斑馬魚肝細(xì)胞癌模型研究的最新進(jìn)展

屈芷馨李憲美張峰華*

（1. 福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院消化道惡性腫瘤教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，肝癌已成為威脅人類健康的第六大癌癥類型，其死亡率高居第二［1］。 隨著世界人口的不斷增長(zhǎng)，人類對(duì)環(huán)境的破壞日益嚴(yán)重，肝癌的發(fā)病率及死亡率仍在持續(xù)上升。 肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種原發(fā)性肝癌，占所有肝癌病例的90% ～95%［2］。 由于病人早期不會(huì)表現(xiàn)出明顯癥狀，極少主動(dòng)就診，往往晚期才被確診，但已錯(cuò)失最佳治療時(shí)期。 早期診斷的肝癌腫瘤標(biāo)志物包括甲胎蛋白、凝血酶原等，但二者的升高也不排除是由妊娠、肝炎、肝硬化等原因?qū)е碌?，這給HCC 的早期診斷帶來了一定的挑戰(zhàn)。

目前，針對(duì)HCC 患者的治療手段比較有限，且存在一定的局限性。 一般認(rèn)為手術(shù)切除、肝移植以及局部消融等方式對(duì)于早期HCC 患者具有一定的臨床治療潛力。 然而，手術(shù)切除可能無法清除所有的肝癌細(xì)胞，肝移植也會(huì)受到供體肝數(shù)量的限制。對(duì)于直徑較小或位于肝深部的肝癌組織，局部射頻消融技術(shù)比較常用，該技術(shù)可在超聲或CT 引導(dǎo)下通過電極傳遞電磁能量，最終導(dǎo)致腫瘤熱壞死，但該技術(shù)對(duì)于組織較大或鄰近血管的腫瘤并不適用。中晚期肝癌患者一般需要通過放射性治療或化學(xué)藥物治療來維持一定的生活質(zhì)量并提高生存率，但這也僅僅是一種非治愈性療法，且常伴有嚴(yán)重的副作用，同時(shí)還存在耐藥性問題。 臨床上，有4 種較新的肝細(xì)胞癌化療藥物，包括一線藥物樂伐替尼，二線藥物瑞戈菲尼、雷莫蘆單抗及卡博替尼。 但不同患者對(duì)藥物的敏感性不一，因此建立合適的人源腫瘤異種移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型用于評(píng)估不同患者的藥物敏感性對(duì)于指導(dǎo)HCC患者的臨床用藥十分必要。

不論是新技術(shù)手段還是新藥開發(fā)，均需要利用動(dòng)物模型來驗(yàn)證其有效性或測(cè)試其毒副作用。 通常，利用小鼠模型可以獲得致癌基因誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，并揭示腫瘤微環(huán)境下癌細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)變化及對(duì)藥物的治療響應(yīng)情況。 但小鼠模型不可避免地會(huì)存在以下缺點(diǎn)和不足，如飼養(yǎng)成本高、可用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物數(shù)量有限、活體實(shí)時(shí)成像較為困難、不適合高通量篩選等。 斑馬魚因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以克服小鼠模型的不足，現(xiàn)已成為生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域不可或缺的一種模式生物，其在胚胎發(fā)育、毒理學(xué)、腫瘤生物學(xué)、遺傳育種以及藥物篩選等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。 本文綜述了近年來利用斑馬魚模型進(jìn)行肝細(xì)胞癌相關(guān)研究的最新成果，為肝癌研究提供參考。

1 斑馬魚用于構(gòu)建肝細(xì)胞癌模型的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)

斑馬魚（Danio rerio）是一種小型熱帶淡水魚，迄今為止已被用于構(gòu)建各種人類疾病模型，包括心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病以及包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的各種癌癥模型。相對(duì)于其他模式動(dòng)物而言，其被廣泛應(yīng)用于肝細(xì)胞癌模型研究的主要原因包括以下3 個(gè)方面。

首先，斑馬魚的肝發(fā)育過程、組織結(jié)構(gòu)及功能與人類高度相似。 斑馬魚的肝發(fā)生過程主要包括3 個(gè)階段：肝母細(xì)胞特化、出芽／分化以及肝生長(zhǎng)［3］。在結(jié)構(gòu)上可形成與人類肝相似的左右肝葉及肝內(nèi)膽管。 在功能上同樣發(fā)揮調(diào)節(jié)必需營(yíng)養(yǎng)素的消化和代謝、維生素的儲(chǔ)存、紅細(xì)胞的分解、血漿蛋白（如凝血酶原、纖維蛋白原等）的合成、白蛋白及荷爾蒙的產(chǎn)生，以及解毒等作用。

其次，調(diào)控斑馬魚肝發(fā)育及腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵基因及信號(hào)通路是保守的。 如FGF、BMP 和WNT 等信號(hào)通路均在斑馬魚肝發(fā)生中起關(guān)鍵作用［4－5］。 而人HCC 的致癌基因如KRAS、MYC、UHRF1 等同樣能夠誘導(dǎo)斑馬魚HCC 的發(fā)生［6－8］。 與人類高度相似的遺傳背景及組織器官發(fā)育模式，使得斑馬魚逐漸成為能夠模擬包括HCC 在內(nèi)的各種人類疾病的良好模式生物。

最后，斑馬魚超強(qiáng)的繁殖能力、小巧的體積、快速的發(fā)育過程、低廉的養(yǎng)殖成本等均是其能夠快速成為“科研新星”的重要原因。 而且，研究者已開發(fā)出無色素的全透明Casper品系［9］，利用該品系可以活體全程追蹤內(nèi)源或外源基因表達(dá)變化，以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、遷移情況，這是哺乳類模式動(dòng)物無法比擬的優(yōu)勢(shì)。 此外，斑馬魚學(xué)界已在Casper背景下開發(fā)出多種免疫缺陷突變體［10－11］，這使得利用斑馬魚成魚進(jìn)行腫瘤細(xì)胞移植，甚至構(gòu)建PDX 模型用于腫瘤精準(zhǔn)治療成為可能。

綜上所述，利用斑馬魚構(gòu)建HCC 遺傳模型或者異種移植模型優(yōu)勢(shì)非常明顯，如實(shí)驗(yàn)成本低、周期短、便于活體觀察、適用于高通量藥物篩選等。 基于這些優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于斑馬魚肝細(xì)胞癌模型研究的相關(guān)成果。

2 斑馬魚的遺傳學(xué)肝細(xì)胞癌模型

近年來，通過全基因組或者全外顯子組測(cè)序，可以鑒定出HCC 患者體內(nèi)與腫瘤形成可能相關(guān)的遺傳變異［12］，對(duì)這些變異進(jìn)行深入的功能研究將有助于揭示新的驅(qū)動(dòng)HCC 發(fā)生發(fā)展的基因突變，這是實(shí)現(xiàn)HCC 個(gè)性化治療的重要前提。

起初，研究者通過已知的化學(xué)致癌物，如7，12-二甲基苯并蒽（DMBA）來誘導(dǎo)斑馬魚HCC 的形成［13］。 但這種方法建模周期長(zhǎng)、個(gè)體差異大，不利于進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的深入研究。 于是研究者們開始利用遺傳學(xué)方法來建立斑馬魚HCC 模型，從而模擬人類HCC 中的突變［14］。

2.1 斑馬魚突變體相關(guān)的肝細(xì)胞癌模型

斑馬魚HCC 的形成過程與人類相似，都要經(jīng)過肝炎、脂肪變性、纖維化、畸形增生、癌變等步驟。2005 年，Sadler 等［14］通過遺傳篩選的手段從297 個(gè)斑馬魚突變體中篩選到了7 個(gè)突變體，其在發(fā)育至5 d 時(shí)肝明顯增大。 其中，vps18 突變體會(huì)出現(xiàn)肝腫大、空泡化，并伴有溶酶體缺失；腫瘤抑制基因nf2的突變體會(huì)出現(xiàn)膽總管囊腫；fgr突變體會(huì)出現(xiàn)肝細(xì)胞增大、脂肪變性。 這些突變體均可作為良好的肝疾病模型或者潛在的HCC 模型。

TP53 是調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其功能缺失與多種癌癥相關(guān)，而肝特異性缺失TP53會(huì)導(dǎo)致人HCC 的形成［15－17］。 斑馬魚中，tp53 突變體雖然不會(huì)自發(fā)發(fā)生HCC，但其在繼發(fā)性損傷存在時(shí)更易發(fā)展為HCC［18］。 乙肝病毒X 抗原（HBx）與HCC 的發(fā)生密切相關(guān)，Lu 等［19］發(fā)現(xiàn)在野生型斑馬肝中特異性過表達(dá)HBx 會(huì)導(dǎo)致脂肪變性、纖維化及糖原積累。 值得注意的是，如果在tp53 突變體中過表達(dá)HBx 卻能夠誘導(dǎo)HCC 的發(fā)生，且該過程與src酪氨酸激酶通路的激活有關(guān)。 與該機(jī)制相一致的是，在tp53 基因突變的背景下過表達(dá)src也會(huì)導(dǎo)致肝畸形增生、HCC 以及肉瘤樣HCC。 2021 年，Luo等［20］利用CRISPR／Cas9 技術(shù)在斑馬魚肝中特異性敲除了tp53 和pten，同樣證實(shí)了tp53 單一突變無法誘導(dǎo)HCC，而pten的缺失足以觸發(fā)HCC。 值得注意的是，與單突變的斑馬魚相比，pten和tp53 雙突變的斑馬魚HCC 發(fā)生率及組織學(xué)分級(jí)更高、且生存期更短。 該研究表明，雖然tp53 突變并非斑馬魚HCC的起始因子，但其突變使得斑馬魚對(duì)HCC 致病因子更為敏感，在HCC 的進(jìn)一步發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色。

Wnt／β-catenin 信號(hào)通路的異常激活與HCC 的發(fā)生有關(guān)，腫瘤抑制因子APC 的功能缺失會(huì)持續(xù)性激活Wnt／β-catenin 信號(hào)通路［21－22］。 小鼠肝特異性剔除Apc基因會(huì)導(dǎo)致Wnt／β-catenin 通路異常激活，從而發(fā)生HCC［23］。 斑馬魚中其同源基因apc的雜合突變體會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性肝腺瘤。 若利用DMBA 處理apc雜合突變體，其HCC 的發(fā)生率將從20.5%提高至70.8%［24］。 這些結(jié)果表明apc突變?cè)谟|發(fā)斑馬魚HCC 過程中發(fā)揮著重要作用，與小鼠和人中的基因功能保守性較強(qiáng)。

因此，對(duì)于不同HCC 患者，若臨床上篩查到新的可能導(dǎo)致HCC 的致癌突變，可利用斑馬魚進(jìn)行同源基因敲除，制備相應(yīng)突變體，從而快速驗(yàn)證其是否與HCC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.2 持續(xù)表達(dá)型轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝細(xì)胞癌模型

除了構(gòu)建基因功能缺失的突變體，研究者們還建立了多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型，用于研究特定基因過表達(dá)對(duì)HCC 發(fā)生發(fā)展的影響，研究者們大多通過轉(zhuǎn)入突變型致癌基因來建立HCC 模型［6，25-27］。

Ras原癌基因是參與癌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心調(diào)節(jié)因子，在多種類型的癌癥中會(huì)發(fā)生突變［28－30］。Nguyen 等［6］構(gòu)建了肝穩(wěn)定過表達(dá)致癌基因krasV12的轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型，該模型中krasV12的高表達(dá)激活了肝中Ras-Raf-MEK-ERK 及Wnt／β-catenin信號(hào)通路，觸發(fā)了HCC 的發(fā)生。 值得注意的是該轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的HCC 潛伏期相對(duì)較長(zhǎng)，在9 月齡的成魚中，HCC 的發(fā)生率也不到30%。 此外，tp53缺失可加速krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 的發(fā)生，但腫瘤發(fā)病率并沒有增加，這同樣證實(shí)tp53 突變并非斑馬魚HCC 的觸發(fā)因子，而在HCC 的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

極光激酶A（Aurora A，AURKA）是有絲分裂進(jìn)程的主要調(diào)節(jié)因子，對(duì)中心體成熟和紡錘體的穩(wěn)定起重要作用［31－32］。 近年來又發(fā)現(xiàn)其可通過激活上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ epithelial-mesenchymal transition，EMT）以及細(xì)胞干性重編程來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［33］。 2019 年，Su 等［25］構(gòu)建了AURKA（V352I）和AURKA（WT） 兩種轉(zhuǎn)基因斑馬魚，發(fā)現(xiàn)AURKA（V352I）轉(zhuǎn)基因斑馬魚在3 個(gè)月時(shí)便誘導(dǎo)出了纖維化標(biāo)志基因col1a1 的表達(dá)，7 個(gè)月形成HCC，而AURKA（WT）轉(zhuǎn)基因斑馬魚則需要9 個(gè)月才能進(jìn)展到HCC 階段。 該研究表明，突變型的AURKA（V352I）可能對(duì)于HCC 的早期發(fā)生具有重要作用。

β-catenin 是經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的重要組成部分，β-catenin 突變可能與HCC 的起始有關(guān)［34］。2015 年，Evason 等［26］在斑馬魚肝中特異性過表達(dá)爪蟾突變型β-catenin，在4 ～5 月齡時(shí)斑馬魚生存率顯著降低，部分個(gè)體表現(xiàn)出肝體積增大、肝細(xì)胞核膨大以及核輪廓不規(guī)則等組織學(xué)異常。 在6 月齡時(shí)斑馬魚肝結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，表現(xiàn)出與人類HCC 相似的病理學(xué)特征，因此，該品系可作為臨床上β-catenin 突變誘導(dǎo)的HCC 模型，用于相關(guān)藥物篩選或機(jī)制研究。

持續(xù)的病毒感染是HCC 形成的主要原因。HBx 是乙型肝炎病毒（HBV）的X 抗原，其過表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)HCC 的表型，且src可作為共同調(diào)節(jié)因子參與HBx 誘導(dǎo)的小鼠HCC 的發(fā)生［35－36］。 在TP53 缺失突變的背景下，同時(shí)過表達(dá)HBx 和src能夠誘導(dǎo)斑馬魚在5 月齡時(shí)出現(xiàn)HCC，高脂飲食飼養(yǎng)時(shí)，HCC 比例增加［27］。 值得注意的是，單獨(dú)過表達(dá)HBx 或src，僅能誘導(dǎo)斑馬魚肝細(xì)胞增生或畸形，但無法直接誘導(dǎo)出HCC 的表型。 這可能是因?yàn)榘唏R魚并非HBV 的宿主，體內(nèi)不存在相關(guān)受體。

持續(xù)表達(dá)型轉(zhuǎn)基因斑馬魚HCC 模型可很好地模擬人類HCC 的發(fā)生，并用于測(cè)試藥物的抗癌效果，也可作為潛在精準(zhǔn)醫(yī)療的藥物篩選平臺(tái)。 但持續(xù)過表達(dá)致癌基因，易導(dǎo)致胚胎缺陷，這將使研究長(zhǎng)期的癌癥進(jìn)展以及維持轉(zhuǎn)基因品系變得較為困難。

2.3 誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝細(xì)胞癌模型

為了克服上述持續(xù)表達(dá)型HCC 模型的缺點(diǎn)，研究者進(jìn)一步開發(fā)出了誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因HCC 模型，可控制致癌基因表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量，從而隨時(shí)控制腫瘤的起始及進(jìn)展。

Nguyen 等［37］、Emelyanov 等［38］嘗試使用米非司酮誘導(dǎo)的LexPR 系統(tǒng)控制krasV12在斑馬魚肝中特異性過表達(dá)。 研究者通過調(diào)整米非司酮的濃度可控制krasV12基因的表達(dá)水平，同時(shí)，通過控制何時(shí)加入米非司酮，可實(shí)現(xiàn)在斑馬魚任意發(fā)育階段啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生［37］。 研究發(fā)現(xiàn)，利用2 μmol／L 米非司酮處理krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚1 個(gè)月后，可100%誘導(dǎo)出HCC。 值得注意的是，撤除米非司酮后，HCC 的表型可恢復(fù)。 除了krasV12轉(zhuǎn)基因斑馬魚，研究者們還建立了其他基因的米非司酮誘導(dǎo)表達(dá)品系，如tgfβ1a轉(zhuǎn)基因品系、myca和mycb轉(zhuǎn)基因品系［39－40］等。

四環(huán)素誘導(dǎo)的Tet-on 系統(tǒng)是斑馬魚HCC 模型中另一個(gè)常用的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，被用于控制krasV12、xmrk和小鼠Myc等基因在斑馬魚肝中特異性表達(dá)［7，41－43］。 Xmrk 是劍尾魚黑色素瘤受體激酶，其蛋白結(jié)構(gòu)與人表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）高度相似，在肝癌發(fā)生中起著重要作用［44］。 癌基因Myc與HCC 不良預(yù)后相關(guān)，被認(rèn)為是人類肝腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵［45］。 在四環(huán)素誘導(dǎo)后，上述3 種轉(zhuǎn)基因品系均表現(xiàn)出肝迅速腫大，以及肝腫瘤形成。 其中krasV12和xmrk品系誘導(dǎo)的大部分腫瘤可進(jìn)展為HCC，而小鼠Myc誘導(dǎo)的則大多是肝細(xì)胞腺瘤。

單一致癌基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因模型可以穩(wěn)定地誘導(dǎo)斑馬魚HCC，但腫瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象甚少發(fā)生。Twist 是一種堿性的螺旋－環(huán)－螺旋轉(zhuǎn)錄因子，與癌癥患者的低生存率相關(guān)，在誘導(dǎo)EMT 過程中發(fā)揮重要作用［46］。 2020 年，Nakayama 等［47］構(gòu)建了米非司酮誘導(dǎo)的Twist1-ERT2／xmrk雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚，在三苯氧胺處理時(shí)，約80%的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚通過誘導(dǎo)EMT 在5 d 內(nèi)發(fā)生肝癌細(xì)胞擴(kuò)散，甚至長(zhǎng)距離遷移到軀干和尾部，在部分魚中，甚至還觀察到了繼發(fā)性腫瘤的建立。 類似地，twist1a ／krasV12雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚也表現(xiàn)出自發(fā)的腫瘤轉(zhuǎn)移， 脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 處理可增加腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移［48］。

結(jié)合上述兩種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)可有選擇性地激活不同的致癌基因，這種策略不但可以研究多種候選基因的致癌功能，還可以有效規(guī)避誘導(dǎo)物對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的可能干擾。 值得注意的是，單一的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)依賴于誘導(dǎo)物的持續(xù)暴露，這通常會(huì)導(dǎo)致斑馬魚所有的肝細(xì)胞全部發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，與人類癌癥發(fā)生的實(shí)際情況不符。 結(jié)合米非司酮誘導(dǎo)的krasV12模型和Cre／loxP 系統(tǒng)，只需短暫暴露于米非司酮，便可誘導(dǎo)Cre-loxP 介導(dǎo)的永久性基因組重組［49］。 由于Cre 酶介導(dǎo)的基因組重組往往是不完全的，可使krasV12在肝部分細(xì)胞中特異性表達(dá)。 在這個(gè)誘導(dǎo)系統(tǒng)中，斑馬魚肝會(huì)出現(xiàn)不同的腫瘤結(jié)節(jié)，腫瘤病變過程與經(jīng)致癌物處理的斑馬魚十分相似，能夠更好地模擬人類HCC 的形成過程。 因此，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需要明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)來建立斑馬魚HCC 模型。

3 斑馬魚的肝細(xì)胞癌異種移植模型

構(gòu)建腫瘤異種移植模型是研究腫瘤進(jìn)展和測(cè)試新療法的重要途徑。 相較于遺傳學(xué)模型，異種移植模型的造模周期更短，且供體細(xì)胞多為人源腫瘤細(xì)胞系或來自于患者的腫瘤組織，更利于測(cè)試人的腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，因此臨床應(yīng)用前景更廣闊。

大多數(shù)斑馬魚HCC 異種移植模型使用永生化細(xì)胞系作為供體，評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管新生、腫瘤微環(huán)境等。

3.1 斑馬魚幼魚的肝細(xì)胞癌異種移植模型

斑馬魚受精后1 個(gè)月左右后天免疫系統(tǒng)才完全發(fā)育成熟［50］。 所以，異種移植腫瘤細(xì)胞到斑馬魚幼魚體內(nèi)，可免受免疫系統(tǒng)排斥，移植成功率較高。

目前，多數(shù)研究選擇將人肝癌細(xì)胞系注射到受精后2 d（days post fertilization，dpf）的幼魚卵黃囊以評(píng)估其體內(nèi)增殖能力，并測(cè)試藥物對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制能力［51－53］。 2016 年，Tseng 等［51］將Huh7 細(xì)胞注射到2 dpf 的斑馬魚幼魚卵黃囊，并用不同濃度的茚［1，2-b］喹喔啉衍生物處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能夠在斑馬魚內(nèi)體發(fā)揮良好的抗腫瘤效果。 采用類似的方法，Liu 等［52］和Xu 等［53］又分別發(fā)現(xiàn)苦豆堿和茶褐素對(duì)HCC 細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用。

研究者也可通過對(duì)HCC 細(xì)胞系進(jìn)行目的基因敲降或過表達(dá)后，再構(gòu)建異種移植模型，從而評(píng)估基因?qū)δ[瘤轉(zhuǎn)移能力的影響［54－56］。 甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2β（MAT2B）基因在肝癌組織中高表達(dá)，并且在臨床上與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。 2019 年，Wu 等［54］在多種HCC 細(xì)胞系中敲降MAT2B基因，然后構(gòu)建斑馬魚HCC 異種移植模型。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默MAT2B可通過部分抑制EGFR 信號(hào)通路抑制HCC 細(xì)胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和侵襲，提示MAT2B可以作為HCC 新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。 2021 年，Akbari 等［55］構(gòu)建了過表達(dá)G 蛋白偶聯(lián)受體5（LGR5）的Huh7 細(xì)胞系，并將其植入斑馬魚卵黃囊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)LGR5 時(shí)Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)移率更高。 采用類似方法，研究者發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞系SNU-449 中過表達(dá)HOX 轉(zhuǎn)錄物反義基因間RNA（HOTAIR）基因會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)移［56］。

除了評(píng)估肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的增殖與轉(zhuǎn)移能力，斑馬魚異種移植模型同樣適用于評(píng)估腫瘤細(xì)胞引起的血管新生。 2016 年，Tonon 等［57］將具有較強(qiáng)侵襲性的人HCC 細(xì)胞株JHH6 注射到2 dpf 的血管綠色熒光品系斑馬魚幼魚卵黃囊，通過熒光觀察及血管染色，并對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體基因進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)該模型可重現(xiàn)肝細(xì)胞癌的促血管生成能力，且該模型可用于測(cè)試血管新生相關(guān)藥物如硼替佐米的抗HCC 效果。

斑馬魚幼魚異種移植模型還可用于進(jìn)行規(guī)?；幬锖Y選。 2020 年，Nakayama 等［47］利用轉(zhuǎn)移性HCC 斑馬魚模型從67 種FDA 批準(zhǔn)的藥物中篩選出一種HSD11β1 的抑制劑——腎上腺甾酮，并證實(shí)腎上腺甾酮的確可通過抑制HSD11β1 的表達(dá)來抑制HCC 的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

雖然利用斑馬魚幼魚構(gòu)建腫瘤異種移植模型已經(jīng)取得了一定的成效，但該模型仍存在一定的局限性。 首先，注射到卵黃囊的腫瘤細(xì)胞無法與周圍的組織細(xì)胞進(jìn)行交互，難以模擬體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的真實(shí)環(huán)境。 因此，迫切需要評(píng)估斑馬魚胚胎不同移植部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移以及血管新生的影響，以確定合適的研究方法。 其次，斑馬魚后天免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟后，移植的腫瘤細(xì)胞終將被殺死。 因此，針對(duì)幼魚腫瘤移植模型的研究只能局限在較短時(shí)間內(nèi)，不利于研究腫瘤發(fā)展的長(zhǎng)期過程。 最后，斑馬魚幼魚體積較小，每次只能植入幾十到幾百個(gè)細(xì)胞，往往這些細(xì)胞是不包含腫瘤干細(xì)胞的，這使得移植的腫瘤細(xì)胞難以持續(xù)生長(zhǎng)。 在優(yōu)化斑馬魚幼魚腫瘤細(xì)胞移植方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行PDX 模型的構(gòu)建，并測(cè)試特定患者對(duì)臨床藥物的敏感性，將會(huì)推動(dòng)斑馬魚PDX 模型的臨床應(yīng)用。

3.2 斑馬魚成魚的肝細(xì)胞癌異種移植模型

為了克服上述幼魚模型的局限性，研究者們開發(fā)了斑馬魚成魚的腫瘤異種移植模型，此模型必須使用免疫抑制或免疫缺陷的成魚作為受體［10，58－65］。構(gòu)建免疫抑制或免疫缺陷成魚常用的物理化學(xué)方法包括利用γ 射線或地塞米松等藥物抑制免疫細(xì)胞功能，遺傳學(xué)方法主要是通過敲除免疫相關(guān)功能基因，構(gòu)建免疫缺陷斑馬魚突變品系。

斑馬魚對(duì)γ 射線的生物反應(yīng)與哺乳動(dòng)物非常相似，研究發(fā)現(xiàn)，在大約20 Gy 的輻照劑量下，斑馬魚淋巴組織內(nèi)的細(xì)胞在1 周內(nèi)大部分會(huì)被消融，但這并不是永久性的，所有造血細(xì)胞會(huì)在1 個(gè)月內(nèi)恢復(fù)。 接受輻照處理的斑馬魚在僅移植5 × 103個(gè)白血病細(xì)胞時(shí)便可出現(xiàn)明顯的惡性轉(zhuǎn)化，而未接受輻照處理的斑馬魚在植入高達(dá)5 × 106個(gè)白血病細(xì)胞后也未出現(xiàn)白血病表型，提示植入的白血病細(xì)胞可能遭到受體免疫系統(tǒng)排斥并被清除［58］。

除了利用物理射線抑制免疫系統(tǒng)功能，有研究者使用化學(xué)藥物地塞米松處理斑馬魚，發(fā)現(xiàn)其淋巴細(xì)胞功能可被顯著抑制，在植入人乳腺癌細(xì)胞（MDA-435）、纖維肉瘤細(xì)胞（HT1080）以及小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）后，出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞侵襲、血管新生及致死效應(yīng)［59］。 2019 年，Khan 等［60］嘗試使用白消安抑制斑馬魚成魚髓系系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)可以提高肝細(xì)胞癌和急性髓系白血病細(xì)胞的移植成功率，在移植15 d 后，腫瘤細(xì)胞依然可以正常存活。

相對(duì)于通過物理方式或化學(xué)藥物抑制斑馬魚免疫系統(tǒng)，直接構(gòu)建免疫缺陷突變體更具有應(yīng)用前景。 2014 年，Tang 等［61］構(gòu)建了斑馬魚rag2E450fs突變體，該突變體缺乏成熟的功能性T 細(xì)胞，且B 細(xì)胞數(shù)量顯著減少，但其生存能力和繁殖能力基本不受影響。 不但造血干細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等正常細(xì)胞可以在rag2E450fs突變體中穩(wěn)定存活，包括白血病細(xì)胞、橫紋肌肉瘤細(xì)胞以及黑色素瘤細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞同樣可在其體內(nèi)穩(wěn)定生長(zhǎng)。

Prkdc基因編碼DNA 依賴性蛋白激酶催化亞基，其在DNA 非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)中發(fā)揮重要作用。 2016 年，Jung等［62］利用TALENs 技術(shù)敲除了斑馬魚prkdc基因，發(fā)現(xiàn)prkdc缺失突變體的V（D）J 重排缺陷，導(dǎo)致B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞分化停滯，該模型可用于移植人的多種腫瘤細(xì)胞。 2016 年，Sertori 等［63］發(fā)現(xiàn)敲降斑馬魚白細(xì)胞介素-2 受體γ 鏈基因il2rga會(huì)影響幼魚早期T 淋巴細(xì)胞的成熟，但不會(huì)影響B(tài) 細(xì)胞的成熟，且敲降下游酪氨酸激酶編碼基因jak3 會(huì)出現(xiàn)類似的結(jié)果。 2022 年，Sertori 等［64］和Basheer等［65］分別利用TALENs 和CRISPR／Cas9 技術(shù)敲除了斑馬魚il2rga及jak3 基因，證實(shí)二者的缺失突變均可影響T 淋巴細(xì)胞及NT 細(xì)胞的成熟，將人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 移植到il2rga突變體中，18 d 后仍能觀察到大量的腫瘤細(xì)胞。

2019 年，Yan 等［10］在缺乏色素細(xì)胞的Casper品系的背景下構(gòu)建了prkdc及il2rga的雙敲除突變體，該品系同時(shí)缺失了T、B 及NT 細(xì)胞，通過馴化使其能夠適應(yīng)37℃的飼養(yǎng)環(huán)境。 該品系不但可以用于構(gòu)建多種人類腫瘤細(xì)胞系移植模型，而且適用于構(gòu)建患者來源的腫瘤移植（PDX）模型。 通過病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該模型中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)及組織學(xué)特征與移植到NSG 小鼠中十分相似。 2020 年，Lv等［11］構(gòu)建了foxn1／Casper突變體斑馬魚品系，其表現(xiàn)出T 細(xì)胞缺陷，允許包括造血干細(xì)胞、肌肉等多種細(xì)胞類型的同種異體及異種移植，但其是否適用于人的腫瘤細(xì)胞移植尚未經(jīng)過驗(yàn)證。

4 斑馬魚肝細(xì)胞癌模型的應(yīng)用

HCC 是一種復(fù)雜的、異質(zhì)性較強(qiáng)的腫瘤，常常存在多種遺傳變異。 這些變異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控異常，觸發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化和增殖。 斑馬魚的遺傳背景及肝結(jié)構(gòu)與人類高度相似，且易于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因和基因突變等功能研究，是研究HCC 發(fā)生發(fā)展具體機(jī)制以及開發(fā)HCC 新療法的良好模型?；诎唏R魚開發(fā)的HCC 模型存在但不限于以下4個(gè)方面的應(yīng)用。

第一，斑馬魚HCC 模型可用于評(píng)估相關(guān)物質(zhì)的致癌能力。 4-氨基聯(lián)苯（4-ABP）是一種人類致癌物，會(huì)引起DNA 氧化損傷，抑制DNA 修復(fù)。 2022 年，Lin等［66］用Tg（fabp10a：HBx，src，p53－／－）斑馬魚HCC模型，發(fā)現(xiàn)低劑量反復(fù)暴露于4-ABP 可激活肝中Ras-ERK 通路，誘導(dǎo)或促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生。

第二，通過構(gòu)建斑馬魚遺傳學(xué)HCC 模型可以進(jìn)行HCC 的發(fā)病機(jī)制研究，挖掘新的治療靶點(diǎn)。 2019年，Yang 等［67］在TO（krasG12V）誘導(dǎo)型斑馬魚HCC模型的背景下敲除了瘦素受體基因lepr，發(fā)現(xiàn)敲除lepr的斑馬魚經(jīng)誘導(dǎo)HCC 后的存活率顯著提高，且肌肉萎縮的水平顯著降低，提示瘦素信號(hào)可作為HCC 患者肌肉萎縮的一個(gè)新的治療靶標(biāo)。

第三，斑馬魚HCC 模型可用于評(píng)估藥物對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響，進(jìn)行藥物篩選。 斑馬魚模型是高通量的體內(nèi)研究模型，可以將腫瘤新藥的體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，提高臨床前藥物開發(fā)的成功率，降低篩選過程所需的時(shí)間和成本。 二甲雙胍（metformin）是治療糖尿病的一種藥物，de Oliveira等［68］利用Tg（fabp10a：pt-β-cat）斑馬魚模型發(fā)現(xiàn)，高脂飲食會(huì)促進(jìn)HCC 的進(jìn)展，而二甲雙胍可以調(diào)節(jié)肝微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，進(jìn)而抑制飲食誘導(dǎo)的NASH 相關(guān)HCC 進(jìn)展。

第四，利用斑馬魚構(gòu)建患者來源的腫瘤細(xì)胞移植模型，可加快精準(zhǔn)醫(yī)療的進(jìn)程。 體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系容易丟失腫瘤異質(zhì)性和原發(fā)性腫瘤的基因特征，而PDX 模型使用患者來源的腫瘤細(xì)胞，可以保留原代腫瘤的大部分特征，具有較為精確的臨床療效預(yù)測(cè)性。 2022 年，Ali 等［69］構(gòu)建了39 例非小細(xì)胞肺癌患者的斑馬魚PDX 模型，并測(cè)試了其對(duì)埃羅替尼及紫杉醇等藥物的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該模型不但可以在3 d 內(nèi)給出準(zhǔn)確的療效評(píng)估，還可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞的淋巴管轉(zhuǎn)移。

5 總結(jié)與展望

肝細(xì)胞癌是一種原發(fā)性惡性腫瘤，早期診斷比較困難，患者化療效果較差，且其高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移率的特點(diǎn)常導(dǎo)致患者預(yù)后不良。 因此，迫切需要開發(fā)并建立良好的HCC 動(dòng)物模型用于新藥篩選及抗腫瘤藥效評(píng)估。 斑馬魚繁殖能力強(qiáng)、易于飼養(yǎng)、胚胎透明、體外發(fā)育、后天免疫系統(tǒng)成熟較晚、遺傳背景以及組織器官的發(fā)育與人類高度相似等優(yōu)點(diǎn)使其成為構(gòu)建各種人類疾病模型的良好模式生物。 通過在肝中過表達(dá)xmrk、HBx、myc、krasG12V等基因，結(jié)合米非司酮／四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)或Cre-loxP 系統(tǒng)，已經(jīng)建立了多種組成型或誘導(dǎo)型斑馬魚HCC 模型［7，36，43，49］。 斑馬魚后天免疫系統(tǒng)在30 d 左右才發(fā)育成熟，且目前基于Casper背景已開發(fā)出多種免疫缺陷突變體，利用斑馬魚進(jìn)行腫瘤細(xì)胞移植，甚至構(gòu)建PDX 模型用于腫瘤精準(zhǔn)治療已成為可能［10－11，69］。 構(gòu)建斑馬魚HCC 模型已經(jīng)成為研究肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制、開發(fā)新的治療靶點(diǎn)以及進(jìn)行新藥篩選的強(qiáng)有力手段。

盡管利用斑馬魚HCC 模型已經(jīng)取得了許多研究進(jìn)展，但該模型仍存在一定的局限性。 第一，斑馬魚肝與人類肝雖然功能相似，但結(jié)構(gòu)上存在一定的差異。 例如，斑馬魚肝中不存在Kupffer 細(xì)胞，且門靜脈、肝動(dòng)脈和大膽管在肝實(shí)質(zhì)內(nèi)隨機(jī)分布，不像哺乳動(dòng)物肝那樣歸為門管區(qū)。 因此，在今后的研究中需更加關(guān)注斑馬魚肝的微結(jié)構(gòu)，明確其功能分區(qū)或異質(zhì)性，以更加準(zhǔn)確地模擬人類HCC。 第二，斑馬魚的肝很小，可用于實(shí)驗(yàn)分析的組織較少。 這就要求研究人員需要充分整合優(yōu)化現(xiàn)有技術(shù)或者開發(fā)出更加精確、可針對(duì)微量樣本的新技術(shù)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。 第三，在斑馬魚中，基于抗體的檢測(cè)結(jié)果有時(shí)無法重復(fù)驗(yàn)證。 這可能是因?yàn)槟軌蜃R(shí)別斑馬魚抗原的抗體十分有限，而在一些研究中使用了非斑馬魚特異性的抗體來進(jìn)行檢測(cè)。 因此，持續(xù)開發(fā)斑馬魚特異性的抗體仍然是一項(xiàng)任重道遠(yuǎn)的任務(wù)，聯(lián)合相關(guān)企業(yè)進(jìn)行共同開發(fā)或許會(huì)更快解決制約斑馬魚研究發(fā)展的這一瓶頸。

斑馬魚HCC 異種移植模型存在以下問題亟待優(yōu)化：首先，斑馬魚適宜的飼養(yǎng)溫度是28.5℃，這與人體生理溫度有較大差距，腫瘤細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的增殖速度和組織學(xué)特征亦與人類不完全相同。當(dāng)前的大部分研究都是在非生理溫度下進(jìn)行的，因此將斑馬魚馴化至適應(yīng)37℃飼養(yǎng)環(huán)境或許能夠更好地模擬HCC 細(xì)胞的生存條件；其次，斑馬魚血管無法完全模擬人HCC 的動(dòng)脈血供應(yīng)。 目前，通過生化／顯微成像／免疫學(xué)分析可以模擬HCC 細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境特征，但尚無有效手段模擬HCC 的動(dòng)脈樣供血。 因此，在進(jìn)行HCC 血管生成相關(guān)研究時(shí)，建議使用至少2 種細(xì)胞系，以提高研究結(jié)論的準(zhǔn)確性。最后，斑馬魚HCC 異種移植的注射部位通常是胚胎卵黃囊或成魚腹腔，而非肝。 這使得HCC 細(xì)胞在非肝環(huán)境中生長(zhǎng)，無法排除斑馬魚體內(nèi)其他因素的干擾，實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性有待提升。 因此，如何改善實(shí)驗(yàn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)斑馬魚肝腫瘤細(xì)胞原位移植是值得相關(guān)研究者關(guān)注的重點(diǎn)方向之一。