超聲評(píng)價(jià)大鼠宮腔粘連模型的可行性研究*

蔡瑤瑤,蔡麗君,夏維婷

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院:1.產(chǎn)科;2.生殖中心;3.婦科,浙江溫州 325000)

宮腔粘連(intrauterine adhesion,IUA)是指各種因素導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層受到損傷,引起宮腔部分或全部堵塞所致的一系列綜合征,主要由醫(yī)源性宮腔操作引起,臨床上主要表現(xiàn)為育齡期女性出現(xiàn)閉經(jīng)、下腹痛、繼發(fā)不孕、反復(fù)流產(chǎn)、生育能力降低等,其所致的并發(fā)癥嚴(yán)重威脅女性生殖健康,且目前尚無(wú)有效及統(tǒng)一的治療方法[1-3]。由此,深入研究宮腔粘連的病因及內(nèi)膜修復(fù)機(jī)制,探索可能的干預(yù)措施具有重大意義。目前相關(guān)研究主要集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,動(dòng)物模型評(píng)價(jià)方法十分有限,本文通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)大鼠形態(tài)學(xué)檢查及超聲檢查評(píng)價(jià)宮腔粘連模型,探討超聲檢查評(píng)價(jià)大鼠宮腔粘連模型的可行性及優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雌性大鼠16只,體重230～250 g;雄性大鼠4只,體重250～280 g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特殊病原體(SPF)屏障環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2015-0009。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,保障動(dòng)物自由飲水和攝食。

1.1.2主要儀器與試劑

蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);Masson染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Olympus43光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);RM2245輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司);DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);GE Voluson E8彩色多普勒超聲診斷儀(美國(guó)GE公司),探頭頻率1.5～9.8 MHz。

1.2 方法

1.2.1造模方法

采用機(jī)械法損傷大鼠單側(cè)子宮腔內(nèi)膜建立宮腔粘連模型(模型側(cè)/模型組),對(duì)側(cè)子宮作為對(duì)照側(cè)(對(duì)照組)。每天觀察大鼠陰道涂片,處于動(dòng)情間期的雌鼠用于模型構(gòu)建。1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠后,下腹部消毒,于尿道上端1 cm處切開(kāi)皮膚進(jìn)入腹腔,暴露子宮,Y型子宮分叉處切口,利用刮勺刮除子宮內(nèi)膜造成病理性子宮內(nèi)膜損傷。其中8只大鼠用于進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析,其余8只大鼠用于功能學(xué)評(píng)價(jià)。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)由倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)wydw2016-0213)。

1.2.2病理學(xué)評(píng)價(jià)

8只雌性大鼠處死后取子宮組織,多聚甲醛固定標(biāo)本24 h后乙醇梯度脫水,行石蠟包埋,5 μm厚度連續(xù)切片,行HE和Masson染色,在高倍顯微鏡下選取視野,每張切片3個(gè)視野。HE染色切片行子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù),Masson染色后計(jì)算各側(cè)子宮內(nèi)膜纖維化的面積比,根據(jù)上述2個(gè)參數(shù)進(jìn)行子宮內(nèi)膜纖維化半定量評(píng)分[4]。

1.2.3生殖能力評(píng)估

另8只雌性大鼠術(shù)后2周開(kāi)始以2∶1的比例與雄鼠合籠,以見(jiàn)交配栓當(dāng)天為妊娠第0.5天,妊娠第17.5天開(kāi)腹計(jì)數(shù)子宮內(nèi)胚胎數(shù)目。

1.2.4超聲檢查

(1)大鼠內(nèi)膜情況判斷:子宮內(nèi)膜線模糊、局部?jī)?nèi)膜線連續(xù)性差、回聲中斷等表現(xiàn)提示內(nèi)膜異常,判斷為宮腔粘連陽(yáng)性;而宮腔內(nèi)膜線完整、連續(xù)、光滑則提示內(nèi)膜正常,判斷為宮腔粘連陰性。(2)合籠后妊娠第17.5天超聲下動(dòng)態(tài)觀察并計(jì)數(shù)每側(cè)大鼠子宮胎鼠數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠子宮超聲檢查結(jié)果分析

建模后2周行常規(guī)超聲檢查(圖1),可見(jiàn)造模側(cè)子宮內(nèi)膜線模糊、局部?jī)?nèi)膜線連續(xù)性差、回聲中斷等表現(xiàn)(圖2B、C),而對(duì)照側(cè)大鼠宮腔內(nèi)膜線均完整、連續(xù)、光滑(圖2A)。

圖1 大鼠建模后2周行常規(guī)超聲檢查

A:大鼠對(duì)照側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮內(nèi)膜線光滑連續(xù));B:大鼠模型側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮內(nèi)膜局部連續(xù)性差,回聲中斷);C:大鼠模型側(cè)子宮超聲(箭頭所示:子宮局部?jī)?nèi)膜線消失);D:大鼠髂骨位置(箭頭處);E:大鼠宮頸處(箭頭處);F:大鼠宮頸上方分為兩側(cè)宮角處(箭頭處)。

2.2 大鼠子宮病理學(xué)檢查結(jié)果分析

通過(guò)組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):與對(duì)照側(cè)比較,模型側(cè)子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目明顯減少,纖維化面積比例增加(圖3);模型側(cè)子宮內(nèi)膜纖維化半定量評(píng)分為(5.50±2.12)分,對(duì)照側(cè)為0分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A、B:分別為大鼠對(duì)照側(cè)及模型側(cè)子宮內(nèi)膜HE染色;C、D:分別為大鼠對(duì)照側(cè)及模型側(cè)子宮內(nèi)膜Masson染色。

2.3 大鼠子宮超聲與病理檢查結(jié)果對(duì)比分析

妊娠第17.5天超聲與開(kāi)腹計(jì)數(shù)兩組子宮胚胎數(shù)目,模型側(cè)均明顯少于對(duì)照側(cè)(P<0.05);而同組兩種方法計(jì)數(shù)結(jié)果均無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)表1、圖4。模型組超聲檢查宮腔粘連陽(yáng)性率為75.0%(6/8),對(duì)照組為0,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);點(diǎn)二系列相關(guān)分析顯示,超聲檢查宮腔粘連陽(yáng)性率與大鼠子宮內(nèi)膜纖維化半定量評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.927,P<0.01)。

表1 超聲與開(kāi)腹計(jì)數(shù)胚胎數(shù)目比較

A、B:大鼠妊娠第17.5天剖腹探查所見(jiàn)(箭頭所示:模型側(cè)宮角妊娠情況);C、D:分別為大鼠妊娠第17.5天超聲所見(jiàn)對(duì)照側(cè)及模型側(cè)宮角妊娠情況(箭頭所示:胚胎)。

3 討 論

宮腔粘連是婦科常見(jiàn)病之一,我國(guó)由于人工流產(chǎn)數(shù)逐年增加,宮腔粘連發(fā)生率較高[5]。宮腔鏡是目前診斷和治療宮腔粘連的主要方法,但中、重度宮腔粘連術(shù)后再粘連發(fā)生率較高,治療困難,影響育齡期婦女生殖及身心健康[6]。雖然宮腔粘連病因?qū)W研究不斷深入,但其發(fā)生機(jī)制至今未完全闡明。由于臨床宮腔粘連患者病理標(biāo)本取材困難,大大限制了宮腔粘連的治療研究進(jìn)展,因此建立穩(wěn)定可靠的動(dòng)物模型是研究宮腔粘連發(fā)生機(jī)制、預(yù)防和治療方法的關(guān)鍵[7]。目前,宮腔粘連的建模方法主要有機(jī)械損傷、化學(xué)損傷和電燒傷等[8]。大鼠宮腔粘連模型因與臨床子宮內(nèi)膜損傷及宮腔粘連病理狀況相似,被廣泛用于研究[9-10]。目前宮腔粘連動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)主要通過(guò)處死動(dòng)物后的組織病理形態(tài)[8,11-12],表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜組織萎縮,腺體減少且大多無(wú)活性,內(nèi)膜纖維化程度增加,宮腔纖維組織黏稠,血管堵塞造成粘連部位缺血等[13-14]。該評(píng)價(jià)方法無(wú)法后續(xù)觀察活體動(dòng)物模型的病灶動(dòng)態(tài)變化,限制了宮腔粘連在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入研究。超聲檢查以無(wú)創(chuàng)、方便和可反復(fù)進(jìn)行的優(yōu)點(diǎn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中逐漸得到廣泛應(yīng)用[15-17],但目前較少有文獻(xiàn)報(bào)道將超聲評(píng)價(jià)應(yīng)用于宮腔粘連相關(guān)的動(dòng)物研究中,本研究通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)大鼠形態(tài)學(xué)檢查及超聲檢查結(jié)果,探討超聲檢查評(píng)價(jià)大鼠宮腔粘連模型的可行性。

檢測(cè)病理組織的腺體數(shù)量和纖維化程度是目前大多數(shù)研究評(píng)價(jià)宮腔粘連動(dòng)物模型的主要標(biāo)準(zhǔn)。陳醒等[8]通過(guò)子宮內(nèi)膜刮除法建立大鼠宮腔粘連模型,發(fā)現(xiàn)模型組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量較對(duì)照組減少,纖維化面積增加。徐倩等[4]利用兩種機(jī)械損傷法分別建立宮腔粘連模型,同樣通過(guò)上述病理學(xué)評(píng)價(jià)模型的有效性。張璐等[18]則在上述評(píng)價(jià)指標(biāo)的基礎(chǔ)上,增加了細(xì)胞角蛋白-19(CK-19)和波形蛋白(vimentin)免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)。韓華等[19]通過(guò)注射95%乙醇溶液建立宮腔粘連大鼠模型,發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜胞飲突的形成和整合素β3表達(dá)均受到明顯抑制。還有學(xué)者聯(lián)合運(yùn)用多種發(fā)病機(jī)制建立宮腔粘連模型,常使用的方法有機(jī)械損傷聯(lián)合不同感染,其穩(wěn)定性及成模率較單一機(jī)制形成的模型更佳[20-21]?？偠灾?目前大部分對(duì)于宮腔粘連動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)都是依賴于病理學(xué)檢查。

超聲在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較為廣泛,較為常見(jiàn)的有心臟超聲無(wú)創(chuàng)評(píng)價(jià)心功能[22-23],以及對(duì)于肝臟、腦血管等的評(píng)價(jià)[24-25],而關(guān)于小動(dòng)物子宮疾病的研究應(yīng)用較少。李秀梅等[26]發(fā)現(xiàn)超聲測(cè)量大鼠子宮體厚度可作為判斷大鼠子宮腺肌病建模是否成功的無(wú)創(chuàng)手段。在臨床上超聲檢查已被廣泛用于宮腔粘連的診斷[27],宮腔粘連患者超聲影像通常表現(xiàn)為宮腔線模糊,局部連續(xù)性不佳,內(nèi)膜回聲中斷,局部“三線征”消失,內(nèi)膜與肌層分界不清,局部毛糙;三維超聲顯示局部呈低回聲或者缺損[28]。本研究中宮腔粘連大鼠的子宮超聲形態(tài)表現(xiàn)與上述表現(xiàn)相似,且超聲檢查宮腔粘連陽(yáng)性率與大鼠子宮內(nèi)膜纖維化半定量評(píng)分呈正相關(guān)性,表明超聲檢查能較好地對(duì)模型大鼠進(jìn)行判斷。此外,本研究運(yùn)用超聲計(jì)數(shù)孕晚期妊娠大鼠的胚胎數(shù)目,并與開(kāi)腹計(jì)數(shù)胚胎數(shù)目進(jìn)行比較,結(jié)果顯示二者無(wú)明顯差異,提示超聲檢查能較為準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)胎鼠數(shù)目,對(duì)宮腔粘連模型進(jìn)行生育力評(píng)價(jià)。

綜上所述,本研究結(jié)果提示超聲檢查可通過(guò)形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)及生殖功能評(píng)價(jià)兩方面全面評(píng)價(jià)宮腔粘連大鼠模型,能對(duì)活體動(dòng)物模型進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià),避免了處死動(dòng)物才能評(píng)價(jià)模型的局限性,這對(duì)于采用宮腔粘連動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的基礎(chǔ)研究具有重要意義。