白藜蘆醇對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

張小良 高賽紅 楊迎春

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院解剖教研室,山西 汾陽 032200)

高脂血癥是指動物體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常且脂質(zhì)水平高于正常的一種疾病。據(jù)臨床統(tǒng)計(jì),45%～60%的腦卒中患者伴有高脂血癥〔1〕,高脂血癥是導(dǎo)致缺血性腦卒中的高危因素〔2〕,同時(shí)又可以加重腦缺血再灌注損傷〔3〕。隨著人民生活水平提高,患有高脂血癥的人逐年增加,所以研究伴有高脂血癥的腦缺血再灌注損傷更接近臨床實(shí)際,更有實(shí)驗(yàn)研究價(jià)值。

腦缺血再灌注損傷是一個(gè)多途徑、多因素參與的級聯(lián)反應(yīng)過程〔4.5〕,早在2005年Zhu等〔6〕就提出細(xì)胞自噬在腦缺血再灌注損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí),細(xì)胞自噬在缺血早期可以減輕腦缺血再灌注損傷,具有神經(jīng)保護(hù)作用〔7,8〕。

白藜蘆醇是從多種植物提取的一種多酚類化合物,近年來,白藜蘆醇在腦缺血再灌注損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注,通過調(diào)節(jié)氧自由基、一氧化氮(NO)、炎癥因子等對腦缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;可以通過誘導(dǎo)自噬對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔9〕。本研究探討白藜蘆醇預(yù)處理對高脂血癥大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用,是否與細(xì)胞自噬有關(guān)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組 54只7周齡雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量為(200±20)g,由山西醫(yī)科大學(xué)動物部提供,動物許可證號:SCXK(晉)2015-0001。全部大鼠隨機(jī)分3組各18只。假手術(shù)組,切開皮膚分離血管但不插入拴線;高脂血癥合并腦缺血組,高脂飼料喂養(yǎng)高脂血癥造模成功后,左側(cè)大腦中動脈(MCAO)腦缺血再灌注損傷造模;白藜蘆醇預(yù)處理組(簡稱白藜蘆醇組),MCAO術(shù)前7 d,24 h腹腔注射給藥1次,劑量為40 mg/kg。

1.2主要試劑 白藜蘆醇(美國Sigma公司);兔抗人自噬標(biāo)志蛋白(Beclin)-1(美國Santa Cruz Biotechnology公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物);2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC,美國Sigma公司);多聚甲醛(北京化學(xué)試劑公司)。一抗腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白〔mTOR,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司〕。

1.3高脂血癥大鼠模型制備 準(zhǔn)備高脂血癥模型:健康雄性SD大鼠54只,高脂飼料(蛋黃粉10%、豬油5%、膽固醇5%、膽鹽0.5%、甲硫氧嘧啶0.2%及基礎(chǔ)飼料79.3%)喂養(yǎng)6 w,左側(cè)股靜脈抽血全自動生化分析儀進(jìn)行血脂四項(xiàng)檢測,確定高脂血癥模型成功。

1.4腦缺血再灌注損傷模型制備 參照Longa等〔10〕并采用馬常升等〔11〕的改良法進(jìn)行手術(shù),取體質(zhì)量250～300 g雄性SD大鼠,備好栓線。選頸部正中皮膚切開,逐級分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA)。結(jié)扎并燒斷ECA,用眼科剪于游離段剪一小口,將栓線插入,經(jīng)CCA分杈處進(jìn)入ICA而入顱,栓線插入的深度為18～19 mm。扎緊栓線,外留1 cm長線頭。缺血2 h后,抽出栓線使其頭端沿ICA回到ECA中,即可恢復(fù)MCA血供實(shí)現(xiàn)再灌注;假手術(shù)組栓線插入長度<10 mm,不阻塞MCA;其他兩組均缺血2 h再灌注24 h后斷頭處死,于冰上快速新鮮取腦。

1.5神經(jīng)功能缺損評分 神經(jīng)功能缺損采用改良的Bederson 5分制評分法〔12〕,術(shù)后1 d對除正常組外的大鼠進(jìn)行神經(jīng)癥狀學(xué)評分。0分(正常):無運(yùn)動缺損;1分(輕度):提尾時(shí)不能伸展健側(cè)前爪;2分(中度):向健側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分(重度):不能向健側(cè)運(yùn)動;4分(極重度):不能自主運(yùn)動,意識水平低下。

1.6TTC染色 3組每組隨機(jī)抽取6只大鼠,用1%戊巴比妥40 mg/kg深度麻醉斷頭取腦,快速放入玻璃皿,-20 ℃冷凍20 min,待冰凍后分為5片,每隔2 mm切一片,用5%TTC染液浸泡,錫箔包蓋37 ℃避光水浴30 min。正常的腦組織染色呈紅色,梗死部位呈白色,照相備用,用IPP圖像分析測定大鼠腦梗死體積。

1.7透射電鏡法觀察 3組各隨機(jī)抽取6只大鼠,用10%水合氯醛深度麻醉,斷頭取腦,取缺血側(cè)額葉大腦皮質(zhì)于冰塊上迅速切割為1 mm3大小,浸泡于4 ℃電鏡固定液內(nèi)2 h,再換緩沖液4 ℃保存(固定液、緩沖液均為山西醫(yī)科大學(xué)電鏡室提供,要保證組織在離體30 s內(nèi)放入固定液內(nèi))。待標(biāo)本收集齊全后放保溫箱4 ℃送于山西醫(yī)科大學(xué)電鏡室制片。JEM-1011透射電鏡觀察SD鼠大腦缺血側(cè)缺血半暗帶區(qū)皮質(zhì),神經(jīng)元內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),如線粒體有無腫脹變性,細(xì)胞核周圍出現(xiàn)雙層膜的空泡狀結(jié)構(gòu)即自噬小泡,溶酶體增多形成自噬溶酶體,并采集圖像。

1.8Western印跡法檢測 提取已于-80 ℃保存各組大鼠腦標(biāo)本,裂解分離,提取上清液并測定組織總蛋白含量。配制5%濃縮膠和12%分離膠,固定玻璃板、注膠放入電泳緩沖液。2×蛋白上樣緩沖液與待測液等體積混勻,待樣品混合液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白恢復(fù)室溫后,拔梳子并按次序加入梳孔。接通穩(wěn)壓電泳儀,電壓為60～120 V,電泳至溴酚藍(lán)達(dá)分離膠底部。制作“三明治”將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,分別孵育一抗和內(nèi)參β-actin(1∶1 000),TBST液反復(fù)洗膜,接著孵育二抗。暗室內(nèi)膠片曝光,ImageJ凝膠成像系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能評分 缺血再灌注24 h后,與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕比較,高脂血癥合并腦缺血組神經(jīng)功能缺損評分〔(2.45±0.56)分〕明顯增高(P<0.05);與高脂血癥合并腦缺血組比較,白藜蘆醇組神經(jīng)功能缺損評分〔(1.76±0.43)分〕顯著降低(P<0.05)。

2.2各組腦梗死體積 缺血再灌注24 h后,高血脂組和白藜蘆醇組腦片都呈現(xiàn)白色梗死灶(圖1),白藜蘆醇組梗死體積〔(376.22±120.43)mm3〕較高脂血癥合并腦缺血組〔(512.33±101.56)mm3〕明顯減小(P<0.05)。

圖1 各組腦梗死(TTC染色)

2.3各組神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 透射電鏡結(jié)果,假手術(shù)組可見神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常,核膜完好,胞質(zhì)中線粒體、溶酶體形態(tài)分布正常,未見自噬體。高脂血癥合并腦缺血組神經(jīng)元內(nèi)可見溶酶體及少量自噬溶酶體,染色質(zhì)向周圍擴(kuò)散。白藜蘆醇組可見神經(jīng)元內(nèi)線粒體腫脹明顯,雙層膜的自噬小泡及自噬溶酶體數(shù)量明顯增多,出現(xiàn)凋亡小體,見圖2,箭頭所示為自噬小泡及自噬溶酶體。

2.4各組額頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較,高脂血癥合并腦缺血組和白藜蘆醇組AMPK、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯減少,mTOR蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05);與高脂血癥合并腦缺血組比較,白藜蘆醇組AMPK、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯增加,mTOR蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05),見圖3、表1。

圖2 各組腦組織透射電鏡結(jié)果(×5 000)

1～3:假手術(shù)組、高脂血癥合并腦缺血組、白藜蘆醇組圖3 各組自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)量

表1 各組自噬相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量

3 討 論

隨著人民生活水平的提高,高脂血癥的發(fā)病率在逐年增加,已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),高脂血癥不僅誘發(fā)腦血管疾病〔13〕,同時(shí)加重腦血管病的發(fā)展〔14〕及治療過程中加重腦缺血再灌注(I/R)損傷,成為治療腦I/R損傷的極大難題。實(shí)驗(yàn)證實(shí),高血脂可以加重腦I/R損傷,高脂血癥提高了腦缺血的治療難度。早在2009年Rajat Singh等〔15〕就已在Nature提出自噬可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,自噬是脂質(zhì)代謝的必需途徑,抑制自噬即加重高脂血癥。白藜蘆醇通過誘導(dǎo)自噬,同時(shí)對高脂血癥起到治療作用。中藥對一些嚴(yán)重疾病的治療越來越被世界認(rèn)可。白藜蘆醇具有抗氧化、抗感染作用,同時(shí)有重要的神經(jīng)保護(hù)作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜或高爾基體膜,包裹細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器形成囊泡,再與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,并釋放能量供細(xì)胞循環(huán)再利用的一種生物學(xué)過程。最新研究證實(shí),在腦缺血早期,白藜蘆醇通過誘導(dǎo)自體吞噬途徑減少腦I/R損傷,進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔16,17〕。但是,研究白藜蘆醇對高脂血癥合并腦I/R損傷是否有效及其機(jī)制,卻未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,白藜蘆醇預(yù)處理對高脂血癥合并腦I/R損傷有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。AMPK是調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶,當(dāng)神經(jīng)元發(fā)生缺血損傷,AMPK蛋白激酶增加,細(xì)胞分解代謝減少,合成代謝增加,以維持損傷細(xì)胞能量平衡。mTOR含有兩種復(fù)合體,分別為mTORC1和mTORC2,mTORC1發(fā)揮著更為重要的作用,mTORC1通過結(jié)合ULK1復(fù)合物抑制自噬,下調(diào)mTOR蛋白復(fù)合物,即可誘導(dǎo)自噬。Beclin-1是自噬調(diào)節(jié)蛋白,對自噬調(diào)控具有關(guān)鍵作用,同時(shí)也是自噬活動的必須蛋白,Beclin-1蛋白增加可以誘導(dǎo)自噬。因此推測白藜蘆醇可以通過AMPK-mToR-Beclin 1通路誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬增加。

本研究進(jìn)一步對缺血組織進(jìn)行透射電鏡檢測,自噬體是檢測自噬的金指標(biāo),結(jié)果與Western印跡結(jié)果一致。由此推斷,白藜蘆醇發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能通過誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)進(jìn)而減少組織損傷。

綜上,白藜蘆醇對高脂血癥合并腦缺血再灌注損傷有重要的治療及保護(hù)作用,其與激活自噬。