慢性宮內(nèi)缺氧對(duì)新生仔鼠胰腺NDUFB6基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的影響*

黃 煌,呂國(guó)榮,林逕蒼,許相洋,曾世涌,程 晶

(泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建泉州 362011)

流行病學(xué)調(diào)查和相關(guān)研究顯示,慢性宮內(nèi)缺氧(chronic intermittent hypoxia,CIH) 和多種成年期慢性疾病易感性密切相關(guān),比如代謝性疾病、心血管疾病、早產(chǎn)兒死亡等[1-2]。近年來課題組一系列研究成果表明,CIH和仔鼠胰島素抵抗發(fā)生具有相關(guān)性[3-6]。2型糖尿病(T2DM)是因環(huán)境因素和遺傳因素相作用而發(fā)生的多基因遺傳疾病,胰島素分泌不足和胰島素抵抗是導(dǎo)致T2DM的2個(gè)環(huán)節(jié)。近年來細(xì)胞線粒體的功能缺陷或形態(tài)改變?cè)赥2DM發(fā)病過程中的作用被逐漸重視[7-9]。線粒體功能缺陷與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙可能有關(guān),線粒體的基因缺陷可以導(dǎo)致脂質(zhì)在骨骼肌積聚,影響骨骼肌的糖代謝;有報(bào)道稱NDUFB6基因在線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中起作用,NDUFB6基因多態(tài)性可以通過運(yùn)動(dòng)改善胰島素的敏感性及其與腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)合成酶的關(guān)系[10]。對(duì)此,本實(shí)驗(yàn)旨在探究在CHI條件下,仔鼠胰腺NDUFB6基因的改變及其與胰島素抵抗的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

孕齡7 d SD大鼠24只[上海斯萊克公司SCXK(滬)2017-0005],體質(zhì)量165～185 g;免疫組織化學(xué)試劑、蛋白免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)試劑盒、亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序(BSP)實(shí)驗(yàn)試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)試劑等購自福州鼎鑫泰斯特科技有限公司;NDUFB6一抗、熒光標(biāo)記二抗IgG購自美國(guó)Abcam公司;戊巴比妥鈉由泉州醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院制劑室保存?zhèn)溆?空腹血胰島素(FINS)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海瑞番生物科技有限公司;血糖儀購自美國(guó)Johnson公司。DNA提取試劑盒、PGH載體購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 CIH模型制備及分組

孕齡7 d SD大鼠分成健康組和缺氧組,每組12只,參照前期研究方法[3-6,11-14]建立CIH模型。在泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[SYXK(閩)2023-0012],缺氧組孕鼠放置在自制的缺氧箱內(nèi),每天8 h,氧濃度為 (10.0±0.5)%,以上過程重復(fù)至分娩前1 d,停止缺氧后孕鼠分籠喂養(yǎng)。首次缺氧1 h后孕鼠行動(dòng)脈血?dú)夥治?判斷妊娠期CIH模型造模是否成功。成功分娩后的第2周,2組仔鼠鼠尾采血,分別檢測(cè)空腹血糖(FBG)、FINS;麻醉處死仔鼠,取胰腺組織,分別做免疫組織化學(xué)檢查、Western blot、qPCR、BSP等實(shí)驗(yàn)。所有操作均符合泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求(審批號(hào)QZMCAE 20220701)。

1.3 仔鼠FBG、FINS檢測(cè)

采用ELISA法測(cè)定FINS,血糖儀檢測(cè)FBG;穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估胰島素抵抗能力:胰島素抵抗(HOMA-IR) = (FBG×FINS)/22.5。

1.4 免疫組織化學(xué)(二抗標(biāo)記單熒光)檢測(cè)NDUFB6蛋白的表達(dá)

仔鼠胰腺組織塊固定和包埋、切片(厚度5 μm)、脫蠟入水;3%甲醇-過氧化氫室溫孵育20 min,自來水清洗,微波加熱修復(fù)抗原,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,劃蠟;滴加正常山羊血清封閉液,室溫孵育20 min,滴加NDUFB6一抗,4 ℃孵育過夜,次日PBS清洗;滴加熒光標(biāo)記二抗IgG,37 ℃避光孵育20 min,PBS清洗,晾干,中性樹脂封片; 400×的熒光顯微鏡照相,分析圖像。

1.5 Western blot檢測(cè)NDUFB6蛋白的表達(dá)

試劑配制、提取總蛋白(將標(biāo)本組織塊剪碎,加入裂解液,玻璃勻漿器勻漿,充分裂解,離心后取上清液)、BCA測(cè)定蛋白濃度、制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠、蛋白樣品變性、電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加入NDUFB6一抗,4 ℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液-吐溫(PBST)漂洗,5 min×3次。加入二抗溶液,室溫條件下孵育1 h。再次PBST 漂洗,5 min×3次。用 Odyssey凝膠成像儀檢測(cè)蛋白顯色,蛋白條帶定量。

1.6 qPCR檢測(cè)NDUFB6 mRNA的表達(dá)

TRIzol法提取2組仔鼠胰組織總RNA,用TIANScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)體系混勻,反應(yīng)條件25 ℃溫浴10 min,42 ℃溫浴50 min,95 ℃加熱5 min。用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋至50 μL,-20 ℃保存。依據(jù)Genebank 數(shù)據(jù)庫(Primer 5.0)設(shè)計(jì)以下引物序列:NDUFB6基因正、反向引物序列分別為5′-CTA GAC TGG CAA GAG GCC GA-3′和5′-CAA TCC TTG ACA CAT CCT GG-3′;內(nèi)參GAPDH正、反向引物序列分別為5′-CAG GGC TGC CTT CTC TTG TG-3′和5′-TCT CGC TCC TGG AAG ATG GT-3′。qPCR的反應(yīng)依據(jù)說明書操作,反應(yīng)程序:95 ℃,15 min;95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT計(jì)算NDUFB6 mRNA的表達(dá)水平。

1.7 CpG島甲基化分析

1.7.1CpG島預(yù)測(cè)

依據(jù)美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心(NCBI)記錄NC_005104.4,NDUFB6基因只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本,對(duì)第一外顯子不在同一區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè),該轉(zhuǎn)錄本第一外顯子及第一外顯子上游附近形成2個(gè)CpG島。

1.7.2BSP實(shí)驗(yàn)

使用DNA 提取試劑盒提取胰腺組織基因組DNA并檢測(cè),取基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化并回收。引物的設(shè)計(jì):Ndufb6-島1正向引物為5′-ATG GAC CTA ACA GAA TGG AGT TGA-3′,反向引物為5′-TGC TTC TTT GAA GAA AAT TTC TCC ATA AG-3′。Ndufb6-島2正向引物為5′-CCA GAG GCT GGG CTG CTG TGA CGC CAT C-3′,反向引物為5′-GCC CCC GCG CAG GAT GTG GCC CCT GGA G-3′。對(duì)照樣品是從構(gòu)建的質(zhì)粒中用酶切回收得到的目的片段,對(duì)照樣品正向引物為5′-AGG GAG GTG AAG TAG TGG TG-3′,反向引物為5′-GGA GGA GAA GAG TGG AGG AGT-3′。PCR擴(kuò)增、克隆與測(cè)序:將目標(biāo)片段割膠(上海捷瑞生物工程有限公司,GK2043)純化,連接PGH克隆載體,按照試劑盒中的產(chǎn)品說明書操作。采用XL10-Gold感受態(tài)轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和涂板。酶切法鑒定陽性菌落,挑取質(zhì)粒送測(cè)序。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果

缺氧組孕鼠首次缺氧1 h后進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?結(jié)果發(fā)現(xiàn),缺氧組孕鼠SaO2、PaO2較健康組明顯下降(P<0.001),缺氧組孕鼠母體受缺氧應(yīng)激出現(xiàn)低氧血癥,但無CO2潴留、無明顯酸中毒,表明妊娠期CIH模型造模成功,見表1。

表1 2組SD孕鼠的動(dòng)脈血?dú)獗容^

2.2 仔鼠血液指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

分娩后第2周,缺氧組仔鼠FINS、FBG、HOMA-IR均高于健康組仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),缺氧組仔鼠出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象,見表2。

表2 2組仔鼠分娩后第2周血液相關(guān)指標(biāo)

2.3 NDUFB6蛋白表達(dá)水平

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,缺氧組仔鼠胰腺組織NDUFB6蛋白表達(dá)水平明顯低于健康組仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,健康組仔鼠胰腺組織中的NDUFB6蛋白表達(dá)水平明顯高于缺氧仔鼠組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

A:健康組仔鼠;B:缺氧組仔鼠;C:統(tǒng)計(jì)分析圖;a:P<0.05。

2.4 NDUFB6 mRNA 表達(dá)水平

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,健康組仔鼠胰腺組織中的NDUFB6 mRNA 水平明顯高于缺氧組仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

2.5 NDUFB6基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化測(cè)序及結(jié)果

2.5.1NDUFB6基因啟動(dòng)子CpG島1區(qū)域甲基化分析

用Diagram對(duì)比圖來表示健康組仔鼠與缺氧組仔鼠NDUFB6基因啟動(dòng)子CpG島1區(qū)域甲基化率。缺氧組仔鼠NDUFB6基因CpG島1的甲基化率和健康組仔鼠比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.042,P=0.967),見表3、圖4。

黃色代表甲基化,藍(lán)色代表未甲基化。

表3 2組仔鼠胰腺中NDUFB6基因啟動(dòng)子CpG島1區(qū)域甲基化率

2.5.2NDUFB6基因啟動(dòng)子CpG島2區(qū)域甲基化分析

用Diagram對(duì)比圖來表示健康組仔鼠與缺氧組仔鼠樣本NDUFB6基因啟動(dòng)子CpG島2區(qū)域甲基化率。缺氧組仔鼠NDUFB6基因CpG島2的甲基化率高于健康組仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.349,P<0.001),見表4、圖5。

黃色代表甲基化,藍(lán)色代表未甲基化。

表4 2組仔鼠胰腺中NDUFB6基因啟動(dòng)子島2區(qū)域甲基化率

3 討 論

一些專家學(xué)者曾經(jīng)提出在胚胎發(fā)育階段,不良環(huán)境可能使該生物體在成年階段更易患慢性代謝性等疾病。多年來的流行病學(xué)的調(diào)查研究豐富了這個(gè)假說。人類個(gè)體的生命周期跨度大,因?qū)嶒?yàn)條件、醫(yī)學(xué)倫理、經(jīng)費(fèi)等因素制約,臨床研究相對(duì)比較困難。產(chǎn)前缺氧是臨床實(shí)踐中胚胎發(fā)育階段最重要的、最常見的刺激,很多孕期不良癥狀及產(chǎn)后嬰兒病理狀況與宮內(nèi)缺氧關(guān)系密切,如哮喘、吸煙、母體貧血、先兆子癇、胎盤功能不全等[14-15]。目前一些專家使用CIH等模型[16-17]進(jìn)行相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

本研究提出母體CIH與生物體成年疾病相關(guān)的假說并進(jìn)行相關(guān)研究,取得一些成果[18-20]。根據(jù)課題組成熟的動(dòng)物模型[3-6,11-12],缺氧組采用的氧濃度為(10.0±0.5)%,模擬臨床中的胎兒缺氧狀況,孕鼠未出現(xiàn)CO2潴留、酸中毒現(xiàn)象,僅有低氧血癥,僅受缺氧因素影響,說明造模成功。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧組仔鼠FINS、FBG、HOMA-IR均高于健康組仔鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 ),說明缺氧組仔鼠出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。

糖尿病具有明顯遺傳傾向、以血糖升高為特征,但是占糖尿病人群90%的T2DM發(fā)病的分子機(jī)制仍未明確。許多人把T2DM易感基因定位在不同染色體區(qū)域,認(rèn)為其是高度復(fù)雜異質(zhì)性的多基因疾病[21-22]。有研究表明中國(guó)華東地區(qū)的漢族人群患T2DM的易感基因定位于9號(hào)染色體短臂和D9S171連鎖的9p21區(qū)域[23],其選擇的基因NDUFB6位于該基因的連鎖區(qū)域,基因表達(dá)的蛋白為線粒體還原型輔酶Ⅰ(NADH)脫氫酶家族之中的一員,蛋白、糖和脂肪的生物氧化過程都與之有關(guān)。

有研究報(bào)道,隨著年齡增長(zhǎng),NDUFB6 基因在人體骨骼肌中的表達(dá)呈下降趨勢(shì);NDUFB6基因啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)(rs629566,A/G)可促使甲基化狀態(tài)改變,該基因在骨骼肌中的表達(dá)下降[24]。有研究提示,短期的運(yùn)動(dòng)刺激能顯著改善個(gè)體胰島素敏感性,NDUFB6基因參與調(diào)節(jié)了這種適應(yīng)[25-27],這一發(fā)現(xiàn)表明NDUFB6基因參與了線粒體功能,有助于ATP合成,表明應(yīng)重視T2DM中線粒體中NDUFB6基因的作用。

本研究免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)結(jié)果均提示缺氧組仔鼠胰腺組織NDUFB6蛋白表達(dá)水平明顯低于健康組仔鼠(P<0.05);qPCR檢測(cè)結(jié)果提示健康組仔鼠胰腺組織NDUFB6 mRNA 水平明顯高于缺氧組仔鼠(P<0.05)。依據(jù)NCBI記錄,NDUFB6基因只有1個(gè)轉(zhuǎn)錄本,對(duì)NDUFB6基因第一外顯子不在同一區(qū)域的轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測(cè),該轉(zhuǎn)錄本第一外顯子及第一外顯子上游附近形成2個(gè)CpG島;用BSP檢測(cè)胰腺NDUFB6基因啟動(dòng)子區(qū)域位點(diǎn)甲基化修飾情況,結(jié)果表明缺氧組仔鼠NDUFB6基因CpG島1區(qū)域的甲基化率和健康組仔鼠無明顯差異(P>0.05),但缺氧組仔鼠NDUFB6基因CpG島2的甲基化率高于健康組仔鼠(P<0.05)。推測(cè)CIH時(shí)仔鼠胰腺線粒體基因NDUFB6甲基化率升高,導(dǎo)致NDUFB6 mRNA 和蛋白表達(dá)水平下降,缺氧組仔鼠出現(xiàn)胰島素抵抗現(xiàn)象。綜上所述,CIH可致缺氧組仔鼠胰腺NDUFB6基因表觀遺傳機(jī)制改變,可能參與CHI區(qū)域后仔鼠胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展過程。