虎杖中白藜蘆醇提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化性

蘇 東 海, 張 虎 成, 彭 堅(jiān), 楊 國(guó) 偉, 辛 秀 蘭

( 1.北京電子科技職業(yè)學(xué)院 生物工程學(xué)院, 北京 100176;2.北京市經(jīng)濟(jì)管理學(xué)校 食品工程系, 北京 100036 )

0 引 言

過(guò)多接觸紫外線輻射可引起皮膚曬傷、曬黑、皮膚光敏反應(yīng)、皮膚光老化甚至皮膚癌等。研究表明,白藜蘆醇具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管等功效[1],對(duì)黑色素瘤增殖具有較好的抑制作用。白藜蘆醇存在于花生、葡萄、虎杖等許多植物中,是植物受到生物或非生物脅迫時(shí)產(chǎn)生的一種植物抗毒素[2]。目前,從虎杖中提取白藜蘆醇的方法包括超聲提取法[3]、超臨界CO2萃取法[4]、酶解法[5-6]、有機(jī)溶劑提取法[7]和微波萃取法[8]等,提取效率還有待進(jìn)一步提升。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)虎杖中白藜蘆醇的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)對(duì)DPPH、羥自由基清除能力的測(cè)定,以及提取物對(duì)紫外照射后成纖維細(xì)胞的SOD、CAT、GSH和MDA水平的影響,檢驗(yàn)白藜蘆醇的生物活性。

1 材 料

1.1 材料與儀器

虎杖;黑色素癌細(xì)胞A375,中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品,上海金穗生物科技有限公司;DPPH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;超氧自由基清除率檢測(cè)試劑盒,北京盒子生工科技有限公司;噻唑藍(lán)、二甲亞砜、PI碘化丙啶,北京默克有限公司;MDA、SOD、CAT、GSH檢測(cè)試劑盒,南京建成生物工程研究所;細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 虎杖中提取白藜蘆醇的單因素試驗(yàn)

分別采用不同超聲功率、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn),研究不同因素對(duì)白藜蘆醇提取率的影響。稱(chēng)取1.0 g虎杖粉末,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1∶30,分別在超聲功率120、210、300、390、480、570 W提取30 min。稱(chēng)取1.0 g虎杖粉末,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比1∶30,超聲功率480 W,提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min。稱(chēng)取1.0 g虎杖粉末,料液比1∶30,超聲功率480 W,提取時(shí)間30 min,分別配置45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液。稱(chēng)取1.0 g虎杖粉末,乙醇體積分?jǐn)?shù)75%,料液比分別為1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55,超聲功率480 W,提取時(shí)間30 min。5 000 r/min離心5 min,取50.0 μL樣品,用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至10 mL,HPLC檢測(cè)白藜蘆醇含量。

1.2.2 白藜蘆醇的分離提取

根據(jù)響應(yīng)面得到的最佳條件提取白藜蘆醇。稱(chēng)取100.0 g虎杖磨碎加入乙醇超聲萃取,濾液通過(guò)減壓蒸發(fā)濃縮得到白藜蘆醇粗提物。分離提取方法根據(jù)文獻(xiàn)[9]稍做修改。采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)白藜蘆醇,檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm。

1.2.3 白藜蘆醇提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.000 mg白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至100 mL,得50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。用HPLC測(cè)定白藜蘆醇含量,色譜柱C18(150 mm×3.9 mm,4 μm),流動(dòng)相為體積比25∶75∶0.09的乙腈-水-乙酸,體積流量0.7 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10.0 μL。計(jì)算白藜蘆醇得率:

w=nρV/m×100%

式中:w為白藜蘆醇得率,%;ρ為根據(jù)HPLC峰面積計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度,mg/mL;n為溶液稀釋倍數(shù);V為供試品溶液體積,mL;m為虎杖取樣量,mg。

1.2.4 白藜蘆醇活性測(cè)定

DPPH自由基清除率:參照文獻(xiàn)[10]、[11]稍做修改。在10 mL比色管中依次加入4.0 mL DPPH溶液和白藜蘆醇提取液,再加入無(wú)水乙醇定容,混勻立即用1 cm比色皿在517 nm處測(cè)吸光度(A1),再在溫室避光保存30 min后測(cè)吸光度(A2)。對(duì)照組為只加DPPH的乙醇溶液,吸光度記為A3。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%

羥自由基清除率:按照超氧自由基清除率檢測(cè)試劑盒(Fenton比色法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定536 nm處吸光度,對(duì)照管吸光度記為A′1,測(cè)定管吸光度記為A′2,空白管吸光度記為A′3,各管測(cè)定吸光度3次取平均值。

羥自由基清除率=[1-(A′1-A′2)/A′3]×100%

對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響:成纖維細(xì)胞以DMEM為培養(yǎng)基(含青霉素50 μg/mL,鏈霉素50 μg/mL,10%胎牛血清),于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞,胰蛋白酶消化后,制備細(xì)胞懸液,調(diào)整濃度為105個(gè)/mL,加入96孔培養(yǎng)板中,同時(shí)加入適量1 000.0 μmol/L用DMSO配制的白藜蘆醇母液,補(bǔ)加培養(yǎng)液,使每孔終體積100 μL,每組白藜蘆醇終濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、800.0 μmol/L,每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)置未加白藜蘆醇組為對(duì)照。培養(yǎng)24 h,加入20 μL MTT(5.0 mg/mL),4 h后加入100 μL DMSO,搖勻,在酶標(biāo)儀測(cè)定OD490。

對(duì)UVB照射后成纖維細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響:試驗(yàn)分5組。對(duì)照組,不照射UVB,不加白藜蘆醇;1、2、3、4組,分別為加入0、12.5、100.0、800.0 μmol/L白藜蘆醇,照射UVB。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞,加入96孔培養(yǎng)板和培養(yǎng)皿中,各組加入相應(yīng)的白藜蘆醇,培養(yǎng)24 h后,給予UVB特殊光源輻射(強(qiáng)度30 mJ/cm2),照光結(jié)束后分組加入白藜蘆醇,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行MTT試驗(yàn),同時(shí)取培養(yǎng)皿中細(xì)胞制備細(xì)胞勻漿,參照試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD、CAT、GSH、MDA水平。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示,制圖采用Origin8.5繪制,響應(yīng)面分析采用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行,使用SPSS25.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇的HPLC檢測(cè)分析

在選定的色譜條件下,標(biāo)準(zhǔn)品白藜蘆醇的保留時(shí)間為(4.504±0.056) min。白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.129 4x-0.007,R2=0.999 9,線性范圍0～10.0 μg/mL,在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 白藜蘆醇的分離提取與鑒定

2.2.1 單因素對(duì)白藜蘆醇得率的影響

由圖1可知,隨著超聲功率的增大,白藜蘆醇得率逐漸增大,功率為480 W時(shí)白藜蘆醇得率達(dá)到最大(圖1(a))。提取時(shí)間在40 min時(shí),白藜蘆醇得率最高(圖1(b))。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí),白藜蘆醇得率最高,之后逐漸降低(圖1(c))。料液比在1∶15時(shí)白藜蘆醇得率最大(圖1(d))。

(a) 超聲功率

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以提取率(Y)為響應(yīng)值,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的工藝優(yōu)化試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面因素水平表

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

采用Design-Expert 8.06軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析擬合?；貧w方程:Y=4.75+0.22A+0.28B+0.11C+0.22D+0.18AB-0.27AC-0.037AD-0.35BC+0.080BD+0.11CD-0.61A2-0.52B2-0.35C2-0.68D2,試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3?；貧w方程模型P<0.000 1,表明二次多項(xiàng)回歸模型極度顯著;失擬項(xiàng)不顯著(P=0.189 6>0.05),說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合程度較好。各因素對(duì)虎杖中白藜蘆醇提取率的影響由大至小順序?yàn)樘崛r(shí)間、料液比、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表3 回歸模型的方差分析

由圖2可以看出,A與C、B與C響應(yīng)面相對(duì)較陡,等高線扁,說(shuō)明交互作用較強(qiáng)。其他響應(yīng)面較為平緩,等高線較圓,交互作用則相對(duì)較弱。采用軟件對(duì)提取工藝進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化,得到的最佳條件為超聲功率495.53 W、提取時(shí)間33.0 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)63.67%、料液比1∶17.13,白藜蘆醇提取率預(yù)測(cè)值為4.83 mg/g。為驗(yàn)證響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最佳工藝參數(shù),實(shí)際參數(shù)設(shè)定為超聲功率496 W、提取時(shí)間33 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)64%、料液比1∶17,按修正后條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)得到的白藜蘆醇得率為4.80 mg/g,接近預(yù)測(cè)值,說(shuō)明優(yōu)化后的工藝參數(shù)可靠。

(a) 提取時(shí)間和超聲功率

2.2.3 白藜蘆醇的分離與鑒定

選用NKA-9大孔吸附樹(shù)脂初步分離白藜蘆醇,HPLC檢測(cè)分離結(jié)果,白藜蘆醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)由純化前的15.6%提升至58.4%。白藜蘆醇經(jīng)ODS柱層析分離,HPLC鑒定結(jié)果為白藜蘆醇。

2.3 白藜蘆醇的抗氧化性

由圖3(a)可知,隨著白藜蘆醇質(zhì)量濃度的增加,DPPH自由基的清除率升高,當(dāng)白藜蘆醇質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí),清除率為94.92%,繼續(xù)增大質(zhì)量濃度,清除率基本不變。采用SPSS25.0軟件計(jì)算,得到IC50為0.926 mg/mL,表明虎杖中的白藜蘆醇具有較好的抗氧化能力。

(a) DPPH自由基

由圖3(b)可知,羥自由基的清除率隨著濃度的升高而增大,當(dāng)白藜蘆醇質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),清除率達(dá)到94.65%。采用SPSS25.0計(jì)算,得到IC50為0.165 mg/mL,表明虎杖中白藜蘆醇對(duì)羥自由基的清除效果顯著。

2.4 白藜蘆醇對(duì)紫外照射成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用

如圖4所示,與對(duì)照組相比,1組SOD酶活力下降最大,下降了72.6%,2組、3組、4組SOD酶活力分別下降了65.8%、42.3%和12.4%(P<0.01)。紫外照射導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞中MDA含量增加,但經(jīng)白藜蘆醇處理后,皮膚成纖維細(xì)胞中的MDA含量明顯下降,白藜蘆醇添加量越大,MDA含量下降越明顯。白藜蘆醇處理皮膚成纖維細(xì)胞后,SOD、CAT酶活力和GSH含量均明顯增加。SOD催化氧自由基轉(zhuǎn)變成低活性氧,減少對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞的傷害;CAT自由基清除能力提高。因此,白藜蘆醇可以有效減緩紫外引起的皮膚成纖維細(xì)胞損傷。

*表示P<0.01,與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;#表示P<0.05,與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6)

3 結(jié) 論

以虎杖為原料,白藜蘆醇提取工藝的優(yōu)化條件:超聲功率496 W,提取時(shí)間33 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)64%,料液比1∶17。在最優(yōu)條件下,白藜蘆醇的提取率達(dá)到4.80 mg/g,與模型預(yù)測(cè)值(4.83 mg/g)基本相符合。通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂和碳十八鍵合硅膠樹(shù)脂分離得到提取物,經(jīng)HPLC和紅外線鑒定為白藜蘆醇,且白藜蘆醇純度高,達(dá)到99.90%?？寡趸栽囼?yàn)結(jié)果表明,虎杖粗提物中的白藜蘆醇對(duì)DPPH自由基和羥自由基清除能力良好,可以作為抗氧化劑的新型來(lái)源。紫外照射成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用試驗(yàn)結(jié)果表明,白藜蘆醇可以通過(guò)提高皮膚成纖維細(xì)胞中的SOD、CAT酶活性與GSH含量以及降低MDA含量來(lái)緩解紫外線造成的皮膚傷害。