基于核酸適配體-磁珠的豬血IgG提取方法研究①

郭 嬡,王倩鈺,凡思華,王文強(qiáng),黃柳燕,張 強(qiáng),王景濤

(1. 佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007;2.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,廣東 茂名 525000)

我國(guó)每年出欄和屠宰豬的數(shù)量巨大。據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局公布,2022年全國(guó)生豬出欄量約69995萬(wàn)頭,屠宰量約為28538萬(wàn)頭。根據(jù)實(shí)際情況,每頭豬可生產(chǎn)約2.2公斤豬血,那么2022年中國(guó)豬血產(chǎn)量達(dá)到了62785噸[1]。目前我國(guó)豬血開(kāi)發(fā)產(chǎn)品還比較單一。長(zhǎng)期以來(lái),由于人們對(duì)動(dòng)物血液產(chǎn)品的特殊保健作用缺乏了解,血液產(chǎn)品加工技術(shù)落后,一般僅采用最原始熱處理被加工成血粉,不僅破壞了一些蛋白質(zhì)的功能特性,還導(dǎo)致產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量低、利用率低,而且極不衛(wèi)生[2]。

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是僅次于白蛋白的血液中第二豐富的蛋白質(zhì)。根據(jù)Ig理化性質(zhì)尤其是免疫學(xué)性質(zhì),可分為五類,即IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在血漿蛋白中含量最高的Ig類型是IgG,約占總Ig的75%[3]。IgG補(bǔ)充劑具有提高免疫力,預(yù)防感冒和腹瀉的功效;對(duì)于嬰幼兒及青少年還可以促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育,預(yù)防齲齒;對(duì)于體弱者和病人還能夠促進(jìn)身體恢復(fù),預(yù)防繼發(fā)疾病發(fā)生[4]。

目前,有關(guān)IgG提取和純化方法中,冷乙醇沉淀是最常采用的方法。該方法使用不同濃度的乙醇,在低溫下進(jìn)行多步離心,達(dá)到初步提取IgG的目的。與傳統(tǒng)的柱色譜法相比,冷乙醇沉淀法具有易于放大和操作相對(duì)簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。然而,此方法也有一些不可忽視的缺點(diǎn)。例如,多步離心分級(jí)十分耗時(shí),且易導(dǎo)致IgG損失,使用有機(jī)溶劑不僅影響IgG活性還會(huì)引起環(huán)境凈化問(wèn)題[5]。此外,現(xiàn)有的IgG提取方法如鹽析法、辛酸沉淀法、層析法、低溫乙醇法等[6, 7],均不同程度地存在回收率低、純度低、成本高以及環(huán)境污染等不足[8]。隨著人們對(duì)IgG功能的認(rèn)識(shí)不斷深化,市場(chǎng)對(duì)IgG相關(guān)產(chǎn)品的需求不斷增長(zhǎng),對(duì)其質(zhì)量的要求也越來(lái)越高。因此,研究和開(kāi)發(fā)一種新型高效的IgG提取方法勢(shì)在必行。

核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù),從合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫(kù)中,反復(fù)篩選得到的能與靶分子特異結(jié)合的一段寡核苷酸序列[9]。將核酸適配體應(yīng)用于IgG提取具有突出的應(yīng)用優(yōu)勢(shì),如易合成、純度高、特異性結(jié)合IgG、穩(wěn)定好、易修飾標(biāo)記等[10, 11]?；谝陨虾怂徇m配體的自身特性,結(jié)合磁珠在分離提取中具有的快速簡(jiǎn)便優(yōu)勢(shì),本研究開(kāi)展了豬血IgG核酸適配體-磁珠提取方法探索,以期為我國(guó)豬血資源化利用以及醫(yī)藥衛(wèi)生產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TGL-20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海盧相依實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司);101-3AB電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);THZ-92B氣浴恒溫振蕩器(常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司);JP-O7O5超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司);SC083276分析型超純飲水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司);AE223電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);WIX-EP300迷你垂直電泳儀(韋克斯科技有限公司);DR-3000酶標(biāo)分析儀(無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司);PHS-3C酸度計(jì)(杭州奧立龍儀器有限公司);HJ-2A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器(常州亞特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);磁力架(廣州齊云生物科技有限公司);四維旋轉(zhuǎn)混合儀(北京中科科儀股份有限公司)。

羧基化磁珠(粒徑為100-200 nm,濃度為10 mg/mL,江蘇先豐納米材料科技有限公司);末端氨基修飾的IgG核酸適配體(序列為5’-TAATACGACTCACTATAGCAATGGTACGGTACTTCCCCACTCA-C6-NH2,由生工生物工程上海股份有限公司合成);豬IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海烜雅生物科技有限公司);透析袋、檸檬酸三鈉、氯化鈉、氯化鈣、EDTA、碳酸氫鈉、Tween-20、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、MES緩沖液(0.2 mol/L,pH6.0)均為分析純,均由上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司提供。

新鮮豬血取自茂名市茂南區(qū)高山食品公司城東屠宰場(chǎng),按照9:1的比例加入了3.8% 的檸檬酸三鈉溶液作為抗凝劑。在4 ℃條件下,3000 r/min離心30min分離血細(xì)胞和血漿。將分裝于離心管中,于-20 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 磁珠與核酸適配體偶聯(lián)

取100μL羧基磁珠懸浮液于5mL離心管中,加入2mL的MES緩沖液,輕微振搖3min清洗磁珠,然后磁分離,如此重復(fù)清洗3次。然后依次加入2mL的EDC(5mg/mL,MES溶解)和NHS(5mg/mL,MES溶解)溶液,混合均勻,室溫下振搖30min,然后磁分離,此時(shí)磁珠表面的羧基已經(jīng)活化?；罨聂然胖榉謩e與末端氨基修飾IgG核酸適配核酸適配體進(jìn)行偶聯(lián)。用2mL的MES溶液將活化后的羧基磁珠洗滌兩次,加入10μL的末端氨基修飾的核酸適配體(100μmol/L),室溫振搖孵化1h,孵化結(jié)束后用2mL的PBST(0.01mol/L,1% Tween-20)緩沖液清洗3次。最后將洗滌后的磁珠-末端氨基修飾核酸適配體重懸于100μL的PBST儲(chǔ)備液中,4 ℃保存,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 IgG提取條件優(yōu)化

取血漿10mL,按血漿/磁珠體積比150:1、125:1、100:1、75:1、50:1加入磁珠,4℃條件下置于四維旋轉(zhuǎn)混合儀上孵育,時(shí)間為0.5、1.0、2.0、4.0、6h。孵育結(jié)束后,至于磁力架分離磁珠,采用不同濃度NaCl(1.0、1.5、2.0、2.5mol/L)的PBS洗脫液洗脫IgG,獲得IgG提取物。

1.2.3 透析

將透析袋剪成合適的小段,放在2%的碳酸氫鈉和1mol/L的EDTA(pH=8)中將透析袋煮沸10min,然后用蒸餾水徹底清洗透析袋。再將清洗后的透析袋放在1mol/L的EDTA(pH=8)中煮沸10min,冷卻后,將透析袋浸沒(méi)在30%的乙醇中,每次使用透析袋之前,用蒸餾水將其清洗干凈即可。用EP管和透析袋自制一個(gè)小型的透析管,將凝血酶原、IgG和SOD溶液轉(zhuǎn)移到透析管中,在4℃條件下對(duì)蒸餾水進(jìn)行透析,期間更換3～4次透析液,用1% AgNO3檢驗(yàn),直至Cl-離子透析完為止。得到干凈的凝血酶原、免疫球蛋白和SOD溶液。凝血酶原溶液需要激活,IgG和SOD溶液可直接進(jìn)行相應(yīng)的檢測(cè)。

1.2.4 IgG含量測(cè)定

采用豬IgG酶聯(lián)免疫分析試劑盒,按照廠家說(shuō)明書(shū)操作方法,測(cè)定提取IgG的含量及收率,收率計(jì)算公式如下:

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 IgG提取單因素分析

2.1.1 血漿與核酸適配體-磁珠混合的體積比

通過(guò)ELISA測(cè)定分析,血漿與核酸適配體-磁珠混合的體積比對(duì)IgG提取效果具有較大影響。核酸適配體-磁珠在血漿中占比增加時(shí),IgG提取量持續(xù)增加,當(dāng)血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時(shí),IgG提取量達(dá)到最大。但是,繼續(xù)加大核酸適配體-磁珠占比,反而使IgG提取量降低。SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了與ELISA分析一致的結(jié)果,如圖1A。血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時(shí),IgG提取蛋白條帶相對(duì)最為明顯。提取蛋白與IgG標(biāo)準(zhǔn)品輕鏈(相對(duì)分子質(zhì)量約20 Kd)和重鏈(相對(duì)分子質(zhì)量約45 Kd)相一致,如圖1B。

A: ELISA分析結(jié)果;B:SDS-PAGE分析結(jié)果。M:蛋白marker;1:IgG標(biāo)準(zhǔn)品;2-6:分別對(duì)應(yīng)血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比為150:1、125:1、100:1、75:1、50:1。

2.1.2 血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間

ELISA測(cè)定結(jié)果顯示,在血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1情況下,血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間對(duì)IgG提取量具有影響,當(dāng)孵育時(shí)間在0.5～2.0h之間時(shí),IgG提取量隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而增加,繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間不會(huì)增加IgG提取量,表明孵育2.0h可使核酸適配體-磁珠結(jié)合IgG達(dá)到飽和狀態(tài),如圖2A。SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了與ELISA分析一致的結(jié)果。與孵育0.5h和1.0h

A: ELISA分析結(jié)果;B:SDS-PAGE分析結(jié)果。M:蛋白marker;1:IgG標(biāo)準(zhǔn)品;2～6:分別對(duì)應(yīng)血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間為0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h。

相比,血漿與核酸適配體-磁珠孵育2.0h時(shí),IgG蛋白條帶更為明顯,但孵育4.0h和6.0h,IgG蛋白條帶沒(méi)有加深趨勢(shì),如圖2B。

2.1.3 洗脫液NaCl濃度

ELISA測(cè)定結(jié)果顯示,在血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1,時(shí)間為2.0h情況下,洗脫液(PBS)NaCl濃度對(duì)IgG提取量具有影響,當(dāng)洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時(shí),核酸適配體-磁珠上的IgG洗脫最為充分,繼續(xù)加大NaCl濃度對(duì)不會(huì)增加IgG提取量,反而產(chǎn)生不利影響,如圖3A。SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了與ELISA分析一致的結(jié)果。與其他NaCl濃度相比,洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時(shí),IgG蛋白條帶更為明顯,如圖3B。

A: ELISA分析結(jié)果;B:SDS-PAGE分析結(jié)果。M:蛋白marker;1:IgG標(biāo)準(zhǔn)品;2～6:分別對(duì)應(yīng)洗脫液NaCl濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L。

2.2 IgG提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì) L9(34)型正交試驗(yàn),研究血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比、孵育時(shí)間、洗脫液NaCl濃度共同作用下,IgG提取的最優(yōu)條件,見(jiàn)表1。

表1 IgG提取試驗(yàn)因素水平表

影響豬血IgG含量因素的主次順序?yàn)?C>A>B,即血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間對(duì)IgG含量影響最顯著,其次是混合體積比。最優(yōu)組合為A2B2C3,即以豬血為原料提取IgG的最優(yōu)條件為:反應(yīng)體積比為100:1,孵育時(shí)間2.0h,洗脫液NaCl濃度1.5mol/L。此結(jié)果與單因素分析結(jié)果高度一致。在此最優(yōu)條件下,IgG收率為91%,見(jiàn)表2。

表2 IgG提取正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

核酸適配體-磁珠在血漿中的占比,一方面影響到IgG的提取效率,另一方面也決定了提取成本,因此這一提取因素十分重要。本研究相關(guān)結(jié)果表明,當(dāng)血漿與核酸適配體-磁珠體積比為100:1時(shí),IgG提取量達(dá)到最大。核酸適配體-磁珠在血漿中占比低時(shí),血漿中IgG過(guò)量,核酸適配體-磁珠不能充分結(jié)合IgG,導(dǎo)致提取率較低。但是,如果核酸適配體-磁珠在血漿中占比過(guò)高時(shí),血漿IgG分配到核酸適配體-磁珠上的比例將會(huì)下降,在后續(xù)洗脫過(guò)程中,由于洗脫率不可能達(dá)到100%,因此導(dǎo)致IgG提取效率降低。血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間決定了提取方法快速性,同時(shí)對(duì)保證IgG的生物活性起到至關(guān)重要的作用。本研究相關(guān)結(jié)果表明,當(dāng)孵育時(shí)間在2.0h時(shí),IgG提取效率達(dá)到最佳,繼續(xù)延長(zhǎng)孵育時(shí)間不會(huì)增加IgG提取量,原因是核酸適配體-磁珠與IgG結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)時(shí),提取率將不會(huì)增加。核酸適配體與IgG以非共價(jià)方式結(jié)合,NaCl濃度洗脫液決定了洗脫液的離子強(qiáng)度,在高離子強(qiáng)度下,IgG將與核酸適配體-磁珠分離。本研究相關(guān)結(jié)果表明,當(dāng)洗脫液中NaCl濃度為1.5mol/L時(shí),核酸適配體-磁珠上的IgG洗脫最為充分,繼續(xù)加大NaCl濃度對(duì)不會(huì)增加IgG提取量,反而產(chǎn)生不利影響,其原因主要是在IgG已經(jīng)充分解離的情況下,進(jìn)一步加大洗脫液中的離子強(qiáng)度可能導(dǎo)致IgG分子中Fc片段結(jié)構(gòu)改變或破壞,而ELISA檢測(cè)主要識(shí)別的是IgG分子中的Fc片段,導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果顯著下降。正交分析結(jié)果表明,在血漿與核酸適配體-磁珠混合體積比、孵育時(shí)間、洗脫液NaCl濃度共同作用下,影響豬血IgG含量因素的主次順序?yàn)?血漿與核酸適配體-磁珠孵育時(shí)間>混合體積比>洗脫液NaCl濃度,IgG的最優(yōu)提取條件為:反應(yīng)體積比為100:1,孵育時(shí)間2.0h,洗脫液NaCl濃度1.5mol/L。此結(jié)果與單因素分析結(jié)果高度一致,表明單因素分析的結(jié)果比較可靠。

綜上所述,本研究建立了基于核酸適配體-磁珠的豬血IgG提取方法,該方法具有快速、收率高、條件溫和、不使用有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn),在豬血資源化利用以及醫(yī)藥衛(wèi)生產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。