血清HBsAg持續(xù)低水平與慢性乙型肝炎患者臨床治愈相關(guān)進展

高林 姜倩倩 魯鳳民

慢性乙型肝炎(CHB)的臨床治愈(即功能性治愈)是指在接受有限療程的抗病毒治療后,患者的血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA持續(xù)低于檢測下限并于停藥后維持應(yīng)答,HBV e抗原(HBeAg)轉(zhuǎn)為陰性(簡稱陰轉(zhuǎn))或者血清學轉(zhuǎn)換(對于陽性患者),血清HBV表面抗原(HBsAg)持續(xù)陰性,肝臟組織炎癥和組織病理學得到顯著改善[1-5]。獲得臨床治愈的患者,其終末期肝病的發(fā)生率和病死率明顯降低。遺憾的是,現(xiàn)有常用的兩類抗病毒藥物核苷(酸)類似物(NAs)與聚乙二醇干擾素(PEG-IFN)雖然能夠顯著抑制病毒復(fù)制和改善肝組織炎癥活動度,但很少能使患者的血清HBsAg消失。總之,CHB的臨床治愈仍是一項巨大的臨床挑戰(zhàn)。近年來,越來越多的臨床實踐[6-10]以及部分新藥臨床試驗結(jié)果[11-12]均提示,經(jīng)NAs治療或慢性HBV感染自然進程所致血清HBsAg低值的部分患者更易通過轉(zhuǎn)換治療策略實現(xiàn)臨床治愈。為此,我國學者相繼提出了CHB的治療策略與路徑圖建議[13-14],并且開展了以血清HBsAg低值陽性(<1 500 IU/ml)為主要入組指征、以臨床治愈為主要目標的研究項目[15-16],對于提高CHB的臨床治愈率具有重要意義。本文進一步對血清HBsAg低水平患者HBsAg的表達特征、對應(yīng)的宿主免疫狀態(tài)及其利于臨床治愈的相關(guān)機制進行綜述。

一、CHB患者血清HBsAg的來源及其意義

1.HBsAg的不同來源及對臨床治愈的影響:目前多個指南均推薦對CHB患者治療的理想終點為實現(xiàn)以血清HBsAg消失為指標的功能性治愈[2-4]。然而,即使是長期使用NAs治療的患者,其血清HBsAg清除率依然很低。CHB患者的血清HBsAg有共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)和整合于宿主基因組的HBV DNA兩個來源。而隨著疾病進展與持續(xù)的宿主特異性、非特異性抗HBV免疫,特別是HBeAg陰轉(zhuǎn)后,患者肝組織cccDNA池顯著降低,病毒載量也隨著復(fù)制的持續(xù)被抑制而顯著下降。此時,廣泛存在的HBV DNA整合片段成為血清HBsAg的主要來源[17]。眾多研究表明,無論是血清HBsAg自發(fā)陰轉(zhuǎn)[18-19],還是長期NAs治療后臨床治愈[20],均可顯著降低肝細胞癌(HCC)發(fā)生風險。我國香港地區(qū)一項納入4 568例血清HBsAg陽性患者的隨訪研究結(jié)果顯示,與50歲后才發(fā)生血清HBsAg陰轉(zhuǎn)的患者相比,50歲前發(fā)生陰轉(zhuǎn)的患者其HCC發(fā)生風險下降更為顯著[21],提示CHB患者越早達到臨床治愈,其遠期獲益越大。

2.HBsAg對維持慢性HBV感染的作用:HBV復(fù)制過程中會產(chǎn)生超量的HBsAg表達,免疫耐受期的慢性HBV感染者血清HBsAg水平可高達1014IU/ml(約為1016molecules/ml),遠超形成感染性病毒顆粒所必須的水平[22]。其中僅一小部分參與構(gòu)成Dane顆粒的病毒囊膜,更多HBsAg則以小球型或管狀的亞病毒顆粒形式存在于患者循環(huán)血液中。目前已知持續(xù)高水平的HBsAg刺激會導(dǎo)致機體獲得性免疫反應(yīng)(包括HBV特異性T細胞及B細胞反應(yīng))功能受損和耗竭[23]。不僅如此,游離HBsAg還可通過不同機制對肝組織內(nèi)的自然殺傷細胞、具有吞噬作用的庫普弗細胞及駐留的B細胞、T細胞等功能活性產(chǎn)生抑制[24-25]。與之一致的,近期有研究發(fā)現(xiàn)攜帶HBV DNA整合片段且能表達整合來源HBsAg的克隆性擴增肝細胞的數(shù)量隨著年齡增長呈增長趨勢,而機體的HBsAg特異性T細胞數(shù)量卻隨著年齡增長呈現(xiàn)降低的趨勢[26]。

綜上所述,我們傾向認為隨著HBeAg陰轉(zhuǎn),其對宿主免疫的抑制作用被解除,此時HBsAg對宿主固有免疫及抗HBV特異性細胞免疫的抑制作用可能是維持HBV慢性感染所必須的[24]。

3.血清HBsAg顯著降低常見于HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者:盡管HBeAg本身并不參與病毒復(fù)制,但HBV活躍復(fù)制往往會有大量HBeAg產(chǎn)生。已知高水平的HBeAg能夠誘導(dǎo)宿主(尤其是T細胞)的免疫耐受[27]。此外,HBeAg前體蛋白p22cr還能夠通過競爭性結(jié)合核轉(zhuǎn)運因子Kα1,抑制pSTAT入核,使得IFN刺激基因(ISGs)等效應(yīng)蛋白無法有效的表達[28]。有研究將HBeAg特異性細胞毒性T細胞(CTL)過繼給HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠,HBcAg特異性CTL過繼給HBcAg轉(zhuǎn)基因小鼠,通過對比兩者間的ALT峰值出現(xiàn)時間,發(fā)現(xiàn)盡管兩者間氨基酸序列有很大的重疊,HBeAg特異性CTL發(fā)揮殺傷表達病毒抗原肝細胞的起效時間比后者晚48小時,顯示可分泌的HBeAg具有抑制宿主抗HBV特異性免疫反應(yīng)的作用[29]。同樣,盡管使HBeAg表達抑制的前核心區(qū)(PC)和基本核心啟動子(BCP)突變在青春發(fā)育期即已存在[30],但無論是母嬰垂直傳播還是成年人間的水平傳播,建立慢性感染的均為正常表達HBeAg的野生型病毒株,而存在PC/BCP等能顯著抑制HBeAg產(chǎn)生的突變的病毒株一旦傳播,多導(dǎo)致嬰幼兒或成人急性暴發(fā)型肝炎[31]。

基于轉(zhuǎn)基因小鼠過繼性轉(zhuǎn)移模型的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HBeAg單表達可引起與HBcAg單表達同等強度的抗原特異性免疫反應(yīng),且單表達HBeAg轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟炎癥和損傷更為持久[29],證實了HBeAg具有免疫原性,能夠誘導(dǎo)一定的免疫應(yīng)答。我國鄧國宏教授團隊一項基于CHB患者的研究也提示,可分泌IFN-γ的Core蛋白特異性CD4+T細胞與患者HBeAg陰轉(zhuǎn)有關(guān)[32],即在免疫耐受打破后HBeAg的表達會引起抗原特異性免疫反應(yīng),促進表達HBeAg的感染肝細胞被清除。隨著年齡的增長,持續(xù)的抗HBV免疫增強往往會導(dǎo)致慢性HBV感染者體內(nèi)的HBV發(fā)生使HBeAg表達抑制或陰轉(zhuǎn)的A1762T/G1764A雙位點突變、G1896A突變或聯(lián)合(PC/BCP)突變積累,由于這些突變可一定程度上增強HBV DNA的復(fù)制[33],以致在HBeAg陰性患者中,攜帶了PC/BCP突變的患者HBV DNA水平均高于攜帶野生型病毒患者[30]。我們的Meta分析結(jié)果也證實了這一現(xiàn)象[34]。上述研究均提示,使HBV DNA復(fù)制能力增強的PC/BCP突變有利于HBeAg陰性患者低水平cccDNA池的維持。不僅如此,攜帶PC/BCP突變的感染肝細胞因HBeAg的表達缺如也有助于其逃逸宿主針對HBcAg/HBeAg的T細胞介導(dǎo)的CTL反應(yīng),從而獲得免疫選擇優(yōu)勢[31]。另一方面,近期一項研究利用肝細胞人源化小鼠的實驗證明,PC/BCP突變的HBV病毒株感染相對野生型病毒株具有更強的病毒復(fù)制能力且可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起感染細胞死亡[35]。這一現(xiàn)象與PC/BCP突變HBV病毒株感染所致成人或兒童急性暴發(fā)性肝炎發(fā)生是否有關(guān)值得關(guān)注。

二、血清HBsAg低值陽性有利于免疫調(diào)節(jié)治療下的臨床治愈

1.血清HBsAg低值陽性有利于宿主免疫功能恢復(fù):眾所周知,與急性HBV感染不同的是,慢性HBV感染狀態(tài)下,因超量的病毒抗原長期持續(xù)刺激,HBV特異性的T細胞和B細胞應(yīng)答缺陷,宿主常處于抗HBV免疫功能耗竭狀態(tài)[36-37]。有研究發(fā)現(xiàn),HBV特異性T細胞功能與血清HBsAg水平和病毒載量呈負相關(guān)[38-39]。一項慢性HBV感染者免疫細胞分析的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),HBsAg特異性T細胞的數(shù)量與血清HBsAg水平相關(guān)[36]。病毒抗原的持續(xù)低水平可能會減少病毒抗原的刺激,利于宿主免疫功能的恢復(fù)[25]。與之一致,我國學者的Switch、New Switch臨床研究[10,40]及“珠峰”真實世界項目研究結(jié)果均顯示,血清HBsAg持續(xù)低值陽性的NAs經(jīng)治患者在序貫/聯(lián)合長效IFN治療后往往有較高的臨床治愈率,且入組時HBsAg水平越低,HBsAg清除率越高[41]。

2.NAs停藥誘發(fā)的臨床治愈與停藥點HBsAg低值陽性相關(guān):從“無限期治療”治療模式到“有限療程”治療模式的嘗試,讓人們觀察到部分符合亞太肝病學會停藥規(guī)則的HBeAg陰性CHB患者在NAs停藥后發(fā)生了HBsAg的自發(fā)清除和臨床治愈[2,42-43]。基于此,Berg等[44]結(jié)合臺灣學者的建議,于2021年將治療策略完善為“安全停藥-觀察-治愈”。累積的數(shù)據(jù)顯示,HBsAg陰轉(zhuǎn)與停藥點HBsAg水平密切相關(guān)。其中RETRACT-B的研究結(jié)果表明[45],NAs停藥時HBeAg陰性、HBsAg<1 000 IU/ml的白種人或HBsAg<100 IU/ml的亞洲黃種人,分別在停藥4年后有超過41%和33%發(fā)生HBsAg清除。

3.血清HBsAg低值陽性患者在新藥臨床試驗中更易于實現(xiàn)臨床治愈:近期,新英格蘭雜志發(fā)表了CHB新藥反義寡核苷酸(ASO)的鼓舞人心的最新臨床試驗數(shù)據(jù)[11]。在該研究中,隊列1(每周皮下注射bepirovirsen 300 mg,持續(xù)24周)在治療結(jié)束時分別有26%NAs經(jīng)治患者和29%初治患者實現(xiàn)了HBsAg清除,但在隨后的24周隨訪結(jié)束時,這一比例分別降低至12%和14%,復(fù)陽率高達50%。在基線HBsAg≤3 000 IU/ml的患者中,隨訪結(jié)束時有12%的NAs經(jīng)治患者和25%的初治患者仍能維持HBsAg清除且HBV DNA陰轉(zhuǎn)。值得注意的是,盡管基于RNAi技術(shù)的在研新藥相比ASO有更強的抑制HBsAg轉(zhuǎn)錄表達的作用,但卻沒有觀察到治療過程中或停藥后出現(xiàn)持續(xù)的HBsAg消失。故此不排除ASO可能是通過免疫調(diào)節(jié)作用誘發(fā)患者HBsAg表達細胞的免疫清除。此外,通過阻斷程序性死亡受體1(PD-1)/程序性死亡-配體1(PD-L1)通路實現(xiàn)CHB功能性治愈的新藥——恩沃利單抗(ASC22)的臨床試驗,其亞組的7例基線HBsAg≤100 IU/ml的患者中,有3例在治療24周內(nèi)出現(xiàn)了血清HBsAg清除,并在隨訪結(jié)束時保持清除狀態(tài)[12]。這些臨床觀察的結(jié)果均提示,血清HBsAg越低越容易實現(xiàn)臨床治愈。

三、問題與展望

對現(xiàn)行治療策略或在研新藥臨床試驗治愈患者的共性特征進行總結(jié)可以發(fā)現(xiàn),特別是在自然或經(jīng)治后HBeAg陰轉(zhuǎn)的CHB患者中,肝組織和外周循環(huán)血HBsAg水平較低有利于HBsAg特異CTL功能的恢復(fù)[46]。因此,血清HBsAg低值的CHB患者可成為臨床治愈的優(yōu)勢人群(圖1)。但需要提醒的是,包括ASO在內(nèi)的RNA干擾藥物,通過以堿基互補方式與HBV目標基因轉(zhuǎn)錄本結(jié)合,激活宿主細胞的多聚酶核酸(RNase H)酶活性,加速病毒mRNA降解或阻止病毒蛋白的翻譯合成,從而使包括HBsAg在內(nèi)的血清病毒蛋白水平顯著降低,但這并不能代表cccDNA池或整合HBV DNA片段的減少或消失,且短時間的血清病毒蛋白水平下降并不一定可帶來耗竭的細胞免疫功能恢復(fù)。

圖1 低值HBsAg的CHB患者可成為臨床治愈的優(yōu)勢人群(對于HBeAg陰性的HBsAg低值CHB患者,其血清HBsAg主要來源于整合的HBV DNA,隨著HBsAg表達水平降低,其對HBsAg特異性T細胞的免疫抑制減弱,宿主免疫功能逐漸恢復(fù),從而有利于實現(xiàn)功能性治愈)

目前,對于患者血清HBsAg的低值界定為多少才能達到比較理想的臨床治愈率還有待進一步研究明確。此外,由于現(xiàn)有的一線抗病毒藥物難以實現(xiàn)HBsAg的有效清除,開發(fā)新的治療藥物,改善聯(lián)合治療或免疫治療策略,或許能有效提高HBsAg的清除率。