萊菔硫烷對糖尿病視網(wǎng)膜病變Nrf2通路和NLRP3炎性小體的影響①

王櫻鑾,宿星杰,張 劍,齊艷秀

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,慢性炎癥是DR的病理學(xué)基礎(chǔ),研究[1]顯示,在糖尿病動物的視網(wǎng)膜和玻璃體中,均檢測到炎癥相關(guān)因子如白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)等異常增加。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)棫樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)通過介導(dǎo)caspase-1催化激活,裂解和釋放IL-1β和IL-18誘導(dǎo)炎癥,高糖狀態(tài)下ROS表達(dá)增加,激活caspase-1及NLRP3炎性小體,進(jìn)而使IL-1β活化[2]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是在氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)組織損傷中具有重要作用的氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子,是維持細(xì)胞氧化還原平衡的重要因子,Nrf2敲除的糖尿病鼠ROS顯著增加,谷胱甘肽(glutathione,GSH)顯著減少,早發(fā)血-視網(wǎng)膜屏障功能障礙,視覺障礙加重[3]。萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)是可使用的異硫氰酸鹽,在缺血再灌注動物模型的研究顯示,SFN可快速上調(diào)Nrf及受其調(diào)控的抗氧化基因酶表達(dá),但SFN是否可通過Nrf/NLRP3/IL-1β途徑調(diào)控DR的進(jìn)程目前較少見報(bào)道[4]。本研究觀察SFN對糖尿病大鼠Nrf/NLRP3/IL-1β通路的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性健康SD大鼠72只,體質(zhì)量200～250g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物合格證號:SCXK-京-2019-0087,動物在標(biāo)準(zhǔn)條件下置于塑料籠中飼養(yǎng),光/暗循環(huán)12h,溫度21℃,濕度控制在55%,自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑

高脂飼料購于上海睿安生物科技有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;SFN購于上海瀚香生物科技有限公司;羥苯磺酸鈣購于江蘇萬高藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20080288,規(guī)格:0.25g;HE染色試劑盒購于北京酷來搏科技有限公司;IL-1β、IL-18酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒購于北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購于碧云天;Tirzol購于上海源葉生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國GeneCopoeia;Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)、硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)一抗購于Abcam中國。

1.3 動物分組和干預(yù)

隨機(jī)抽取12只SD大鼠作為空白對照組(blank control group, BC組),剩余60只SD大鼠用于動物造模。造模組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)2周后腹腔注射35mg·kg-1的STZ,3d后,禁食不禁水12h檢測空腹血糖(FPG)>11.1mmol/L即為造模成功。共52組造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(model group,M組)、陽性對照組(positive contorl group, PC組)、SFN低劑量組(SFN low dose group, SLD組)和SFN高劑量組(SFN high dose group,SHD組),每組13只。SLD組給予SFN 25mg/kg腹腔注射,SHD組給予SFN 50mg/kg腹腔注射,PC組給予羥苯磺酸鈣溶液1.0/kg腹腔灌注,BC組和M組給予等量生理鹽水腹腔注射。連續(xù)治療6周。

1.4 HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)表現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,分離得到大鼠視網(wǎng)膜,部分視網(wǎng)膜固定于4%多聚甲醛中,HE染色后鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài) 。

1.5 檢測大鼠視網(wǎng)膜組織炎性因子和氧化還原指標(biāo)水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取部分視網(wǎng)膜組織,制作組織勻漿,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組大鼠IL-1β、TNF-α水平,采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平,采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。

1.6 采用qRT-PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜中Nrf2-2、HO-1mRNA水平表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠視網(wǎng)膜組織,機(jī)械勻漿后,用Trizol提取總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,采用CFX96 real-time PCR Detetion System對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃30s,95℃5s,60℃30s,共39個循環(huán),以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法對Nrf-2、HO-1mRNA檢測結(jié)果進(jìn)行定量分析。引物序列:Nrf2:上游:5’-TTTGGGAATGTGGGCAAC-3’,下游:5’-GAGAATTCCTCCCAATTCAGC-3’;HO-1:上游:5’-AGCGAAACAAGCAGAACCCA-3’,下游:5’-GCCACCAGCAGCTCAGGATG-3’。

1.7 采用Wester blot法檢測蛋白表達(dá)水平

取部分視網(wǎng)膜組織,加入裂解液提取總蛋白,進(jìn)行蛋白濃度檢測后,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,洗滌3次,加脫脂牛奶封閉1h,加入Nrf2(1:1000)、HO-1(1:1000)、NLRP3(1:1000)、ASC(1:1000)、caspase-1(1:1000)、TXNIP(1:1000)一抗,室溫孵育過夜,次日采用TBST洗滌3次后加入相應(yīng)的二抗,室溫下孵育1h,應(yīng)用TBST進(jìn)行3次洗膜,ECL發(fā)光進(jìn)行顯影并采集圖像,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)表現(xiàn)

光鏡檢查結(jié)果顯示,BC組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯病理改變;M組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞排列疏松,內(nèi)外核層拋離紊亂,細(xì)胞水腫明顯;PC組、SLD和SHD組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較M組清晰,細(xì)胞水腫明顯減少;SHD組改善較PC組和SLD組更為明顯,見圖1。

圖1 HE染色觀察視網(wǎng)膜組織形態(tài)表現(xiàn)(×200,A:BC組,B:M組,C:PC組,D:SLD組,E:SHD組)

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)相比較

M組MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著高于BC組(P<0.05),SOD水平低于BC組(P<0.05);PC組和SLD組MDA、IL-1β、TNF-α水平低于M組(P<0.05),SOD水平高于M組(P<0.05);SHD組MDA、IL-1β、TNF-α水平低于M組、PC組和SLD組(P<0.05),SOD水平高于M組、PC組和SLD組(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜炎癥因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)相比較

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)水平相比較

M組Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)水平低于BC組(P<0.05),PC組和SLD組Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)水平高于M組(P<0.05),SHD組Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)水平高于PC組和SLD組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)水平相比較

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)水平相比較

M組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1水平低于BC組(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平高于BC組(P<0.05);PC組和SLD組Nrf2、HO-1水平高于M組,NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平低于M組(P<0.05);SHD組Nrf2、HO-1水平高于PC組和SLD組(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平低于PC組和SLD組(P<0.05),見表3和圖2。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)水平相比較

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3 討論

隨著糖尿病人群的增加和人均預(yù)期壽命的延長,糖尿病并發(fā)癥發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)逐年增加[1]。預(yù)計(jì)到2030年,全球糖尿病患者總數(shù)將從2000年的1.71億增加到3.66億,成為全球健康的主要威脅之一。是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,初級階段患者可無明顯癥狀,一旦視覺出現(xiàn)問題,其進(jìn)程幾乎不可逆轉(zhuǎn),是導(dǎo)致失明的常見原因[2]。研究[3]顯示,中國糖尿病人群DR患病率達(dá)43%,其中6.3%的患者視力受到威脅,增殖性DR對視力危害尤其嚴(yán)重,5年內(nèi)未經(jīng)正規(guī)治療的DR患者約一半發(fā)展為永久視力喪失。幾乎所有的1型糖尿病和超過60%的2型糖尿病在20年后均會發(fā)生不同程度的DR,其中發(fā)生增殖改變者約為18%,致盲者占20%,近年來隨著糖尿病患者的數(shù)量激增,DR發(fā)病率快速增長[8]。本研究中組織學(xué)結(jié)果顯示SFN對DR具有保護(hù)作用。

為進(jìn)一步探討SFN的保護(hù)作用機(jī)制,本研究首先關(guān)注了SFN對炎性通路的影響。DR的特點(diǎn)主要是視網(wǎng)膜微血管進(jìn)行性損害、血管通透性增加、新生血管形成,其病理改變涉及到代謝酶、炎癥、信號傳導(dǎo)等多種機(jī)制變化,多數(shù)學(xué)者就炎癥反應(yīng)是糖尿病視網(wǎng)膜病變的重要過程達(dá)成共識[9]。本研究結(jié)果顯示,M組大鼠視網(wǎng)膜中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等NLRP3/IL-1β因子表達(dá)均顯著升高,組織學(xué)檢查顯示視網(wǎng)膜破壞嚴(yán)重,結(jié)果提示,高糖誘導(dǎo)NLRP3/IL-1β通路表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變。相關(guān)研究結(jié)果提示[10],糖尿病大鼠早期即可檢測到血-視網(wǎng)膜屏障破壞,同時檢測到高表達(dá)的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18,沉默NLRP3表達(dá),可降低IL-1β、IL-18等炎性因子和血管通透性。高糖培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞中同樣觀察到NLRP3炎癥小體相關(guān)成分及細(xì)胞凋亡增加,沉默NLRP3可增強(qiáng)培養(yǎng)細(xì)胞對高糖的耐受性和減少細(xì)胞凋亡[11]。NLRP3和IL-1β在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變組織中表達(dá)顯著升高,且患者玻璃體中IL-1β和IL-18濃度顯著升高[12]。這些研究均提示NLRP3炎癥小體是高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞病變炎癥及反應(yīng)的關(guān)鍵啟動因子,NLRP3炎癥效應(yīng)器是DR炎癥進(jìn)展的重要決定因素。本研究結(jié)果與上述研究一致。

本研究結(jié)果顯示,M組大鼠視網(wǎng)膜MDA和TXNIP表達(dá)水平均顯著高于BC組,SOD水平低于BC組,結(jié)果提示高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激失衡和TXNIP表達(dá)水平升高是導(dǎo)致NLRP3的重要因素。既往研究[13]顯示,高血糖可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生,高血糖誘導(dǎo)的ROS生成是糖尿病微血管病四種經(jīng)典致病途徑中常見的事件。而ROS的產(chǎn)生對NLRP3激活至關(guān)重要,ROS的產(chǎn)生是NLRP3激活的重要條件,幾乎所有NLRP3激動劑都會導(dǎo)致ROS生成增加,通過ROS敏感的TXNIP蛋白激活NLRP3炎癥小體[14]。高糖誘導(dǎo)的ROS可促使TXNIP從硫氧還蛋白解離,改變TXNIP從硫氧還蛋白阻遏物到NRLP3炎性激動劑的功能,敲除TXNIP基因可抑制NLRP3炎癥小體激活,細(xì)胞凋亡[15]。在體外高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS水平升高,TXNIP表達(dá)水平升高,NLRP3炎癥小體被大量激活,抑制ROS生成或沉默TXNIP表達(dá)均可阻止炎癥小體組裝,抑制炎癥因子表達(dá)[16]。其中MDA是脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物,可反映ROS的活性。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示氧化應(yīng)激在DR的病因子發(fā)揮重要因素。

Nrf2是抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,Nrf2信號通路的激活在保護(hù)細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激、羰基化合物和人體中的親電劑方面發(fā)揮重要作用[17]。研究[18]顯示,高糖狀態(tài)下,激活視網(wǎng)膜細(xì)胞Nrf2,可減輕氧化應(yīng)激對視網(wǎng)膜的損害,敲除Nrf2基因可導(dǎo)致抗氧化酶生成減少,炎癥反應(yīng)增強(qiáng)和視網(wǎng)膜破壞增加。因此有學(xué)者[19]建議在DR的早期激活Nrf2是防止氧化應(yīng)激損傷和DR進(jìn)展的關(guān)鍵。HO-1是一種應(yīng)激反應(yīng)酶,在病理?xiàng)l件下維持體內(nèi)平衡[20]。SFN是異硫氰酸鹽類化合物,具有抗氧化、心血管保護(hù)等作用,其本身不具有直接參與抗氧化反應(yīng)的功能,可通過間接途徑激活Nrf2,誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列二相酶和抗氧化酶實(shí)現(xiàn)抗氧化作用[21]。研究[22]顯示,SFN在轉(zhuǎn)錄水平激活Nrf2/HO-1途徑增強(qiáng)人臍靜脈的抗氧化損傷作用。本研究結(jié)果顯示,SFN治療可增加Nrf2后Nrf2、HO-1水平升高,TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18水平降低,且SHD組改變較SLD組更為明顯,結(jié)果提示,SFN可能通過激活Nrf2信號通路,降低氧化應(yīng)激和TXNIP水平,從而降低NLRP3信號通路的激活,從而對DR產(chǎn)生保護(hù)作用。