“溫度對酶活性的影響”實(shí)驗(yàn)改進(jìn)綜述及思考

程佳佳

(廣東省中山市第一中學(xué) 廣東中山 528403)

《普通高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)(2017年版2020年修訂)》(以下簡稱《課程標(biāo)準(zhǔn)》)在教學(xué)建議中提出“組織以探究為特點(diǎn)的主動(dòng)學(xué)習(xí)是落實(shí)生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的關(guān)鍵”“實(shí)驗(yàn)教學(xué)是促成學(xué)生達(dá)成生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)的重要支撐”。針對人教版教材中利用淀粉酶進(jìn)行“探究溫度對酶活性的影響”的實(shí)驗(yàn),許多教師在具體操作過程中進(jìn)行了探索,在材料選擇、因變量的檢測方法、實(shí)驗(yàn)操作順序等方面進(jìn)行了改進(jìn),使實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更易解釋,現(xiàn)象更加明顯。下文以“中國知網(wǎng)”作為數(shù)據(jù)來源,以“溫度對酶活性影響”為主題詞搜索相關(guān)文獻(xiàn),對該實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)進(jìn)行了綜述,并提出了相關(guān)改進(jìn)思考。

1 實(shí)驗(yàn)原理

反應(yīng)底物淀粉在淀粉酶的水解下生成還原糖,可以用碘液檢測單位時(shí)間內(nèi)淀粉的消耗量或用斐林試劑檢測單位時(shí)間內(nèi)還原糖的生成量,從而表征反應(yīng)速度。單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的還原糖越多,淀粉消耗量越大,酶活性越高。

2 存在的問題

在該實(shí)驗(yàn)的具體操作中,存在的問題主要包括以下幾方面

(1)選材問題。α-淀粉酶溶解不夠充分,濃度控制不夠精確,且該酶在0 ℃～100 ℃均有較高的活性。

(2)因變量的檢測問題。若利用碘液檢測,高溫條件下,由于淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞,使得其與碘之間的吸附結(jié)構(gòu)無法保持,無藍(lán)色現(xiàn)象產(chǎn)生;在常壓下,65 ℃以上碘會升華,高溫下不出現(xiàn)藍(lán)色反應(yīng)。基于以上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象無法說明酶的活性是否被破壞。而若選用斐林試劑檢測,由于要進(jìn)行水浴加熱,不能保證是預(yù)設(shè)溫度下的反應(yīng)結(jié)果。

(3)該實(shí)驗(yàn)為定性實(shí)驗(yàn),無法由數(shù)據(jù)進(jìn)行模型構(gòu)建,需轉(zhuǎn)變?yōu)槎繉?shí)驗(yàn)。

(4)無法回收溶解在淀粉溶液中的酶。

3 改進(jìn)措施

3.1 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)條件和是否規(guī)范操作對于實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響很大,甚至?xí)绊憣?shí)驗(yàn)的成敗。朱小碗認(rèn)為可以選擇煮沸后的分析純可溶性淀粉,因?yàn)橹蠓胁粌H可以使淀粉充分溶解,而且可以使不同溫度處理后的溶液中直鏈淀粉含量基本相同。吳蕾研究得出,α-淀粉酶失活的溫度為85 ℃以上,失活的保溫時(shí)間至少應(yīng)控制在6 min。張進(jìn)則發(fā)現(xiàn)60 ℃左右淀粉酶活性較高。這些探究結(jié)果為實(shí)驗(yàn)溫度范圍的選擇、梯度設(shè)計(jì)、無關(guān)變量的控制提供了重要依據(jù)。

3.2 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)材料

3.2.1 選擇其他酶

在該反應(yīng)中,無論是反應(yīng)物還是生成物的檢測,在檢測效果上均存在著爭議,有研究選擇其他酶來探究溫度對酶活性的影響。姚舒等根據(jù)美國教材的建議,選擇兒茶酚溶液代替淀粉溶液,利用分光光度計(jì)進(jìn)行反應(yīng)程度的定量分析。尹輝發(fā)現(xiàn),使用雞蛋溶液在60 ℃水浴加熱后過濾所形成的渾濁雞蛋花溶液,再利用胃蛋白酶水解,反應(yīng)迅速,現(xiàn)象明顯,可作為替代材料。張巍波選擇胰蛋白酶和脫脂奶,并結(jié)合分光光度計(jì)以定量確定酶的相對活性。和淵等用純度較高且純化較好的蛋白酶,結(jié)合電泳技術(shù)以判斷酶活性的強(qiáng)弱。趙行星通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):糖化酶(α-1,4-葡萄糖水解酶)對溫度有較高的敏感性(65 ℃以上活性迅速下降)且對淀粉有適中的催化作用,能夠替代α-淀粉酶。

對酶的種類的拓展,可豐富學(xué)生對于生命多樣性和復(fù)雜性的認(rèn)知,樹立生命觀和結(jié)構(gòu)觀。同時(shí),在新情境下,教師引導(dǎo)學(xué)生自主設(shè)計(jì)并完成實(shí)驗(yàn),可以訓(xùn)練學(xué)生的科學(xué)思維和探究能力,助力核心素養(yǎng)的落實(shí)。

3.2.2 固定化酶

沈唯軍以海藻酸鈉為載體,采用包埋法固定α-淀粉酶。使用固定化酶不僅節(jié)約成本和用時(shí),由于固定化酶可與產(chǎn)物分離并重復(fù)利用,可以讓學(xué)生對“高溫對酶空間結(jié)構(gòu)破壞的永久性”這一論述進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 改進(jìn)因變量的檢測方法

圍繞反應(yīng)物淀粉和產(chǎn)物還原糖的檢測,改進(jìn)的方向包括兩方面,一是排除檢測方法和試劑對自變量帶來影響,使定性檢測更加科學(xué)可信;二是由定性檢測發(fā)展為定量檢測,《課程標(biāo)準(zhǔn)》中提出:“在重視定性實(shí)驗(yàn)的同時(shí),也應(yīng)重視定量實(shí)驗(yàn)”,將定性實(shí)驗(yàn)發(fā)展為定量實(shí)驗(yàn),是實(shí)現(xiàn)思維進(jìn)階,培養(yǎng)高階科學(xué)思維素養(yǎng)水平的路徑之一。

3.3.1 檢測還原糖的生成量

在定性觀察中,羅建義建議先將各預(yù)設(shè)溫度條件下的淀粉和淀粉酶溶液裝入半透膜做成的透析袋(淀粉和淀粉酶無法通過)中,收集透析液(含有反應(yīng)產(chǎn)物還原糖)后再用斐林試劑進(jìn)行檢測。該改進(jìn)破除了“水浴加熱會改變原有溫度,改變預(yù)設(shè)的酶活性,因而不能用斐林試劑進(jìn)行檢測”的固化思維,為實(shí)驗(yàn)提供了更多思路,有利于在解決問題的過程中發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力。

在定量檢測中,柯文匯利用還原糖與DNS 試劑(3,5-二硝基水楊酸,黃色)可發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成3-氨基-5-硝基水楊酸(棕紅色)的原理,利用分光光度計(jì)檢測540 nm 波長下的吸光度值,實(shí)現(xiàn)還原糖含量的定量檢測。但該反應(yīng)需要預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的淀粉溶液和酶溶液濃度、保溫時(shí)間和顯色時(shí)間等反應(yīng)條件,操作較繁瑣。以該顯色反應(yīng)為基礎(chǔ),藍(lán)益添利用數(shù)碼成像比色法定量測定麥芽糖含量。其原理是利用數(shù)碼攝像頭拍攝有色待測溶液的照片,再利用顏色識別軟件如Photoshop 采集該溶液的顏色參數(shù),發(fā)現(xiàn)顏色參數(shù)M 值與麥芽糖含量呈正相關(guān),可用M值表示麥芽糖含量。

3.3.2 檢測淀粉的消耗量

在定性觀察中,胡四新將各組反應(yīng)后的溶液均至于冰水中再進(jìn)行檢測,排除了高溫下淀粉結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致遇碘不變藍(lán)的問題。

在定量檢測中,李巧靈等通過定時(shí)取樣、滴加碘液和觀察顏色,測定相應(yīng)溫度下達(dá)到和碘液相同顏色的時(shí)間t,并用1/t反映相對酶活性,實(shí)現(xiàn)了定量的觀察。李金月等利用色度傳感器測定淀粉與碘液顯色反應(yīng)的色度,從而定量比較不同溫度條件下淀粉酶活性,該技術(shù)具有便捷、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、綜合和直觀等特點(diǎn),但是由數(shù)據(jù)采集器、傳感器和計(jì)算機(jī)及配套的軟件組成的定量采集數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)系統(tǒng)較難推廣應(yīng)用。沈唯軍等利用分光光度計(jì)檢測620 nm 處淀粉與碘液反應(yīng)形成藍(lán)色物質(zhì)的含量,進(jìn)行不同條件下淀粉酶活性的比較。蘇錦權(quán)巧妙地用智能手機(jī)的光線傳感器來測量溶液的吸光度,再利用手機(jī)軟件“亮度計(jì)”讀到的數(shù)值表征酶活性,從而在課堂中快速獲得實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

利用分光光度計(jì),亮度計(jì)等技術(shù)和方法進(jìn)行數(shù)據(jù)采集需要教師引導(dǎo)學(xué)生理解相應(yīng)檢測原理,在合理引導(dǎo)的基礎(chǔ)上使學(xué)生養(yǎng)成綜合、開放、創(chuàng)造性思維的習(xí)慣,但由于對學(xué)生儀器操作要求較高,不易在中學(xué)開展。

3.4 實(shí)驗(yàn)材料的整合

教材建議在探究pH 及溫度對酶活性影響的實(shí)驗(yàn)中分別選擇過氧化氫和淀粉作為反應(yīng)物,但在真正的操作中需要更換實(shí)驗(yàn)材料,準(zhǔn)備工作繁瑣,難以在一個(gè)課時(shí)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。有研究者就對實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行了驗(yàn)證,以探究淀粉酶能否用于pH 影響酶活性的實(shí)驗(yàn)。

宗海鳳等發(fā)現(xiàn)在堿性條件下,用碘液檢測反應(yīng)體系,結(jié)果不變藍(lán),通過一系列的探究實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),若選擇碘液作為鑒定試劑,碘液會與堿性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)生成次碘化鈉(NaIO)和碘化鈉(NaI),反應(yīng)無法進(jìn)行;若選擇斐林試劑作為鑒定試劑,則斐林試劑中的NaOH會與酸性物質(zhì)發(fā)生酸堿中和反應(yīng)。因此不能用淀粉酶探究pH 對酶活性的影響。

對此,陳九云等在實(shí)驗(yàn)中減少了酸和堿的用量,在3 mL 反應(yīng)體系中,分別使用1 滴5%的HCl 溶液和1 滴5%的NaOH 溶液,發(fā)現(xiàn)既可有效地使酶失活,又不影響淀粉及降解產(chǎn)物的正常檢測,從而解決了碘液鑒定和斐林試劑鑒定對實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來的誤判。此外,他們認(rèn)為在減少鹽酸用量的基礎(chǔ)上,酸對淀粉水解的影響可以忽略不計(jì),因此可以用淀粉酶探究pH 對酶活性的影響。

4 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)思考

當(dāng)利用淀粉酶作為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),鄧純臻等利用半透膜和U 型管設(shè)計(jì)如圖1所示的裝置,可直觀地根據(jù)液面高度變化反映酶活性。在此基礎(chǔ)上稍加改進(jìn),細(xì)化溫度梯度之后,通過測量液面的高度差,即可進(jìn)行定量分析。改進(jìn)后的裝置無需進(jìn)行復(fù)雜的試劑檢測,并且融合了多個(gè)知識和技能,實(shí)現(xiàn)了知識的遷移和問題導(dǎo)向的科學(xué)研究。

此外,本實(shí)驗(yàn)操作繁瑣,通過合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)裝置,使各個(gè)溫度下的實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)進(jìn)行,大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。金慧玉自制了溫度梯度恒溫水浴鍋(圖2),拓寬了改進(jìn)的思路。但在該裝置中未解決如何讓不同組別酶和底物分別保溫后同時(shí)混合的問題,還需進(jìn)一步改進(jìn)。

脲酶也可以作為一種補(bǔ)充材料替代淀粉酶,其最適溫度在50 ℃左右,70 ℃以上失活。脲酶分解尿素產(chǎn)生二氧化碳和氨,氨溶于水可以使酚酞變紅,根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)酚酞變紅的程度即可定性反映酶活性,而利用CO2感應(yīng)器測量反應(yīng)過程中CO2的變化情況即可定量反映酶活性。脲酶和尿素價(jià)格便宜,成本較低,同時(shí)其作為第一個(gè)被鑒定為蛋白質(zhì)的酶,對其進(jìn)行更深入的了解有助于科學(xué)史的深入研究,有助于學(xué)生科學(xué)思維的形成。

“溫度對酶活性的影響”這一探究實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)和創(chuàng)新是多方面、多層次的,可以挖掘的知識還有很多,研究工作還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。對該實(shí)驗(yàn)有效的把握,可以幫助教師創(chuàng)造有效的教學(xué)情境,激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情,從而培養(yǎng)學(xué)生不斷探索、勇于創(chuàng)新的科學(xué)精神,實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度以及終身學(xué)習(xí)的能力。