)

采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[10]提取土沉香的基因組DNA；采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳（電壓120 V，電泳45 min，在GelDoc XR+ 凝膠成像儀上成像），檢測(cè)DNA 樣品質(zhì)量；采用紫外分光光度計(jì)（UV1800PC，上海精若科學(xué)儀器有限公司）檢測(cè)DNA 質(zhì)量濃度；取A260/A280值大于1.8 的DNA樣品稀釋至40 mg/L，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物篩選、ISSR-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

參考加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100 條ISSR引物序列設(shè)計(jì)[11]，該100 條引物均由上海生工生物工程有限公司合成。每個(gè)居群隨機(jī)選取3個(gè)家系的DNA 樣品進(jìn)行引物篩選，最終篩選出條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系為20 μL，含有40 mg/L 的DNA 樣品1.5 μL、20 μmol/L的引物1.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L 的Mg2+2 μL、2.5 mmol/L 的dNTPs 1.25 μL、5 U/μL 的Taq 酶0.25 μL 和8.5 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra TProfessional PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃結(jié)束反應(yīng)保存。PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓130 V，電泳50 min）。電泳后，在Gel-Doc XR + 凝膠成像儀上拍照保存結(jié)果。每條引物均重復(fù)擴(kuò)增和電泳3 次，選取清晰并穩(wěn)定的條帶作為最終結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Gel-pro 32 軟件與人工相結(jié)合的方法讀取條帶，根據(jù)條帶有無(wú)的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，“有”條帶賦值為1，“無(wú)”條帶賦值為0，得到并導(dǎo)出0、1 矩陣[12]。采用POPGEN 32 軟件對(duì)遺傳數(shù)據(jù)進(jìn)行多樣性統(tǒng)計(jì)，計(jì)算遺傳特征值，即有效等位基因數(shù)（Ne）、等位基因數(shù)（Na）、多態(tài)性位點(diǎn)百分率（Percentage of Polymorphic Loci，PPL）、居群總基因多樣性（Ht）、居群內(nèi)基因多樣性（Hs）、Nei's 遺傳距離（D）、Nei's 基因多樣性指數(shù)（H）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、遺傳分化系數(shù)（Gst）和基因流（Nm）等。采用NTSYS 2.10E 軟件構(gòu)建13 個(gè)土沉香居群的UPGMA 系統(tǒng)樹狀圖，采用SPSS 軟件中的Mantel檢驗(yàn)分析地理距離與遺傳距離的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

從100 條ISSR 引物序列篩選出條帶重復(fù)性好、穩(wěn)定且清晰的34 條引物用于土沉香147 個(gè)家系的ISSR-PCR 擴(kuò)增。34條ISSR引物共獲得擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)291 個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)230 個(gè)，平均PPL 為78.97%（表1）。平均每條引物擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為8.56個(gè)，平均每條引物多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為6.76 個(gè)。PPL 達(dá)100%的引物有7條，分別為引物807、823、835、844、848、880和884。引物886擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)最多（19個(gè)）。

表1 34條ISSR引物在土沉香147個(gè)家系中的多態(tài)性檢測(cè)Tab.1 Polymorphism test of 34 ISSR primers in 147 families of A.sinensis

2.2 遺傳多樣性分析

13個(gè)土沉香居群的Na為1.430 4～1.734 8，居群水平均值為1.591 6，家系水平均值為1.982 6；Ne為1.309 2～1.470 2，居群水平均值為1.399 1，家系水平均值為1.518 3；H為0.171 9～0.270 6，居群水平均值為0.226 1，家系水平均值為0.310 4；I為0.250 5～0.400 4，居群水平均值為0.332 0，家系水平均值為0.472 8（表2）。各指數(shù)最高值均出現(xiàn)在廣西馬山居群，最低值均出現(xiàn)在海南陵水居群。

表2 13個(gè)土沉香居群遺傳多樣性指數(shù)Tab.2 Genetic diversity indices of 13 populations of A.sinensis

13個(gè)土沉香居群的PPL為43.04%～73.48%，居群水平均值為59.09%；多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為99～169，居群水平均值為136.08；PPL 表現(xiàn)為廣西馬山＞海南瓊中＞廣西北流＞海南瓊海＞海南萬(wàn)寧＞云南＞海南澄邁＞海南儋州＞廣西浦北＞海南海口＞海南屯昌＞海南樂東＞海南陵水。

2.3 遺傳分化分析

13 個(gè)土沉香群居的Ht、Hs、Gst和Nm均值分別為0.307 6、0.226 1、0.265 0和1.387 1（表3）。

表3 13 個(gè)土沉香居群遺傳分化分析Tab.3 Genetic differentiation analysis on 13 populations of A.sinensis

2.4 13個(gè)土沉香居群的遺傳距離和聚類分析

13個(gè)土沉香居群的遺傳距離為0.050 2～0.172 8，其中海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳距離最小，海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳距離最大；13個(gè)土沉香居群的遺傳一致度為0.841 3～0.951 0，其中海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳一致度最小，海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳一致度最大（表4）。

表4 13 個(gè)土沉香居群的遺傳距離（D）與遺傳一致度（I）Tab.4 Genetic distances(D)and genetic consistencies(I)of 13 populations of A.sinensis

以遺傳距離0.9 為閾值，13 個(gè)土沉香居群可被劃分為3類，第一類為廣西馬山、廣西浦北和云南居群；第二類為廣西北流、海南儋州、海南瓊中、海南瓊海和海南萬(wàn)寧居群；第三類為海南屯昌、海南澄邁、海南?？凇⒑Ｄ蠘窎|和海南陵水居群（圖1）。

圖1 基于Nei's遺傳距離的13個(gè)土沉香居群UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA clustering diagram of 13 populations of A.sinensis based on Nei's genetic distance

2.5 13 個(gè)土沉香居群遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析

13 個(gè)土沉香居群間的遺傳距離與地理距離不相關(guān)（圖2）。Pearson 為0.031，表示遺傳距離與地理距離的解釋率為3.1%，說(shuō)明土沉香的遺傳多樣性不可以用地理距離解釋。

圖2 13個(gè)土沉香居群遺傳距離與地理距離相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of correlations among genetic distances and geographical distances of 13 populations of A.sinensis

3 討論與結(jié)論

本研究首次采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)13 個(gè)土沉香居群147個(gè)家系的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，篩選得到34 條ISSR 引物，共獲得擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)291 個(gè)，其中多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)230 個(gè)，PPL 均值為78.97%，表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。H居群水平均值為0.226 1，家系水平均值為0.310 4；I居群水平均值為0.332 0，家系水平均值為0.472 8。說(shuō)明土沉香居群具有較高的遺傳多樣性，與黃久香等[13]研究土沉香遺傳多樣性的結(jié)論較一致。廣西馬山的土沉香居群遺傳多樣性豐富，各指數(shù)值均最高，海南陵水的土沉香居群遺傳多樣性最低。

遺傳分化系數(shù)是用于衡量植物群體間分化程度的重要指標(biāo)，為遺傳分化的研究提供有力的解釋和說(shuō)明[14]。0 ≤Gst≤0.05時(shí)，群體間遺傳分化水平較低；0.05＜Gst≤0.15 時(shí)，群體間遺傳分化水平為中度；0.15＜Gst≤0.25 時(shí)，群體間遺傳分化水平較高；0.25

基因流是指基因在同種植物群體內(nèi)或群體之間的運(yùn)動(dòng)，有助于提高植物群體的遺傳多樣性水平，防止種群分化[16]。當(dāng)Nm＞1 時(shí)，基因流動(dòng)性較強(qiáng)[17]。本研究中，Nm均值為1.387 1，說(shuō)明13 個(gè)土沉香居群間存在較強(qiáng)程度的基因流動(dòng)。

遺傳距離可用來(lái)衡量物種之間或同一物種群體之間遺傳差異（基因組差異）的程度。本研究中，海南屯昌與海南澄邁居群間的遺傳距離最小、遺傳一致度最大，海南樂東與廣西浦北居群間的遺傳距離最大、遺傳一致度最小。13 個(gè)土沉香居群可被劃分為3 類，第一類為廣西馬山、廣西浦北和云南居群；第二類為廣西北流、海南儋州、海南瓊中、海南瓊海和海南萬(wàn)寧居群；第三類為海南屯昌、海南澄邁、海南?？凇⒑Ｄ蠘窎|和海南陵水居群。土沉香居群間的遺傳距離與地理距離不相關(guān)，土沉香的遺傳多樣性不可以用地理距離解釋。這可能是因?yàn)?個(gè)地區(qū)種源的土沉香是由1 個(gè)原生種源擴(kuò)張，由于擴(kuò)張到采樣點(diǎn)的時(shí)間較短，繁殖代數(shù)較少，還未形成地理距離差異。

植物種源的親緣關(guān)系對(duì)于種群的遺傳多樣性保護(hù)具有重要意義。本研究中，基于34 條ISSR 引物對(duì)13 個(gè)土沉香居群147 個(gè)家系進(jìn)行分子層面分析，發(fā)現(xiàn)13 個(gè)土沉香居群147 個(gè)家系具有較高的遺傳多樣性和極高的遺傳分化水平，可為土沉香種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)與利用和優(yōu)種栽培等領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：于彤負(fù)責(zé)研究計(jì)劃制定、數(shù)據(jù)收集與分析和論文撰寫與修改；申文輝負(fù)責(zé)研究計(jì)劃制定；覃日亮、韋文龍負(fù)責(zé)試驗(yàn)調(diào)查；李俊曉負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集與分析；譚長(zhǎng)強(qiáng)負(fù)責(zé)研究計(jì)劃制定、數(shù)據(jù)收集與分析和論文修改；滕維超負(fù)責(zé)論文撰寫；曹艷云、郝海坤負(fù)責(zé)文獻(xiàn)檢索。