抑瘤腸菌聯(lián)合抗程序性細胞死亡蛋白1單抗治療微衛(wèi)星穩(wěn)定型結(jié)直腸癌的實驗研究

蘇小婷 張明生

結(jié)直腸癌(CRC)是世界上第三大常見惡性腫瘤和第二大惡性腫瘤死亡原因[1-2]。免疫治療的出現(xiàn)為惡性腫瘤治療帶來新的希望,其對黑色素瘤、非小細胞肺癌等不同類型的惡性腫瘤臨床療效顯著[3-4]。免疫治療只對少數(shù)高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)型CRC效果顯著,而對占95%以上的微衛(wèi)星穩(wěn)定/錯配修復功能完整(MSS/pMMR)型CRC并不敏感,也就是常說的“冷腫瘤”狀態(tài)[5]。所以,目前如何提高MSS/pMMR型CRC患者的免疫治療療效,將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁崮[瘤”是腸癌免疫治療領(lǐng)域的熱點。許多研究表明抗腫瘤免疫反應(yīng)受腸道菌群影響,通過調(diào)節(jié)腸道菌群可改善抗腫瘤免疫反應(yīng)[6]。但是,腸道菌群是否影響抗程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)單抗對MSS型CRC的治療效果還需要進一步的探索。抑瘤腸菌(TSE)是由與腫瘤免疫相關(guān)的特殊腸道細菌和抗腫瘤免疫促進物等組成的藥物,可通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡進而促進抗腫瘤免疫反應(yīng)。CT26細胞屬于MSS型小鼠CRC細胞系,對免疫檢查點阻斷的敏感性不高[7]。本研究構(gòu)建了MSS型CRC荷瘤小鼠模型,通過動物實驗觀察了TSE聯(lián)合抗PD-1單抗治療CRC的療效的影響并對其作用機制做了初步探索。

材料與方法

1.材料:6～8周齡,體重18～20 g的雌性BALB/c小鼠,購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司,在同濟醫(yī)院科研大樓動物中心的無特定病原體(SPF)級別的屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。小鼠結(jié)腸癌細胞CT26購自尚恩生物技術(shù)有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%EDTA胰蛋白酶消化液均購于美國Hyclone公司;胎牛血清購自中國賽默飛世爾科技有限公司;小鼠CD8抗體購自英國ABcam公司;TSE購自博吉弘康(嘉興)生物醫(yī)藥有限公司;抗PD-1單克隆抗體購自Leinco公司。小鼠流式抗體LIVE/DEAD(FVS510)、CD45(APC-CY7)、CD3(APC)、CD4(PE)、CD8a(FITC)均購自美國Biolegend公司。

2.方法

(1)細胞培養(yǎng):CT26腫瘤細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行孵育。

(2)建立小鼠皮下移植瘤模型[8]:將之前擴增的處于對數(shù)生長期的CT26腫瘤細胞用胰蛋白酶消化并用PBS洗滌、稀釋后制備腫瘤細胞懸液,濃度為5×106個/ml,置于冰盒中保存,以保證腫瘤細胞活力。提前一天用剃毛刀將小鼠右背下側(cè)的毛發(fā)剃光,并用耳標對小鼠進行標記。用1 ml胰島素針吸取200 μl細胞懸液皮下注射至小鼠右背下側(cè)的部位。

(3)測量小鼠皮下移植瘤的體積和監(jiān)測小鼠體重:用游標卡尺分別測量小鼠皮下移植瘤的最長徑和最短徑,腫瘤體積=(最長徑×最短徑2)/2;每隔2天測量小鼠腫瘤大小和稱重。

(4)分組及處理:皮下注射后的5～7天,當小鼠皮下移植瘤體積生長到50～100 mm3時,將所有小鼠隨機分為對照組、TSE單藥組(TSE組)、αPD-1單藥組(αPD-1組)、TSE聯(lián)合αPD-1組(聯(lián)合組),每組小鼠各10只。處理方式:對照組每2天腹腔注射1次生理鹽水,并每天予200 μl生理鹽水灌胃處理;TSE組每2天腹腔注射1次生理鹽水,并每天予200 μl TSE灌胃處理(TSE≥120億CFU/ml);αPD-1組每2天腹腔注射1次αPD-1 5 mg/kg,并每天予200 μl生理鹽水灌胃處理;聯(lián)合組每2天腹腔注射1次αPD-1 5 mg/kg,并每天予200 μl TSE灌胃處理。所有小鼠均連續(xù)處理14天。

(5)腫瘤組織樣本的獲取和染色:實驗結(jié)束后以頸椎脫臼法處死小鼠,獲取皮下移植瘤,于PBS中漂洗后用濾紙吸干并進行稱重及拍照記錄腫瘤大體圖片。各組均取適量腫瘤組織置于4%多聚甲醛中放置24～48 h,脫水、石蠟包埋、脫蠟、切片,再行蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化染色。HE染色用于確證實驗所取組織為腫瘤組織,并可以觀察結(jié)腸癌細胞形態(tài)特征。免疫組化染色用于檢測腫瘤組織中的CD8+T細胞,用CD8一抗孵育好的切片用DAB試劑盒進行染色,等切片脫水后,再使用中性膠進行固定,然后在顯微鏡下觀察。用白光掃描儀采集圖像,用NDP.View2軟件分析圖像。

(6)流式細胞術(shù):將分離的小鼠皮下移植瘤組織和脾臟剪碎、研磨制成勻漿,將含IV型膠原酶(1 mg/ml)、透明質(zhì)酸酶(0.01 mg/ml)、DNase1(0.002 mg/ml)的混合消化酶置于37 ℃恒溫消化45 min,消化完成后加入紅細胞裂解液進行裂紅,多次離心后制成單細胞懸液,然后使用200目濾網(wǎng)洗滌和過濾以去除雜質(zhì)。采用固定活力染色510區(qū)分活細胞和死細胞,再用抗小鼠流式抗體進行染色。染色樣品在CytoFLEX-3激光13色流式細胞儀上進行分析,并使用FlowJo 10.0軟件分析制圖。

結(jié) 果

1.4組小鼠皮下移植瘤體積比較:對照組、TSE組、αPD-1組及聯(lián)合組小鼠皮下移植瘤平均體積依次減小[(1 314.09±267.75)mm3、(855.89±145.38)mm3、(470.04±98.21)mm3、(261.85±76.68)mm3,P<0.05],見圖1。

圖1 4組小鼠離體的皮下移植瘤組織體積比較

2.4組小鼠皮下移植瘤組織HE染色和免疫組化染色結(jié)果:HE染色結(jié)果顯示,αPD-1組和聯(lián)合組有大面積的腫瘤壞死組織。免疫組化染色結(jié)果顯示,對照組、TSE組、αPD-1組及聯(lián)合組小鼠皮下移植瘤組織中CD8+T細胞數(shù)量依次升高[(14.83±4.26)、(68.17±9.13)、(122.50±13.26)、(192.67±29.68),P<0.001]。見圖2。

圖2 4組小鼠皮下移植瘤組織HE染色和CD8+T細胞免疫組化染色結(jié)果(A、E:對照組;B、F:TSE組;C、G:αPD-1組;D、H:聯(lián)合組;A、B、C、D:HE染色,×200;E、F、G、H:免疫組化染色,×200)

3.4組小鼠皮下移植瘤組織和脾臟組織中CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞與CD3+CD4+T細胞/CD45+細胞比較:皮下移植瘤組織流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,αPD-1組小鼠CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞高于對照組,聯(lián)合組小鼠CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞高于對照組、TSE組及αPD-1組(P<0.05);而TSE組小鼠CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞與對照組及αPD-1組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組小鼠皮下移植瘤組織中CD3+CD4+T細胞/CD45+細胞和脾臟組織中CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞、CD3+CD4+T細胞/CD45+細胞比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組小鼠皮下移植瘤組織和脾臟組織CD3+CD8+T細胞/CD45+細胞與CD3+CD4+T細胞/CD45+細胞比較

討 論

CRC具有高發(fā)病率和不良預后的特征,是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一[9-10]。局限性CRC的5年生存率為91%,轉(zhuǎn)移性CRC的五年生存率不超過20%[11]。惡性腫瘤的免疫治療對不同類型惡性腫瘤患者顯示出明顯的療效,包括治療后病情的長期緩解,并有希望治愈小部分已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤患者。但腸癌目前的免疫治療進展并不順利,不如其他惡性腫瘤取得的效果顯著,很大原因是大部分CRC為MSS/pMMR型,如何提高免疫治療在MSS/pMMR型CRC的療效一直是臨床亟待解決的問題。

近來關(guān)于腫瘤與腸道菌群的研究越來越多,普遍認為腸道微生物群是動物和人類惡性腫瘤免疫治療療效相關(guān)的關(guān)鍵因素[12-13]。腸道菌群與免疫治療療效息息相關(guān)[14],改善腸道菌群的分布有可能提高免疫治療的療效[15-16]。調(diào)節(jié)腸道菌群的主要方法有糞菌移植(FMT)、口服益生菌、益生元等,直接運用活共生物種或細菌菌群。腸道菌群容易受到遺傳和外部環(huán)境因素的嚴重影響,而不同地區(qū)的微生物環(huán)境通常存在相當大的差異,導致腸道微生物群結(jié)構(gòu)和組成的變化[17]。

由于一個人的腸道微生物組失調(diào)不一定反映另一個人的腸道微生物組失調(diào),因此,有時FMT不一定可以促進抗PD-1單抗的抗腫瘤效應(yīng)[18]。FMT通過復雜的方式發(fā)揮作用,難以預測FMT結(jié)果,且FMT后存在未知病原體擴散的風險[19]。此外,許多問題需要系統(tǒng)和科學的評估,如劑量、給藥途徑和這種療法的長期療效。目前,腸道菌群療法缺乏明顯的便利性和重復性,臨床上也沒有統(tǒng)一的治療標準。TSE是通過科學方法篩選出的9種細菌,分別是長雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、青春雙嗜酸乳桿菌、動物雙歧桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌嗜熱鏈球菌、兩歧雙歧桿菌,以固定的比例和劑量開發(fā)出的食品級產(chǎn)品(食品生產(chǎn)許可證編號為SC10632117100037),已被證實不僅可預防疾病,還有參與主動免疫調(diào)節(jié)的功效。

雖然TSE可改善腸道微生物群的失衡,但其是否能與腫瘤免疫治療產(chǎn)生協(xié)調(diào)作用還并不明確,有待進一步研究。因此,在本研究中我們通過構(gòu)建MSS型CRC荷瘤小鼠模型,觀察TSE聯(lián)合抗PD-1單抗治療MSS型CRC能否比單純免疫治療產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果及其可能的作用機制。結(jié)果表明,αPD-1組和聯(lián)合組的腫瘤增殖速度低于其他兩組,同時聯(lián)合組的抑瘤作用顯著強于αPD-1單藥組。通過操縱腸道微生物群來改善腫瘤微環(huán)境中的T細胞浸潤是一個研究較多的領(lǐng)域,但仍停留在初級階段[20]。有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群促進抗PD-1單抗治療CRC的效果依賴于CD8+T細胞,腸道菌群可影響腫瘤微環(huán)境,增加腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細胞的浸潤,可將腫瘤微環(huán)境重新編程為免疫治療敏感的“熱”狀態(tài)[21]。在本研究中,抗PD-1單抗只能誘導腫瘤組織中CD8+T細胞數(shù)量輕度增加,這可能是抗PD-1單抗單藥治療效果不佳的原因之一[22]。然而,當抗PD-1單抗與TSE聯(lián)合使用時,與單藥組相比,TSE聯(lián)合αPD-1組顯著增加了腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的浸潤,體現(xiàn)了TSE良好改善腫瘤免疫微環(huán)境的作用。

TSE能有益地調(diào)節(jié)腸道菌群并增強MSS型CRC荷瘤小鼠的抗PD-1單抗功效,CD8+T細胞浸潤增加是其中一個機制[23]。還有很多問題并不清楚,包括腸道菌群種類的改變和相互影響、具體有哪些細胞因子或信號通路的參與,臨床能否重復出同樣的結(jié)果等,均為我們即將開展的研究。TSE具有菌群組成明確,劑量統(tǒng)一,服用方便,安全可靠等特點,克服了以往腸道菌群治療的缺陷。我們的研究也證實了TSE聯(lián)合抗PD-1單抗能夠提高免疫治療的療效和改善腫瘤微環(huán)境,使“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”,為抗PD-1單抗治療MSS型CRC提供了一個新思路,是一種很有前景的治療策略,具有重要的臨床意義。