來曲唑對幼年動物的發(fā)育毒性及機制研究進展

付莉莉，魏麗萍，劉楚喬，陶巧玉，張鵬，邱云良

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.益諾思生物技術南通有限公司，江蘇 南通 226000；3.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；4.上海益諾思生物技術股份有限公司，上海 201203；5.江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西 南昌 330000）

芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors，AI）被批準僅用于緩解或輔助治療絕經后女性雌激素受體陽性乳腺癌［1］。芳香化酶是一種細胞色素P450酶，是雌激素生物合成的限速酶，在性腺、骨、脂肪基質細胞和中樞神經系統等廣泛表達，可催化雄烯二酮和睪酮（testosterone，T）分別生成雌酮和雌二醇（estradiol，E2）［2］。AI 藥物共有3 代，前兩代甾體類AI（第一代的睪內脂、氨魯米特，第二代的福美可坦）因不良反應較多而很少使用；第三代非甾體AI如來曲唑（letrozole）、阿那曲唑（anastrozole）是目前常用的高效、可逆、安全的藥物。由于來曲唑抑制芳香化酶活性，降低雌激素水平，從而延緩骨齡進展、增加生長年限、改善成年身高，自20世紀80年代以來，已被輔助用于兒童和青少年的其他疾病的治療，如兒童矮小癥、體質性青春期生長發(fā)育延遲及性早熟等［3-7］。但臨床發(fā)現，來曲唑在兒童中的使用存在不良反應風險。王春林等［8］發(fā)現，來曲唑主要藥物不良反應風險有肝、腎功能障礙，脂質代謝紊亂，高雄激素血癥，生殖系統和骨代謝紊亂等，但是關于其對男性生殖系統損害和骨代謝的長期影響目前還不清楚。由于來曲唑對兒童臨床及非臨床發(fā)育毒性的研究結果存在爭議，且目前關于來曲唑對生殖系統、認知功能和骨代謝毒性機制尚不清楚，本文擬綜述來曲唑對幼年動物的發(fā)育毒性及其可能機制，為其在臨床兒科更安全有效的使用提供依據。

1 對幼年動物的發(fā)育毒性

來曲唑可抑制芳香化酶活性，降低E2水平，E2的降低可引起睪丸形態(tài)異常、生精小管及間質組織的改變，還會降低骨密度，對骨代謝的平衡造成影響；此外，還會造成認知功能損傷和神經細胞凋亡。從而可對幼年動物的生殖系統、骨代謝和認知功能產生影響。

1.1 生殖系統

來曲唑特異性抑制芳香化酶，造成性激素及促性腺激素異常，從而干擾下丘腦-垂體-性腺軸的調節(jié)。Pilutin 等［9］研究表明，來曲唑影響雄性和雌性大鼠的生育能力，劑量低至每天3 μg·kg-1就可使幼鼠出現垂體肥大及睪丸異常。陳力力等［10］研究表明，來曲唑影響幼豬睪丸生精小管細胞的生長發(fā)育。Pouliot等［11］研究報道，來曲唑對幼年雄性大鼠睪丸和精子活力有影響，對雌性大鼠的子宮和陰道發(fā)育也有影響。

1.2 骨代謝

來曲唑可通過調節(jié)幼年動物的骨代謝和骨轉化對骨密度產生影響。有研究發(fā)現，來曲唑可顯著升高幼年大鼠骨中NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）的水平［12-13］。Mohamed 等［14］研究顯示，來曲唑可顯著降低幼年大鼠E2水平、Ⅰ型原膠原N 端前肽（propeptide of typeⅠprocollagen，PINP）水平和股骨骨密度，增加T水平。Kalam等［15］研究發(fā)現，來曲唑會降低幼年小鼠堿性磷酸酶水平，增加抗酒石酸酸性磷酸酶水平。表明成骨細胞中RANKL 的增加和PINP 的降低，以及破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶的增加，可能是由于來曲唑抑制芳香化酶活性而造成性類固醇激素異常。雖然來曲唑對幼年動物骨代謝存在一定不良反應，但其對兒童骨骼健康的影響尚不清楚，需進一步研究。

1.3 認知功能

芳香化酶在大腦額葉和顳葉高度表達，這些區(qū)域通常與學習、記憶、感覺處理（顳葉）和多巴胺能活動（額葉）有關［16］。芳香化酶編碼基因CYP19A1是人類閱讀、言語和語言等認知功能的候選調控基因，調控大腦和認知功能。有研究表明，顳葉神經元能通過雄激素前體的芳構化在局部合成雌激素［17］，而雌激素受體β 在人腦的海馬區(qū)大量表達，這一區(qū)域被認為是記憶功能的重要區(qū)域。由此可見，來曲唑可抑制芳香化酶，導致E2水平降低，從而影響E2對認知功能的調節(jié)作用。

來曲唑對幼年動物認知功能影響的研究比較匱乏，從藥理作用及成年動物的研究可推測其對幼年動物認知功能具有影響。Gervais 等［18］發(fā)現，經來曲唑治療的狨猴血液循環(huán)中E2減少，而海馬內E2增加，海馬神經元的空間工作記憶和內源性興奮性降低。Marbouti 等［19］研究發(fā)現，來曲唑能顯著降低雌、雄大鼠海馬E2水平，導致大鼠認知功能下降。然而Pouliot 等［11］等研究未發(fā)現來曲唑對幼年大鼠神經行為功能有不良影響。鑒于來曲唑可通過血腦屏障，理論上來曲唑治療可能導致認知功能障礙，該問題有必要進行深入研究。

1.4 其他

來曲唑主要通過肝代謝，可加快肝酶對高密度脂蛋白膽固醇的代謝，導致高密度脂蛋白膽固醇降低，有增加心血管疾病的風險［20］。臨床試驗表明，來曲唑治療對血清胰島素、空腹血糖、三酰甘油無不良影響［21-23］。然而，雌性大鼠在青春期前連續(xù)90 d 給予高劑量來曲唑治療后，出現胰島素敏感性降低和脂肪細胞增大［24］。

2 對幼年動物發(fā)育毒性的機制

來曲唑對幼年動物發(fā)育毒性的機制可能與其藥理作用有關。E2降低會影響睪丸細胞的發(fā)育成熟、體內性激素及促性腺激素的表達以及睪丸組織中雌激素受體的表達及分布，同時還會增加RANKL 誘導破骨細胞的增殖、分化及成骨細胞的凋亡、氧化應激、NF-κB 活性；此外，還會干擾E2調節(jié)海馬經典及非經典效應，降低星形膠質細胞對谷氨酸（glutamic acid，Glu）的吸收，減少L 型鈣通道阻滯胱天蛋白酶3活化等。

2.1 對雄性動物生殖毒性機制

2.1.1 影響睪丸細胞發(fā)育成熟

睪丸生殖細胞、間質細胞及支持細胞都含有芳香化酶［25］。雄性哺乳動物的E2是由芳香化酶催化睪丸組織中的T 產生的，抑制雄性哺乳動物芳香化酶活性會對雄性哺乳動物生殖系統的發(fā)育和功能產生不利影響［26］。研究表明，來曲唑可引起內源性雌激素減少，進而導致動物交配次數減少，抑制雄性動物睪丸內精子的發(fā)生［27］。有研究發(fā)現，芳香化酶功能基因缺失的雄性小鼠內源性雌激素減少的同時，睪丸內精子發(fā)生受到破壞［28］。還有研究顯示，來曲唑影響雄性冠毛獼猴和成年大鼠附睪內梭形精子的成熟［29］。這些研究結果表明，來曲唑對雄性動物睪丸精子的發(fā)生及生殖細胞的分化、成熟有重要影響，但其如何影響睪丸支持細胞的生長發(fā)育未見報道。來曲唑對雄性動物睪丸支持細胞和生殖細胞生長發(fā)育的作用機制需深入研究。

2.1.2 影響體內性激素及促性腺激素的表達

雄激素可刺激雄性生殖器官發(fā)育與成熟，維持生精作用；雌激素可促進性未成熟大鼠睪丸生殖細胞增殖、分化和成熟，還參與精子的發(fā)生和精母細胞的成熟。當芳香化酶活性受到抑制時，性未成熟大鼠雌激素減少，生精功能受損。

研究發(fā)現，芳香化酶功能受損的雄性小鼠體內雌激素含量顯著降低，睪丸生殖細胞增殖受到抑制，附睪組織中梭形精子細胞異常，成熟精子細胞凋亡加速［30］。Berger 等［31］發(fā)現，1 周齡幼年雄豬投喂來曲唑6周后，體內E2含量顯著降低，而T含量顯著升高。陳釗等［32］研究發(fā)現，來曲唑能促進雄性幼豬睪丸支持細胞增殖，減少生精細胞數量，且幼豬體內E2和黃體生成素水平下降，而卵泡刺激素和T水平顯著升高。推測可能是來曲唑抑制芳香化酶活性，導致體內E2含量降低，T 含量升高，從而干擾了下丘腦-垂體-性腺軸對精子發(fā)生的調節(jié)，負反饋促進促卵泡激素分泌，抑制促黃體生成素分泌。

2.1.3 影響睪丸組織中雌激素受體表達及分布

雌激素也存在于男性體內，其內源性主要來源是睪丸。睪丸中的芳香化酶催化T轉化為E2。E2信號轉導需要與其特異性受體相互作用，以調節(jié)精子的發(fā)生和精子的成熟［33］。陳釗等［34］發(fā)現，來曲唑能降低豬體內E2含量，導致ERα 和ERβ 表達降低，進而導致“雌激素-雌激素受體復合體”表達降低，導致豬睪丸生殖細胞減少。可見，來曲唑使芳香化酶失活，從而干擾睪丸組織中雌激素信號的表達。

2.2 骨毒性機制

性類固醇激素主要包括雌激素、雄激素和孕激素。雌激素和雄激素來源于膽固醇，它們在骨骼代謝中發(fā)揮重要作用。研究顯示，雌激素與骨的生成和代謝密切相關［35］。細胞水平研究表明，破骨細胞和成骨細胞表面均存在ER，雌激素可抑制破骨細胞的分化、成熟和骨吸收作用；同時，雌激素也可通過抑制成骨細胞凋亡延長成骨細胞壽命［36］，使得骨吸收和骨形成處于平衡狀態(tài)。

雌激素主要通過骨保護素（osteoprotegerin，OPG）/RANKL/RANK 信號通路，以及調節(jié)成骨細胞或骨髓單核細胞的白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、巨噬細胞集落刺激因子和前列腺素的產生，抑制破骨細胞的增殖、分化及其活性［37-38］。

雌激素主要通過抑制細胞凋亡、抑制氧化應激和降低NF-κB 活性，直接影響成骨細胞的骨形成。在細胞水平上，雌激素通過激活非受體型蛋白酪氨酸激酶/編碼SH 結構域的基因的蛋白產物/細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal regulating kinase，ERK）信號通路，誘導轉錄因子ETL 樣蛋白1、CCAAT/增強因子結合蛋白β 氧化磷酸化［39］和下調c-Jun N 端激酶介導的c-Jun/激活劑蛋白1 活性，導致關鍵轉錄因子活性的改變［40］，進而抑制成骨細胞凋亡，增加成骨細胞活性。研究表明，E2通過ERβ/糖原合成酶激酶-3β 依賴的Wnt/β-聯蛋白信號通路誘導增殖和分化相關基因表達，抑制氧化應激反應，從而促進成骨細胞的增殖和分化［41］。Chang 等［42］研究顯示，雌激素與ER 結合能夠抑制NF-κB 信號通路，導致NF-κB 活性降低。NF-κB 的抑制導致fos 相關抗原1（fos-related antigen-1，Frα-1）表達增加，而Frα-1 是體內外參與骨基質形成的重要轉錄因子。

來曲唑可通過抑制芳香化酶活性間接降低雌激素，從而影響OPG/RANKL/RANK 信號通路及骨骼系統和免疫系統分泌的細胞因子、趨化因子及轉錄因子的表達，導致破骨細胞骨吸收增加；同時，雌激素的降低也會增加成骨細胞的細胞凋亡、氧化應激和NF-κB 活性，進而降低成骨細胞的活性，減少骨形成。因此推測，來曲唑對骨代謝影響的作用機制為間接降低雌激素、增加破骨細胞的骨吸收和導致成骨細胞骨形成不足。

2.3 認知功能毒性機制

芳香化酶在嚙齒類動物大腦不同區(qū)域高表達，并將T 轉化為E2，E2在下丘腦、杏仁核、海馬體和大腦皮質的濃度很高。E2對整個生命周期的大腦發(fā)育和功能有一系列不同影響，包括促進各種認知能力的發(fā)展和維持［43］。來曲唑通過血腦屏障分布到大腦并影響局部E2合成［44］，可能對認知功能產生有害作用。

雌激素對海馬發(fā)育的作用主要為激素-激素受體復合物與DNA 結合的類型（經典效應）和不結合的類型（非經典效應）［45］。經典效應是通過E2-ER復合物與DNA 上的雌激素反應元件（estrogen response element，ERE）的結合來介導，導致基因轉錄和蛋白質合成（圖1）。雌激素對細胞功能的非經典效應是獨立于細胞核中ERE 發(fā)生的（圖1），可以由細胞膜處或細胞膜附近的細胞內ER 或由細胞膜結合的ER 介導。在ERK 下游，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）介導的蛋白合成也對E2的記憶增強作用及E2對CA1 樹突棘密度的促進作用至關重要。ERK 也通過H3 乙?；铜h(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）磷酸化參與E2對基因轉錄的影響。Wnt/β-聯蛋白信號可能也在E2的記憶增強效應中發(fā)揮作用，但涉及的機制尚不清楚。Lu等［46］報道，神經元衍生的E2在調節(jié)小鼠前腦中的快速蛋白激酶B-ERK 和CREB-腦源性神經營養(yǎng)因子信號轉導中具有關鍵作用，即E2有助于海馬的神經可塑性、神經發(fā)育和認知信號通路。此外，雌激素通過絲裂原活化蛋白激酶通路對神經有保護作用；還可通過作用于L 型鈣通道阻滯胱天蛋白酶3 活化等，阻礙Glu 介導的細胞死亡［47］。Glu也被認為是一個重要的調控凋亡的因素，雌激素可介導Glu表達，增加星形膠質細胞對Glu 的吸收，減少內環(huán)境中Glu 含量，抑制Glu 介導的神經細胞死亡［48］。來曲唑會造成E2降低，從而干擾神經元的增殖和分化。推測來曲唑可能通過影響E2對中樞神經系統的調節(jié)作用，從而產生認知功能毒性。

圖1 雌激素對嚙齒類動物記憶鞏固作用的經典和非經典機制.E2：雌二醇；ER：雌激素受體；Glu：谷氨酸；ERK：細胞外信號調節(jié)激酶；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶點；CREB：環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白；ERE：雌激素反應元件.

3 結語

來曲唑對幼年動物的發(fā)育毒性主要體現在對生殖系統、骨發(fā)育以及認知功能的影響，其導致幼年動物睪丸E2降低、睪丸形態(tài)異常、生精小管及間質組織發(fā)生改變；通過抑制芳香化酶導致E2缺乏，降低骨密度并影響骨代謝；降低海馬區(qū)E2水平導致神經細胞凋亡以及認知功能障礙（圖2）。來曲唑對幼年動物毒性機制可能是由于其藥理作用引起的。對于生殖系統毒性機制可能與睪丸細胞的發(fā)育成熟、體內性激素及促性腺激素表達以及睪丸組織中雌激素受體分布及表達有關。骨代謝毒性機制可能與影響雌激素對破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成有關；雌激素的降低會增加RANKL 誘導破骨細胞的增殖和分化，增加骨吸收，同時也會增加成骨細胞的凋亡、氧化應激和NF-κB 活性，從而減少骨形成。認知功能毒性機制可能是由于E2的降低以及芳香化酶的缺乏，從而影響E2對中樞神經系統的調節(jié)作用，如干擾E2調節(jié)海馬經典及非經典效應、降低星形膠質細胞對Glu 的吸收、減少L 型鈣通道阻滯半胱天冬酶3活化等。

圖2 來曲唑對幼年動物的發(fā)育毒性及其可能機制.T：睪酮；FSH：促卵泡激素；E2：雌二醇；LH：黃體生成素；OPG：骨保護素；RANKL：NF-κB受體活化因子配體；RANK：NF-κB受體活化因子；Glu：谷氨酸.

目前關于來曲唑對于兒童毒性影響的非臨床及臨床研究數據比較匱乏，且存在爭議，可靠性差。由于成熟體系和不成熟體系之間的內在差異，對兒童的毒性可能不會在成人中觀察到，來自幼年動物的數據在評估藥物對兒童的潛在毒性方面具有很大價值［49-50］。所以仍需通過幼年動物實驗來考察曲唑對幼年動物產生的生殖毒性、骨代謝毒性、認知功能毒性及其可能的毒性作用機制，為臨床兒科更安全、有效地使用來曲唑提供依據。