熟地黃的炮制及有效成分和微量元素的檢測研究

陳勝強(qiáng) ，楊克培 ，康文利 ，周永昌 ，陶思曼 ，關(guān)伊辰 ，蒲秀瑛

（1.蘭州理工大學(xué)，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)墾藥物堿廠有限公司，甘肅 蘭州 730000）

熟地黃為玄參科植物地黃的塊根，又名伏地，經(jīng)加工炮制而成.熟地黃具備補(bǔ)血滋陰功效，可用于血虛萎黃、眩暈、心悸失眠、潮熱骨蒸、盜汗、遺精等病癥，是非處方藥六味地黃丸主要成分之一.通常以酒、砂仁、陳皮為輔料經(jīng)反復(fù)蒸曬，至表里色黑油潤，質(zhì)地松軟黏膩.常切片或炒炭入藥[1].

目前可參照的黃酒蒸制熟地黃工藝步驟為：將洗干凈的生地黃放入桶內(nèi)，加入黃酒攪拌均勻后靜置，待黃酒被充分吸盡，取出，晾曬至外皮黏液稍干時，切厚片，干燥即得熟地黃.陳子月等[2]描述的高壓炮制時間過長，產(chǎn)品不合格率較高.張麗萍等[3]描述的炮制工藝中黃酒質(zhì)量不可控，且操作缺乏客觀可控的技術(shù)參數(shù)指導(dǎo)，無法精確控制其工藝，致使人為因素偏多，所得熟地黃中5 種苷類成分（梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷）含量相差很大，有益微量元素含量偏低，有害微量元素超標(biāo).徐廉松等[4]研究的雙波長含量檢測方法基線不穩(wěn)定，且分析時間過長，所測得苷類成分含量不穩(wěn)定.劉明等[5]研究熟地黃質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時未涉及微量元素的研究.本研究采用的水蒸制“七蒸七曬”炮制方法可有效增加熟地黃中鐵、鋅、銅微量元素含量，同時降低鎘、砷有害元素含量.此外，梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷及多糖含量較高.

1 儀器與試劑

儀器：蒸煮鍋（ZYG-700，南京潤邦機(jī)械科技有限公司）；鹵素快速水分測定儀（XF-720MA，廈門雄發(fā)儀器）；高效液相色譜儀Waters 2695（沃特世科技有限公司）；安捷倫電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（7800，安捷倫科技（中國）有限公司）；微波消解儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；紫外分光儀（ZF-7，上海金達(dá)生化儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS，上海亞榮生化儀器廠）.

試劑：乙腈（MERCK 公司，色譜純）；水為自制純水；磷酸（山東西亞化工，≥85.0%）；濃硫酸（國藥，95.0%～98.0%）；苯酚（國藥，≥99.0%）；無水乙醇（國藥，≥99.8%）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（Solarbio，≥98%）；硝酸（國 藥，65.0%～68.0%）.砷 單 元 素 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液（GBW08611-18126，中國計量科學(xué)研究院，1 000μg/mL）；鋅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（199018，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1 000 μg/mL）；鋁單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（19106，中國計量科學(xué)研究院，1 000μg/mL）；鎂單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（19C008，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1 000 μg/mL）；鎘單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（08614-17012，中國計量科學(xué)研究院，1 000 μg/mL）；鐵單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（29018，國家有色金屬及電子材料分析測試中心，1 000 μg/mL）；銅單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW(E)080122-17071，中國計量科學(xué) 研 究院，1 000 μg/mL）.梓醇 對 照品（Solarbio，≥98%）；地黃苷D 對照品（Solarbio，≥98%）；益母草苷對照品（Solarbio，≥98%）；異毛蕊花糖苷對照品（Solarbio，≥98%）；毛蕊花糖苷對照品（Solarbio，≥98%）.

2 試驗方法

2.1 熟地黃的炮制

將清洗干凈的生地黃在全自動蒸汽發(fā)生裝置中進(jìn)行蒸制（蒸制壓強(qiáng)為0.35～0.5 MPa），每次蒸制4 h，得到蒸制地黃.然后將蒸制地黃在太陽棚中進(jìn)行干燥（干燥溫度為50～70 ℃，需具有良好的換氣設(shè)施），且每隔2 h 翻料1 次，得到干燥地黃.按照上述步驟重復(fù)蒸制和干燥7 次，得到“七蒸七曬”的熟地黃.

2.2 苷類成分的測定

2.2.1 溶液配制

混合對照品溶液1：取梓醇對照品5 mg、地黃苷D 與益母草苷對照品各7 mg，分別用25%甲醇溶液稀釋定容至50 mL 容量瓶中，再稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的溶液.

混合對照品溶液2：分別取異毛蕊花糖苷對照品、毛蕊花糖苷對照品適量，用25%甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的溶液.

供試品溶液：取“七蒸七曬”的熟地黃0.5 g置于具塞錐形瓶中，加入20 mL 25%甲醇溶液溶解，超聲提取1 h 后過濾，再經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，即得.

2.2.2 高效液相色譜（HPLC）條件

色譜柱：Waters Symmetry? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.3%磷酸溶液（A）∶乙腈（B）（體積比為97∶3）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；梓醇、地黃苷D、益母草苷檢測波長：210 nm；異毛蕊花糖苷、毛蕊花糖苷檢測波長：334 nm[6]；各峰的理論塔板數(shù)不低于5 000.

2.3 多糖含量的測定

精密稱量5 g 熟地黃置于錐形瓶中加100 mL純水溶解，沸水浴回流提取，每次2 h，提取2 次，8層紗布趁熱過濾，減壓濃縮至50 mL 左右，80%乙醇醇沉，減壓干燥，得到熟地黃多糖，稱量熟地黃多糖，按式（1）計算多糖提取率.采用苯酚-硫酸法進(jìn)行熟地黃多糖提取率的測定[7-8].

式（1）中：m為熟地黃多糖提取物質(zhì)量（g），M為熟地黃樣品質(zhì)量（g）.

2.4 微量元素的測定

2.4.1 溶液配制

配制鐵、砷、鋅、鋁、鎂、鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度均為10 μg/mL[9].

供試品溶液：精密稱量0.3 g 熟地黃粉末于消解管中，精準(zhǔn)加入3 mL 硝酸，置于微波消解儀中進(jìn)行樣品消解54 min，待消解完成后放置室溫30 min[10].將消解后的樣品使用超純水沖洗3 遍，移入50 mL 容量瓶，定容至刻度，搖勻備用.

鐵、砷、鋅、鋁、鎂、鎘、銅標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別量取所配制的鐵、砷、鋅、鋁、鎂、鎘、銅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.5、1.0、2.0 mL 置于100 mL 聚四氟乙烯容量瓶中[11]，補(bǔ)加2%硝酸至100 mL，搖勻，即得.

使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS），載氣為氬氣[12-13]，以待測元素濃度（X）為橫坐標(biāo)、待測元素與所選內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)信號值的比值（Y）為縱坐標(biāo)繪制上述元素標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程.

2.4.2 樣品微量元素上機(jī)檢測

將空白溶液和試樣溶液分別注入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀中，測定待測元素和內(nèi)標(biāo)元素響應(yīng)信號值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到消解液中待測元素的濃度[14].

試樣中待測元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或質(zhì)量濃度計算如式（2）：

式（2）中：c為試樣中待測元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或質(zhì)量濃度，mg/kg 或mg/L；ρ 為試樣溶液中被測元素質(zhì)量濃度，μg/L；ρ0為試樣空白溶液中被測元素質(zhì)量濃度，μg/L；v為試樣消化液定容體積，mL；f為試樣稀釋倍數(shù)；m為試樣稱取質(zhì)量或移液體積，g 或mL；1 000 為換算系數(shù).

3 結(jié)果與討論

3.1 性狀

經(jīng)“七蒸七曬”的熟地黃，色漆黑，外表皺縮不平，質(zhì)柔軟，斷面滋潤，黏性較大，味較甜.

3.2 HPLC 測定5 種苷類成分的方法學(xué)驗證

3.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限考察

取適量2.2.1 項下所配制的梓醇、益母草、地黃苷D、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷混合對照品溶液于進(jìn)樣小瓶中，按進(jìn)樣量依次進(jìn)樣2、4、8、10、12、16、20 μL[15]，以各成分色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)分別繪制5 種對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線.檢出限以信噪比（S/N）為3 對應(yīng)的質(zhì)量濃度建立，定量限以S/N 為10 對應(yīng)的質(zhì)量濃度建立.結(jié)果如圖1 所示，5 種苷類成分在1～20 mg/L 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法檢出限為0.33～3.30 mg/L，定 量限為1.0～10.0 mg/L，說明該方法能夠滿足對5 種苷類成分的分析.

圖1 （a）梓醇，（b）益母草苷，（c）地黃苷D，（d）毛蕊花糖苷，（e）異毛蕊花糖苷的對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of (a) Catalpol, (b) Leonuride, (c) Rehmannioside D, (d) Acteoside, (e) Isoacteoside

3.2.2 精密度與重復(fù)性考察

取適量2.2.1 項下所配制的梓醇、地黃苷D、益母草、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷混合對照品溶液于進(jìn)樣小瓶中，按2.2.2 項下色譜條件，水平連續(xù)進(jìn)樣6 次[16]，計算方法的精密度[相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）].精密稱取同一批熟地黃樣品粉末6 份，以峰面積RSD 計算方法的重復(fù)性[17].精密度考察中，梓醇、地黃苷D、益母草、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷峰峰面積RSD 分別為0.16%、0.17%、0.24%、0.24%、0.22%.重復(fù)性考察中，梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷含量RSD 值分別為6.89%、5.36%、3.21%、6.62%、7.54%.上述數(shù)據(jù)表明本試驗方法精密度與重復(fù)性良好.

3.2.3 穩(wěn)定性考察

取適量2.2.1 項下所配制供試品溶液于進(jìn)樣小瓶中，分別于0、2、4、8、16、20 h 進(jìn)樣[18]，以峰面積RSD 值確定樣品的穩(wěn)定性.供試品溶液中梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷在20 h 內(nèi)峰面積的RSD 分別為2.29%、0.69%、0.81%、1.97%、1.83%.表明供試品溶液在20 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.2.4 加標(biāo)回收率考察

取適量2.2.1 項所配制供試品溶液于進(jìn)樣小瓶中，向供試品溶液中分別精密加入梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對照品溶液，每份樣品均做平行樣[19]，以峰面積RSD 計算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果如表1 所列.梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷平均回收率在98.08%～101.09%之間，RSD 在0.19%～3.07%之間，試驗方法回收率高，能夠滿足熟地黃中5 種有效苷類成分的檢測要求.

表1 5 種苷類成分的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of spiked recovery of 5 glycoside components

3.3 ICP-MS 測定微量元素的方法學(xué)驗證

按2.4 項下方法對鐵、砷、鋅、鋁、鎂、鉻、銅標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行ICP-MS 方法學(xué)驗證.結(jié)果如表2 所列，7 種微量元素在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，方法檢出限為0.002 0～1.001 2 μg/g，定量限為0.004 9～3.000 1 μg/g，能夠滿足7 種微量元素的檢測分析.

表2 7 種微量元素方法學(xué)參數(shù)Table 2 Methodological parameters of 7 trace elements

3.4 不同炮制工藝下熟地黃中有效成分的檢測結(jié)果對比

3.4.1 苷類成分含量的測定

采用上述HPLC 分析方法，對不同炮制工藝下熟地黃中5 種有效苷類成分進(jìn)行含量檢測，結(jié)果如圖2 所示.“一蒸一曬”至“七蒸七曬”，隨蒸曬次數(shù)的增加熟地黃中5 種有效苷類成分含量呈上升趨勢，“七蒸七曬”至“九蒸九曬”，隨蒸曬次數(shù)的增加熟地黃中5 種有效苷類成分含量無明顯變化.以傳統(tǒng)“黃酒蒸制”熟地黃中5 種有效苷類成分含量作為對照，“七蒸七曬”熟地黃中5 種有效苷類成分含量顯著高于傳統(tǒng)“黃酒蒸制”工藝.

圖2 不同炮制工藝下熟地黃中5 種有效苷類成分含量的變化（不同小寫字母表示差異顯著，p ＜ 0.05）Fig.2 Changes of content of 5 active glycosides in Radix Rehmanniae Praeparata under different concoction processes (different lowercase letters indicate significant differences, p ＜ 0.05)

3.4.2 多糖含量的測定

按2.3 項下方法對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行方法學(xué)驗證.結(jié)果如圖3 所示，葡萄糖在0.01～0.10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.99，方法能夠滿足多糖的測定.

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of glucose

熟地黃多糖提取率按公式（1）計算，得到“一蒸一曬”至“九蒸九曬”過程中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.05%、6.41%、11.59%、5.51%、10.23%、10.35%、11.84%、9.02%、18.37%.“一蒸一曬”至“七蒸七曬”，隨蒸曬次數(shù)的增加熟地黃多糖含量呈上升趨勢，“七蒸七曬”至“九蒸九曬”，隨蒸曬次數(shù)的增加熟地黃多糖含量呈下降趨勢.其中“七蒸七曬”得到的熟地黃中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30.10%.而“黃酒蒸制”得到的熟地黃中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為22.91%.

3.4.3 微量元素的測定

如圖4、5 所示，鐵、砷、鋅、鋁、鉛、鎘、銅元素在“一蒸一曬”至“九蒸九曬”中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化圖，隨蒸曬次數(shù)的增加，鋅、銅、鐵、鎘微量元素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，鎘、砷、鉛含量隨著蒸曬次數(shù)逐漸降低.

圖4 不同炮制工藝下熟地黃中有害微量元素含量的變化Fig.4 Changes of content of harmful trace elements in Radix Rehmanniae under different concoction processes

圖5 不同炮制工藝下熟地黃中有益微量元素含量的變化Fig.5 Changes of content of beneficial trace elements in Radix Rehmanniae under different concoction processes

據(jù)文獻(xiàn)報道[20]，鐵元素作為血紅蛋白的核心部分，可以補(bǔ)充機(jī)體對鐵的大量需求.在“七蒸七曬”炮制工藝下，鐵與鋅含量較高，不僅可以滿足機(jī)體對鐵與鋅的需求，同時還可以調(diào)整體內(nèi)銅、鋅比值，增強(qiáng)機(jī)體氨基酸的代謝能力.通過2.4 項下方法測定，“七蒸七曬”得到的熟地黃中微量元素鐵、鋅、銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1 763.40、62.77、17.39 μg/g，“黃酒蒸制”得到的熟地黃中微量元素鐵、鋅、銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為860.50、21.25、12.32 μg/g.其中鐵、鋁、鋅是所測定的7 種元素中含量較高的元素.同時，隨炮制工藝中蒸曬次數(shù)的增加，有害元素鎘、砷、鉛含量不斷降低，可減少有毒物質(zhì)在人體軟組織中的積累.“七蒸七曬”炮制工藝與傳統(tǒng)“黃酒蒸制”工藝相比，有益微量元素含量更高，有害元素更低，為“七蒸七曬”工藝炮制而成的熟地黃更加安全、可靠的用藥提供了相應(yīng)的理論支持.

4 結(jié)論

本文通過水蒸制“七蒸七曬”炮制工藝制得熟地黃，其中梓醇、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷含量均高于“黃酒蒸制”工藝.同時有益微量元素鐵、鋅含量均高于“黃酒蒸制”工藝，有害微量元素砷含量低于“黃酒蒸制”工藝，表明在新工藝條件下“七蒸七曬”炮制熟地黃的工藝方法具有提高各苷類主成分含量，提高有益微量元素含量，降低有害微量元素含量的顯著優(yōu)勢.

使用蒸汽壓強(qiáng)約為0.35 MPa，蒸制4 h 干燥過程中每2 h 翻料一次，經(jīng)太陽棚曝曬干燥至快速水分測定儀檢測水分不高于30%的“七蒸七曬”炮制工藝，此工藝炮制的熟地黃5 種苷類成分含量高，多糖含量相對穩(wěn)定，且有益微量元素鐵、鋅、銅含量最高，有害微量元素砷、鎘、鉛含量低.HPLC 等分析方法具有分離效果好，測定簡單，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確等優(yōu)勢，避免了熟地黃的浪費，為后期深入研究熟地黃提供了有力參考.