利用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定甜菜單胚不育系的混雜程度

陳姝源,吳則東

(黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院,哈爾濱 150080)

0 引言

甜菜是世界上重要的糖料作物之一,也是我國的第二大糖料作物[1]。我國每年甜菜糖的產(chǎn)量大約在150萬噸左右,2021年我國甜菜的播種面積為26.2萬公頃,2021年我國甜菜產(chǎn)量為785.09萬噸。糖甜菜為異花授粉、二年生作物, 育種方法目前主要為三系育種法, 即不育系、保持系和授粉系[2]。盡管甜菜種植面積和食糖產(chǎn)量均不足甘蔗的1/5,但由于甜菜種植簡便、機(jī)械化程度高、成本低、效益顯著,使得近幾年甜菜種植面積在穩(wěn)步提高[3]。目前世界上發(fā)達(dá)國家的甜菜品種均為單胚品種,國外的甜菜單胚品種均是以單胚細(xì)胞質(zhì)二元雄性不育系為母本,多胚授粉系為父本雜交而成,而國內(nèi)僅有少數(shù)一些育種單位育成的甜菜品種為單交種,其它育種單位也均是采用三交種,因此擁有單胚細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系數(shù)量的多少就決定了能夠配制多少雜交組合或者多少二元不育系。植物雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑,并在生產(chǎn)上取得了很大的成功,如我國雜交水稻種植面積占水稻總面積的46%～55%,其產(chǎn)量比常規(guī)品種增產(chǎn)20%～30%,同樣在甜菜育種上雜種優(yōu)勢利用也很廣泛[4]。甜菜單胚不育系和保持系在繁殖的過程中一般都是成對種植,在收獲過程中由于人為的原因很容易造成不育系中混雜有保持系或者保持系中混雜有不育系。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定,無法在早期分辨出甜菜自交系的育性。

分子標(biāo)記在狹義上是指DNA標(biāo)記,即DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映, 表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異[5]。分子標(biāo)記在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)開始應(yīng)用,它是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記技術(shù)之后發(fā)展起來的一種遺傳標(biāo)記[6]。近幾十年以來,已經(jīng)有SNP[7]、EST[8]以及ISSR[9]等多種分子標(biāo)記技術(shù)被運(yùn)用于甜菜遺傳圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析中。近年來,隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展,利用分子標(biāo)記技術(shù)對于甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的快速鑒定已經(jīng)成為可能。NISHIZAWA等[10]發(fā)現(xiàn)在甜菜線粒體基因組中的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)具有多態(tài)性和 4 個(gè)不相關(guān)的串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)(TR1、TR2 、TR3和TR4),而其中TR1串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性最高,串聯(lián)重復(fù)序列的數(shù)量為 2～13 個(gè)不等?？梢岳米饔糜谔鸩司€粒體VNTR位點(diǎn)進(jìn)行甜菜細(xì)胞質(zhì)的育性鑒定。 CHENG等[11]通過對中國甜菜種質(zhì)資源的研究發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞質(zhì)育性類型的小衛(wèi)星序列的拷貝數(shù)具有多態(tài)性,其中細(xì)胞質(zhì)為 OWEN[12]不育型的 TR1片 段有4個(gè)拷貝,細(xì)胞質(zhì)為保持系型的拷貝數(shù)為 13個(gè)。王有昭[13]也用此方法對甜菜主要品系進(jìn)行VNTR分子檢測時(shí),在葉用甜菜中首次發(fā)現(xiàn)了一株特異類型的細(xì)胞質(zhì),其TR1片段拷貝數(shù)為10個(gè)。其余試驗(yàn)結(jié)果與程大友[14]的結(jié)果一致,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn),其 TR1不育系擴(kuò)增條帶大小在500 bp以下,保持系擴(kuò)增條帶大小在750 bp左右。以這兩個(gè)作為對照材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可以通過對比條帶帶型大小的方式來判斷甜菜細(xì)胞質(zhì)類型。

細(xì)胞質(zhì)雄性不育系是甜菜雜交制種的基礎(chǔ)[15]。由于成對的甜菜單胚不育系和保持系細(xì)胞核沒有差別,只在細(xì)胞質(zhì)上有差異,并且在育種過程中,作為母本的都是單胚不育系或者二元單胚不育系,因此不育系中混有保持系比保持系中混有不育系對育種的影響更大。因此本研究擬對黑龍江以及新疆共三家育種單位的24份甜菜單胚不育系中是否混有保持系進(jìn)行分析,了解我國目前甜菜單胚不育系的純度,對于指導(dǎo)將來甜菜育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試的甜菜單胚不育系

試驗(yàn)中所用到的甜菜單胚不育系中有12份來自新疆石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所,10份來自新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,有兩份新改良的單胚不育系來自于黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院。

表1 供試甜菜單胚不育系名稱及來源Tab.1 Test varieties and sources

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜基因組DNA的提取

目前甜菜DNA提取通常使用改良的CTAB法。CTAB (十六烷基三甲基溴化銨簡稱CTAB)是一種陽離子去污劑,可溶解細(xì)胞膜 ,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中 (0.7 M NaCl) 是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽的濃度到一定程度 (0.3 mol/L NaCI) 時(shí)從溶液中沉淀,通過離心就可將 CTAB 與核酸的復(fù)合物同蛋白、多糖類物質(zhì)分開,然后將 CTAB 與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀 ,CTAB 能溶解于乙醇中。本試驗(yàn)采用改良CTAB法提取甜菜基因組的DNA[16]。

由于個(gè)別不育系發(fā)芽率較低,編號6取了12份個(gè)體,編號7取了17份個(gè)體,編號8取了9份個(gè)體,編號9取了11份個(gè)體,編號11取了17份個(gè)體,編號19取了10份個(gè)體,編號20、21取了20份個(gè)體,其余編號每份提取24個(gè)個(gè)體的基因組DNA,用來代表群體。

1.2.2 DNA分子標(biāo)記

本研究使用的分子標(biāo)記為引物TR1, 用于識(shí)別細(xì)胞質(zhì)的類型,其序列詳見表2[17]。

表2 TR1引物序列Tab.2 Primers for TR 1

1.2.3 PCR反應(yīng)體系與程序

PCR反應(yīng)體系為10 μL:包括5 μL 2×Taq PCR Master Mix,0.2 μL 上游引物(0.5 μmol/L),0.2 μL下游引物 (0.5 μmol/L),1 μL DNA (100 ng/μL) ,3.6 μL dd H2O[18]。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 3 min;94℃ 25 s,60℃ 25 s,72℃ 3 min,28個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離,在含有TAE的緩沖液中,130 V、30 min。電泳結(jié)束后,凝膠用Gelred熒光核酸染料染色,并通過凝膠成像系統(tǒng)觀察[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞質(zhì)育性分子標(biāo)記鑒定

試驗(yàn)共檢測了24個(gè)試驗(yàn)材料的302個(gè)植株樣本,經(jīng)TR1引物分子標(biāo)記鑒定檢測后,共檢測出238個(gè)結(jié)果。在這238個(gè)結(jié)果中,共檢測出750 bp條帶的細(xì)胞質(zhì)類型8份,材料分別為23、24;其余22個(gè)材料檢測的均為略低于500 bp的條帶。23、24檢測到的條帶分別有750 bp和500 bp,即750 bp為N型細(xì)胞質(zhì),500 bp為S型細(xì)胞質(zhì)。

圖1 D084 經(jīng)TR1引物PCR擴(kuò)增后的檢測結(jié)果Fig.1 Results of D084 detection after PCR amplification with TR 1 primers

2.2 甜菜單胚不育系的混雜程度分析

本次試驗(yàn)鑒定的24個(gè)甜菜單胚不育系中混有保持系的株數(shù)及混雜率詳見表3。從表中可以看出,除了兩份改良的甜菜單胚不育系外,其余一直在使用的單胚不育系均沒有混雜的現(xiàn)象。

表3 甜菜單胚不育系混雜株數(shù)及其混雜率Tab.3 Number of confounding strains and their confounding rates

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,供試的24份甜菜單胚不育系材料中,有22份經(jīng)常使用的甜菜單胚不育系材料的不育程度達(dá)到100%,可以直接用于甜菜育種中;另外兩份由黑龍江大學(xué)新改良的單胚不育系出現(xiàn)了混雜的現(xiàn)象。

本研究對國內(nèi)三家育種機(jī)構(gòu)現(xiàn)有的部分甜菜單胚不育系材料進(jìn)行了不育系中是否混有保持系的鑒定,研究結(jié)果說明這些年來國內(nèi)對不育系和保持系的隔離采種效果明顯,抽樣調(diào)查結(jié)果表明,已經(jīng)應(yīng)用的不育系中沒有混進(jìn)保持系的現(xiàn)象。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了新改良的單胚不育系中仍存在混雜現(xiàn)象,說明在利用多胚改良單胚的過程中,成系之前一定要認(rèn)真的對不育系和保持系的育性進(jìn)行認(rèn)真的調(diào)查,在該不育系材料還沒有大量地應(yīng)用于育種實(shí)踐之前,應(yīng)及時(shí)將混雜株剔除,防止在授粉過程中由于不育系中混有保持系形成自交,導(dǎo)致雜交種不純的情況發(fā)生;同時(shí)也可以避免混雜的保持系給其它不育系授粉,嚴(yán)重影響雜交種育種進(jìn)程。