柴黃清胰活血顆粒對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織細(xì)胞自噬的影響*

蔣亞玲,張雨森,馮 雯,王天剛,陳 輝,向 未,李 翼,王陽(yáng)洋,李 麗

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃科,四川瀘州 646000)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是由多種病因引起胰酶異常活化的化學(xué)性炎癥,是急性胰腺炎中病情最兇險(xiǎn)的一種,其臨床死亡率高達(dá)15%～30%[1]。目前,SAP的發(fā)病機(jī)制主要集中在胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)胰酶的異常激活[2]。研究證實(shí),胰酶異常激活導(dǎo)致細(xì)胞損害與自噬受損有較大關(guān)系[3-4]。而評(píng)價(jià)自噬受損的一個(gè)重要指標(biāo)就是自噬通量,它不僅僅是檢測(cè)自噬小體數(shù)量,還需動(dòng)態(tài)追蹤自噬底物的行程變化,即證實(shí)底物是否到達(dá)溶酶體,并觀察自噬底物降解率的變化,以此綜合評(píng)價(jià)自噬水平的高低[5]。課題組前期研究表明[6-9],柴黃清胰活血顆粒能明顯改善患者臨床癥狀和體征,減輕炎癥反應(yīng),改善腸道微循環(huán),保護(hù)肝肺腎等重要臟器功能,但其具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)擬探討柴黃清胰活血顆粒對(duì)SAP大鼠自噬通量的調(diào)控,從而初步揭示其治療SAP的部分機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只,體重200～230 g,8周齡,許可證號(hào)SCXK(川) 2018-17,購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF級(jí)動(dòng)物房恒溫適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,自由飲食。

1.2 試劑與儀器

柴黃清胰活血顆粒(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,批號(hào)20220416);?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司,貨號(hào)T9034);微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)兔多克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號(hào)DF7421),自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號(hào)AF5128),溶酶體相關(guān)膜蛋白2(LAMP2)抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號(hào)DF6719),SQSTM1/p62 抗體(英國(guó)Abcam公司,貨號(hào)AF5384),胰島素兔多克隆抗體(Insulin Rabbit pAb,武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號(hào)A2090)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司,貨號(hào)AS014);全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司),光學(xué)顯微鏡(福建麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司),激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1造模及分組

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20220120-003)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(SO組)、SAP組和柴黃清胰活血顆粒治療組(CH組),每組16只。造模前大鼠禁食12 h,不禁飲。SAP組和CH組分別在十二指腸逆行胰膽管內(nèi)注入3.5%的?；撬崮懰徕c[10]構(gòu)建SAP大鼠模型。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)柴黃清胰活血顆粒的作用呈劑量依賴性,0.2 g/100 g劑量療效最佳[11]。CH組采用柴黃清胰活血顆粒(0.2 g/100 g,生理鹽水1 mL/0.2 g稀釋)灌胃,SO組和SAP組采用生理鹽水(1 mL/100 g)灌胃。各組均每4小時(shí)灌胃1次,12、24 h分批處死大鼠,死前4 h停止灌胃。除生理鹽水及藥物灌胃外,所有大鼠持續(xù)禁食,但不禁飲。

1.3.2蘇木素-伊紅(HE)染色

胰腺組織用10%多聚甲醛浸泡24 h后,全自動(dòng)脫水儀進(jìn)行脫水,石蠟包埋切片,HE染色,顯微鏡下觀察并拍照,參照文獻(xiàn)[12]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評(píng)價(jià)。

1.3.3Western blot檢測(cè)大鼠胰腺組織細(xì)胞自噬通量相關(guān)蛋白表達(dá)水平

一抗?jié)舛?LC3 (1∶1 000)、Beclin-1 (1∶500)、p62 (1∶1 000)、LAMP2(1∶1 000),以β-actin(1∶1 000)為內(nèi)參,按照Western blot檢測(cè)步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),采用Image J軟件對(duì)Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62(Insoluble、Soluble)、LAMP2和β-actin的表達(dá)條帶進(jìn)行了灰度值檢測(cè),結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的比值表示,統(tǒng)計(jì)并繪制成柱形圖。

1.3.4免疫熒光雙染色法檢測(cè)細(xì)胞自噬情況

采用免疫熒光雙染色法處理胰腺組織,LC3兔多克隆一抗及Insulin兔多克隆一抗稀釋比為1∶500,羊抗兔熒光二抗稀釋比為 1∶900,激光共聚焦顯微鏡下拍照,Imag J軟件分析免疫熒光強(qiáng)度及共定位情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分比較

12、24 h時(shí)SO組胰腺組織病理學(xué)評(píng)分分別為(0.125±0.354) 分、(0.125±0.354)分,SAP組分別為(9.625±1.061)分、(10.250±0.886)分,CH組分別為(8.250±0.707) 分、(7.125±0.835)分。不同時(shí)間點(diǎn)SAP組和CH組病理學(xué)評(píng)分均高于SO組,SAP組高于CH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

2.2 各組大鼠胰腺組織細(xì)胞自噬通量相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

12、24 h時(shí)SO組大鼠胰腺組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、LAMP2、p62(Insoluble)相對(duì)表達(dá)水平均低于SAP組和CH組,p62(Soluble)相對(duì)表達(dá)水平均高于SAP組和CH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。12、24 h時(shí)SAP組大鼠胰腺組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對(duì)表達(dá)水平明顯高于CH組,24 h時(shí)SAP組Beclin-1相對(duì)表達(dá)水平高于CH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAP組12、24 h時(shí)p62(Soluble)相對(duì)表達(dá)水平及12 h時(shí)Beclin-1相對(duì)表達(dá)水平與CH組比較無(wú)差異(P>0.05),見圖2。

2.3 各組大鼠胰腺組織LC3表達(dá)水平及與Insulin共定位情況

12、24 h時(shí)SO組大鼠胰腺組織LC3免疫熒光強(qiáng)度分別為(30.18±4.67)、(49.74±9.44),LC3主要表達(dá)于胰腺腺泡細(xì)胞;SAP組免疫熒光強(qiáng)度分別為(85.90±14.57)、(102.80±18.71),LC3主要分布于胰腺腺泡細(xì)胞,少量分布于胰島細(xì)胞;CH組免疫熒光強(qiáng)度分別為(68.42±12.18)、(74.61±9.23),LC3主要分布于胰腺腺泡細(xì)胞,極少量分布于胰島細(xì)胞。SAP、CH組LC3陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于SO組(P<0.05),CH組明顯低于SAP組(P<0.05),見圖3～6。12、24 h時(shí)SAP組LC3和Insulin在胰島細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域、分泌顆粒區(qū)域中均有分布,SO組、CH組LC3及Insulin未見明顯共定位,見圖7、8。

圖3 各組大鼠胰腺組織免疫熒光雙染圖(100×)

圖4 各組大鼠12 h免疫熒光雙染LC3表達(dá)情況(100×)

圖5 各組大鼠24 h免疫熒光雙染LC3表達(dá)情況(100×)

a:P<0.05。

圖7 各組大鼠胰島細(xì)胞團(tuán)LC3、Insulin截面分布(400×)

3 討 論

SAP是由于胰酶異?；罨瘜?dǎo)致胰腺充血水腫壞死,常合并多器官功能障礙和全身炎癥性反應(yīng)綜合征的臨床急危重癥。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為,SAP主要病機(jī)是濕熱壅滯、血瘀互結(jié)、氣滯痰凝,治療當(dāng)以通腑泄熱,化濕解毒,散淤止痛為法。柴黃清胰活血顆粒是遵從上述治則,長(zhǎng)期廣泛運(yùn)用于臨床且療效確切的院內(nèi)制劑。方中生大黃、柴胡共為君藥,以除少陽(yáng)陽(yáng)明之邪;黃芩、桅子、延胡索、赤芍、丹參、桃仁共為臣藥,行氣止痛,清熱涼血活血,入營(yíng)入血,透邪于外;枳實(shí)、厚樸、黃芪、白芍共為佐使,通腑泄熱,補(bǔ)氣升陽(yáng),斂陰養(yǎng)血,柔肝止痛;諸藥合用,共奏通腑泄熱、清熱解毒、行氣止痛、活血化瘀之功效。

本研究采用?；悄懰徕c建立SAP模型,SAP組、CH組胰腺組織HE染色及病理學(xué)評(píng)分達(dá)到診斷標(biāo)準(zhǔn),提示造模成功。予以柴黃清胰活血顆粒干預(yù)后,胰腺組織壞死面積及病理學(xué)評(píng)分明顯降低,從組織學(xué)水平上證實(shí)了柴黃清胰活血顆粒對(duì)SAP有確切的改善作用。

目前SAP發(fā)病機(jī)制仍主要集中在胰酶的異常激活,早期SAP病理學(xué)改變以腺泡細(xì)胞受損為主。研究證實(shí),腺泡細(xì)胞的損傷、胰酶酶原異常激活均與自噬損傷密切相關(guān)[13-14]。GRASSO等[15]的研究表明,在胰腺炎早期,自噬可以選擇性地吞噬胰蛋白酶,從而保護(hù)胰腺細(xì)胞。隨著病程發(fā)展,自噬小體生成速率與溶酶體降解率之間失衡導(dǎo)致自噬通量降低。TANG等[16]證明miR-20b-5p可通過(guò)靶向作用AKT3調(diào)節(jié)自噬來(lái)改善SAP,隨后抑制炎癥和凋亡,促進(jìn)血管生成。CHOI等[17]研究闡明了番茄紅素可以抑制胰腺腺泡細(xì)胞自噬損傷,從而減輕AP的炎癥反應(yīng)。自噬損傷可能出現(xiàn)在自噬過(guò)程中的任何環(huán)節(jié),其中包含了自噬小體形成的異常、自噬小體和溶酶體的融合受到阻礙、溶酶體的降解功能障礙等。

評(píng)價(jià)自噬受損的重要指標(biāo)就是自噬通量,又稱自噬流。自噬通量是指細(xì)胞內(nèi)自噬過(guò)程的速率或強(qiáng)度,可以通過(guò)以下指標(biāo)來(lái)描述:(1)LC3 包括LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ被募集到自噬小體膜上,修飾后的LC3-Ⅱ只存在于自噬小體上,待自噬小體與溶酶體融合后,LC3-Ⅱ被溶酶體水解酶降解。因此,LC3-Ⅱ增多反映了自噬小體的形成增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ反映了自噬的活躍度。(2)p62 是一個(gè)與LC3相互作用的蛋白,p62分為Soluble和Insoluble[18],當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象的時(shí)候,自噬小體所攜帶的底物會(huì)穿過(guò)細(xì)胞骨架的微管系統(tǒng),而p62(Soluble)會(huì)將自噬小體所攜帶的底物通過(guò)泛素化蛋白Ubiquitin修飾,然后與LC3-Ⅱ一起轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行分解[19],故而p62(Soluble) 可作為自噬小體的標(biāo)記蛋白[20]。但當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)內(nèi)源性的p62 也可能出現(xiàn)不可溶性聚集體(Triton X-100),導(dǎo)致自噬流受阻,因此p62(Insoluble) 能側(cè)面反映自噬底物降解水平。(3)Beclin-1 與Ⅲ型磷酸肌醇-3激酶(Vps34)發(fā)生相互作用,在細(xì)胞自噬的關(guān)鍵環(huán)節(jié)自噬小體的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn),Beclin-1-Vps34復(fù)合物激酶活化可以提高磷脂酰肌醇3-磷酸的生成,進(jìn)而提高脂質(zhì)膜延伸、底物招募及參與自噬隔離膜的構(gòu)建,加快自噬小體的成熟[21],因此Beclin-1是激活自噬的重要蛋白。(4)LAMP 與溶酶體功能密切相關(guān),溶酶體降解率受體內(nèi)酸性水解酶Cathepsins B的影響,LAMP和Cathepsins B可協(xié)同作用于溶酶體的降解,可以顯示溶酶體功能的變化[19]。在LAMP2缺陷小鼠中,溶酶體-自噬功能障礙可導(dǎo)致自發(fā)性胰腺炎[22]。因此,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、LAMP2、p62(Soluble、Insoluble)表達(dá)水平可系統(tǒng)評(píng)價(jià)自噬流通暢度,較好地反映自噬-溶酶體系統(tǒng)運(yùn)行情況。

本研究結(jié)果表明,SAP組、CH組大鼠胰腺組織Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對(duì)表達(dá)水平及LC3免疫熒光強(qiáng)度均明顯高于SO組,提示SAP組及CH組自噬活性明顯增強(qiáng),且存在異常自噬,這可能是導(dǎo)致胰腺組織出現(xiàn)壞死的重要原因之一。與SAP組比較,CH組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、LAMP2、p62(Insoluble)相對(duì)表達(dá)水平降低,LC3免熒光強(qiáng)度降低,周邊胰腺腺泡細(xì)胞及胰島細(xì)胞LC3占比減少,提示CH組自噬溶酶體清除功能初步恢復(fù),自噬通量部分恢復(fù)通暢。通過(guò)共定位分析發(fā)現(xiàn)LC3和Insulin在胰島細(xì)胞團(tuán)中的空間位置上存在重疊和相關(guān)性,表明它們可能在胰島細(xì)胞中具有一定的功能聯(lián)系,但還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)和研究來(lái)進(jìn)一步探索它們之間的相互作用機(jī)制和生物學(xué)功能關(guān)系。

綜上所述,柴黃清胰活血顆?？赏ㄟ^(guò)抑制SAP中異?；钴S自噬,提高自噬通量,從而對(duì)胰腺細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用,為進(jìn)一步挖掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療SAP的價(jià)值提供依據(jù)。