基于活性和基于親和性的蛋白質(zhì)表達(dá)譜在藥理毒理學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展

陳佳勝，張?chǎng)卧拢瑒⒖『?，孟文琪，張?/p>

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 徐州 221004；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)海軍醫(yī)學(xué)系，上海 200433）

明確小分子藥物和（或）毒物直接作用靶點(diǎn)，有助于更全面地認(rèn)識(shí)其藥理和（或）毒理作用機(jī)制。傳統(tǒng)的組學(xué)技術(shù)只能發(fā)現(xiàn)藥物和（或）毒物對(duì)機(jī)體mRNA、蛋白質(zhì)和代謝物表達(dá)的改變，很難從一系列復(fù)雜的指標(biāo)變化中找到關(guān)鍵的起始環(huán)節(jié)?；诨钚缘牡鞍踪|(zhì)表達(dá)譜（activity-based protein profiling，ABPP）和基于親和性的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（affinitybased protein profiling，AfBPP）為研究小分子藥物和（或）毒物與蛋白質(zhì)相互作用提供了可靠的技術(shù)［1］。ABPP 和AfBPP 技術(shù)是利用小分子探針標(biāo)記與其直接作用的蛋白，并將結(jié)合蛋白分離、鑒定的化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。該類技術(shù)使用的小分子探針由活性基團(tuán)、連接基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)3 部分組成?；钚曰鶊F(tuán)即藥物和（或）毒物的母體結(jié)構(gòu)，一般具有特定的生物活性，可結(jié)合特定的分子靶標(biāo)；連接基團(tuán)主要連接活性基團(tuán)與報(bào)告基團(tuán)，通常需具有一定的長(zhǎng)度和親水性，對(duì)探針的生物活性至關(guān)重要；熒光染料和生物素是最常用的報(bào)告基團(tuán)，用于化合物在細(xì)胞/組織中定位以及后續(xù)的蛋白分離、鑒定［2］。但熒光基團(tuán)和生物素的體積、質(zhì)量較大，對(duì)活性化合物本身的理化性質(zhì)和活性改變較大，可能引起靶點(diǎn)鑒定的誤差。為解決這一問(wèn)題，研究者們通過(guò)應(yīng)用點(diǎn)擊化學(xué)和生物正交化學(xué)技術(shù)，用生物正交基團(tuán)如炔烴、疊氮化物、反環(huán)辛烯及環(huán)丙烯等替換原有的熒光染料或生物素,以減少報(bào)告基團(tuán)對(duì)活性化合物的影響［3］（圖1A）。ABPP 和AfBPP 技術(shù)均屬于化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)范疇，均通過(guò)化學(xué)法向目標(biāo)化合物中引入報(bào)告基團(tuán)，用于鑒定目標(biāo)化合物在組織或細(xì)胞中的直接作用蛋白。二者在應(yīng)用上的區(qū)別及優(yōu)缺點(diǎn)為：①在活性探針構(gòu)建方面，ABPP 只需引入炔基、疊氮等生物正交基團(tuán)；AfBPP 在引入上述正交基團(tuán)的基礎(chǔ)上，還需引入二苯甲酮［4］、芳基疊氮［5］、雙吖丙啶、芳基四唑等光親和基團(tuán)［6］（圖1B），其中雙吖丙啶基團(tuán)由于尺寸較小且光交聯(lián)效率高，是目前使用最為廣泛的光交聯(lián)劑［7］。②在蛋白鉤釣過(guò)程中，ABPP 與細(xì)胞或組織勻漿孵育后可直接進(jìn)行蛋白鉤釣；而AfBPP 孵育后需進(jìn)行紫外照射，與探針的光親和基團(tuán)附近的蛋白進(jìn)行共價(jià)連接，后再進(jìn)行蛋白鉤釣。③在鑒定結(jié)果方面，ABPP 只能釣取與目標(biāo)化合物共價(jià)結(jié)合的蛋白；而AfBPP 還可釣取與目標(biāo)化合物非共價(jià)作用（氫鍵、范德華力等）的靶標(biāo)蛋白，所獲得的靶標(biāo)蛋白更為全面，但同時(shí)也會(huì)存在非特異性背景蛋白的影響。

圖1 基于活性的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（ABPP）和基于親和性的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（AfBPP）分析技術(shù)中常用的正交化學(xué)基團(tuán)和光交聯(lián)劑.A：ABPP和AfBPP中常用的正交化學(xué)基團(tuán)；B：AfBPP中常用的光親和基團(tuán)，在紫外光照射下能夠與蛋白質(zhì)形成牢固的共價(jià)結(jié)合.

目前，已有研究通過(guò)ABPP/AfBPP 技術(shù)鑒定出小分子化合物二甲雙胍、青蒿素、膽固醇和顛茄素等的直接作用靶蛋白［8］。本綜述主要聚焦ABPP和AfBPP 技術(shù)在小分子藥物脫靶和毒物靶點(diǎn)鑒定方面的研究進(jìn)展，為探索小分子藥物脫靶、毒物的毒性機(jī)制提供新的研究思路。

1 在活性小分子脫靶效應(yīng)研究中的應(yīng)用

1.1 BlA 10-2474

2016 年，脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）抑制劑BIA 10-2474（圖2A，化合物1）的臨床Ⅰ期試驗(yàn)導(dǎo)致1 例患者死亡，4 例患者住院，所有試驗(yàn)患者均出現(xiàn)輕度至重度神經(jīng)毒性癥狀［9］。FAAH 是一種膜結(jié)合型絲氨酸水解酶，能降解內(nèi)源性大麻素和相關(guān)的酰胺化脂質(zhì)［10］。盡管其導(dǎo)致臨床神經(jīng)毒性的原因尚不清楚，但考慮到常用FAAH 抑制劑PF04457845（圖2A，2）較高的臨床安全性［11］，研究人員推測(cè)BIA 10-2474 可能存在脫靶效應(yīng)。之前的ABPP 研究顯示，BIA 10-2474及其主要代謝物之一（圖2A，3）能抑制FAAH 所屬的絲氨酸水解酶類的多個(gè)成員的活性［12］。在BIA 10-2474 代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中引入乙炔基（圖2A，4），對(duì)共價(jià)靶點(diǎn)進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)其可共價(jià)結(jié)合乙醛脫氫酶中保守的半胱氨酸殘基，該靶點(diǎn)對(duì)保護(hù)大腦免受氧化應(yīng)激損傷發(fā)揮重要作用［13］。

圖2 小分子活性化合物及用于研究其脫靶效應(yīng)的探針結(jié)構(gòu).A：脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）抑制劑；B：克雷諾拉尼（CR）及探針CR-1，CR-2，CR-3；C：多卡霉素SA、多卡霉素開環(huán)藥物及探針；D：3-去氮腺嘌呤A（DzNep）及探針D2-1，NP-1，NP-2.

1.2 克雷諾拉尼（crenolanib）

目前急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）治療方法有限。約30% AML 患者攜帶Fms 樣酪氨酸激酶3（fms related tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）突變，F(xiàn)LT3可能是治療該疾病的靶點(diǎn)。已開發(fā)多種針對(duì)FLT3 的抑制劑，部分已進(jìn)入臨床試驗(yàn)后期［14］，其中克雷諾拉尼（圖2B，5）可有效抑制具有FLT3 內(nèi)部串聯(lián)復(fù)制和FLT3突變的白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)［15］。此外，該藥還是血小板衍生生長(zhǎng)因子受體的有效抑制劑，可抑制伊馬替尼耐藥的胃腸間質(zhì)瘤［16］?；谄湓谇捌谂R床試驗(yàn)中的良好作用，該藥已進(jìn)入治療AML的Ⅲ期臨床試驗(yàn)，但其潛在不良反應(yīng)也受到關(guān)注。體外激酶篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了該藥的一系列新靶點(diǎn)，包括可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺附著蛋白受體和非受體型酪氨酸激酶等［17］。蛋白下拉（pull down）實(shí)驗(yàn)表明，克雷諾拉尼可與Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2 和周期蛋白依賴性激酶7 相互作用［18］。為進(jìn)一步探索克雷諾拉尼的潛在靶點(diǎn)，研究人員合成了3 個(gè)基于其結(jié)構(gòu)的探針，其中1 個(gè)為光親和探針（圖2B，6）；2 個(gè)為帶有熒光母核的探針，1 個(gè)探針的熒光團(tuán)為BODIPY（圖2B，7），另一個(gè)探針的熒光團(tuán)為acedan染料（圖2B，8）。應(yīng)用這些探針發(fā)現(xiàn)了該藥的其他靶點(diǎn)，包括絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶、線粒體二羧酸載體蛋白和低氧誘導(dǎo)基因1等［14］，為進(jìn)一步明確其潛在毒性靶點(diǎn)提供了重要線索。

1.3 多卡霉素（duocarmycin）

多卡霉素家族顯示出高效的抗腫瘤活性，對(duì)幾種已知癌細(xì)胞系的IC50值約10 pmol·L-1，但其具有高骨髓毒性?；诙嗫顾豐A（圖2C，9），一方面通過(guò)結(jié)構(gòu)改造，合成新的多卡霉素開環(huán)藥物（圖2C，10）來(lái)降低毒性；另一方面通過(guò)將藥物連接到抗體上，利用抗體直接作用于腫瘤部位，避免對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，這種抗體偶聯(lián)藥物目前處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)［19］。先前的研究認(rèn)為多卡霉素作用靶標(biāo)僅為DNA［20］。Sieber 課題組運(yùn)用ABPP 技術(shù)，合成了帶有炔基鏈的探針（圖2C，11），該探針可在體內(nèi)原位激活成環(huán)（圖2C，12），分離出一種60 ku蛋白質(zhì)，經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定為乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）［21］。該酶可抑制癌細(xì)胞增殖，并引起抗癌藥在機(jī)體內(nèi)失活。對(duì)多卡霉素類化合物與DNA 和ALDH 的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)吲哚基團(tuán)衍生物只能與ALDH 結(jié)合，不能與DNA相互作用［22］。

1.4 3-去氮腺嘌呤A（3-deazaneplanocin A，DzNep）

在真核生物中，組蛋白翻譯后修飾是調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的重要過(guò)程。DzNep（圖2D，13）不僅是S-腺苷同型半胱氨酸水解酶的有效抑制劑，還是一種有效的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。Yao 課題組基于DzNep 合成了一種親和性探針，并將其命名為DZ-1（圖2D，14），其具備與DzNep 等同的抗凋亡活性［23］。他們還合成了2 個(gè)對(duì)照探針NP-1（圖2D，15）和NP-2（圖2D，16），以減少非特異性光交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的背景蛋白質(zhì)，3 個(gè)探針都用于細(xì)胞中的原位蛋白質(zhì)組分析。結(jié)果顯示，除甲基轉(zhuǎn)移酶外，DzNep 還可與多種激酶、磷酸酶和ATP酶發(fā)生共價(jià)結(jié)合。此發(fā)現(xiàn)為將DzNep 用作表觀遺傳學(xué)研究和作為癌癥治療潛在候選藥物提供了新思路。

2 在已上市藥物脫靶效應(yīng)研究中的應(yīng)用

2.1 奧利司他（orlistat）

奧利司他（圖3A，17）是一種用于治療肥胖的上市藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制脂肪酶減少熱量攝入。研究發(fā)現(xiàn)，其還可通過(guò)抑制脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）起抗腫瘤作用。FAS 是癌細(xì)胞而非正常細(xì)胞生長(zhǎng)的必需酶，其抗腫瘤作用機(jī)制雖已闡明，但潛在的脫靶或不良反應(yīng)尚未展開詳細(xì)研究。Yang 等［24］通過(guò)ABPP 技術(shù)對(duì)奧利司他的蛋白靶標(biāo)進(jìn)行了鉤釣。該藥物含有幾個(gè)長(zhǎng)的脂肪鏈，在脂肪鏈末端引入炔基，對(duì)該藥物的生物活性影響程度最小?；诖瞬孪?，他們合成了3 個(gè)奧利司他探針THL-R，THL-L 和THL-T（圖3A，18～20），并將其與活細(xì)胞共孵育，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)連接羅丹明，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和膠內(nèi)熒光掃描，結(jié)果顯示有8 種蛋白質(zhì)與之結(jié)合。之后，使用疊氮化物標(biāo)記的生物素作為標(biāo)簽，通過(guò)瓊脂糖親和素微珠和質(zhì)譜分離并鑒定與其結(jié)合的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示除FAS、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和β-微管蛋白水解酶外，其還與核糖體蛋白L7a，14 和S9 發(fā)生結(jié)合，上述3 種酶在前列腺癌、腦癌、肝癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)。

圖3 幾種上市藥物及用于研究其脫靶效應(yīng)的探針化學(xué)結(jié)構(gòu).A：奧利司他；B：達(dá)沙替尼；C：依魯替尼；D：伊立替康；E：萬(wàn)古霉素.

2.2 達(dá)沙替尼（dasatinib）

蛋白激酶通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成，在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。達(dá)沙替尼（圖3B，21）是美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的蛋白酪氨酸激酶抑制劑，已被用于治療伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病。包括達(dá)沙替尼在內(nèi)的大多數(shù)激酶抑制劑能抑制多個(gè)蛋白靶標(biāo)，細(xì)胞特異性較低。通過(guò)將藥物中非必需羥乙基哌嗪替換為含炔基的末端光交聯(lián)劑，合成達(dá)沙替尼光親和探針（圖3B，22和23）［25］，22為二氮雜吖嗪，23為二苯甲酮，保留了原始藥物大部分生物活性。將探針與癌細(xì)胞共孵育，并通過(guò)紫外照射固定，進(jìn)一步通過(guò)蛋白下拉、質(zhì)譜鑒定以及生物學(xué)分析表明，除Abl和Src家族酪氨酸激酶外，還鑒定出許多以前未發(fā)現(xiàn)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶18、真核起始因子2A和PKN2等，這些新發(fā)現(xiàn)的蛋白靶點(diǎn)與達(dá)沙替尼的相關(guān)性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 依魯替尼（ibrutinib）

布魯頓酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）在B 細(xì)胞發(fā)育、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路和免疫球蛋白合成中發(fā)揮重要作用。依魯替尼（圖3C，24）可不可逆地抑制BTK 通路，對(duì)多種B 細(xì)胞惡性腫瘤具有顯著臨床治療效應(yīng)，已于2013 年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市［26］。其結(jié)構(gòu)中含有α，β-不飽和酰胺類親電體，可與目標(biāo)激酶BTK 結(jié)合口袋中的活性部位半胱氨酸共價(jià)結(jié)合。為研究依魯替尼的脫靶效應(yīng)，Lanning 等［27］首先合成了基于依魯替尼的探針（圖3C，25）。該探針將炔基連接到分子的一個(gè)苯環(huán)上，不會(huì)影響邁克爾受體的固有反應(yīng)活性，通過(guò)親和富集、蛋白下拉以及生物學(xué)分析顯示，該探針除與BTK 和表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合外，還可與B 淋巴細(xì)胞酪氨酸激酶和絲裂原活化蛋白激酶7等激酶發(fā)生作用。令人驚訝的是，還鑒定出了許多非激酶靶標(biāo)，包括視黃醛脫氫酶和芳烴受體等未表征的蛋白質(zhì)，其共同特征之一是具有保守的半胱氨酸活性位點(diǎn)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，依魯替尼對(duì)這些靶點(diǎn)具有抑制作用。

2.4 伊立替康（irinotecan）

腸道微生物群能代謝多種藥物，且腸道微生物對(duì)藥物的生物轉(zhuǎn)化能降低其藥效，甚至在某些情況下誘導(dǎo)疾病發(fā)生［28-29］。有研究表明，人類腸道微生物組成的個(gè)體差異會(huì)導(dǎo)致不同的藥物反應(yīng)［30］。臨床發(fā)現(xiàn)，并非所有接受抗癌藥伊立替康治療的患者都發(fā)生胃腸道毒性，有研究者認(rèn)為，這種差異是腸道細(xì)菌β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）類型和水平差異的結(jié)果［31］。GUS 可將非活性藥物葡萄糖醛酸結(jié)合物水解變成活性藥物，藥物毒性增加，從而破壞胃腸道上皮細(xì)胞。為此，開發(fā)了環(huán)酚醇基環(huán)氧化合物（圖3D，26）和氮丙啶抑制劑（圖3D，27），基于化合物27，合成了2 個(gè)探針，1 個(gè)探針上的報(bào)告基團(tuán)是生物素（圖3D，28），另一個(gè)探針上的報(bào)告基團(tuán)是五碳花菁（圖3D，29）［32］，用以分析人類細(xì)胞中的GUS。人類糞便樣本中存在GUS，其可催化伊立替康產(chǎn)生毒性代謝物7-乙基-10-羥基喜樹堿。GUS 可作為生物標(biāo)志物和新藥靶點(diǎn)，為開發(fā)新的藥物提供有價(jià)值的信息。

2.5 萬(wàn)古霉素（vancomycin）

萬(wàn)古霉素是一種有效的糖肽類抗生素，特異性結(jié)合到新生肽聚糖的D-Ala-D-Ala 二肽末端。該分子與肽主干形成一系列氫鍵，阻止青霉素結(jié)合蛋白進(jìn)一步加工，從而抑制肽聚糖和細(xì)胞壁的生物合成。但其長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性，限制了臨床應(yīng)用。為了探索萬(wàn)古霉素在金葡菌和糞腸球菌菌株中新的靶點(diǎn)，研究者開發(fā)了一系列基于萬(wàn)古霉素的小分子光親和探針（圖3E，30～32）［33］。運(yùn)用AfBPP技術(shù)，經(jīng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的萬(wàn)古霉素靶蛋白，一是萬(wàn)古霉素光親和探針與自溶素相互作用，進(jìn)而改變了金葡菌的細(xì)胞形態(tài)；二是在糞腸桿菌中，萬(wàn)古霉素光親和探針特異性地與ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，減少了細(xì)菌對(duì)糖類和多肽等必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，這一發(fā)現(xiàn)有助于闡明萬(wàn)古霉素在細(xì)菌中發(fā)揮藥理作用的機(jī)制。

3 在小分子有毒化合物靶點(diǎn)鑒定中的應(yīng)用

3.1 神經(jīng)性毒劑VX

以神經(jīng)性毒劑為代表的有機(jī)磷類化合物對(duì)公共安全構(gòu)成極大的安全威脅。人體暴露于VX 等神經(jīng)毒劑會(huì)導(dǎo)致一系列與暴露水平相關(guān)的毒性反應(yīng)，包括瞳孔縮小、分泌物過(guò)量、抽搐、癲癇發(fā)作甚至死亡，引起這些癥狀的主要機(jī)制是抑制乙酰膽堿酯酶，破壞膽堿能通路［34-35］。目前對(duì)于VX 通過(guò)其他途徑引起全身毒性效應(yīng)的研究仍然很少。在十一碳鏈的羥基上（圖4A，33）進(jìn)行酯化反應(yīng)，生成酯類化合物（圖4A，34）。在此基礎(chǔ)上，在酰胺鍵上連接生物素（圖4A，35），進(jìn)一步發(fā)生重排反應(yīng)，合成了一種帶生物素標(biāo)簽的VX 探針（圖4A，36），運(yùn)用ABPP 技術(shù)［36］，分離、濃縮與探針共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)與VX 直接作用的132 個(gè)蛋白，包括線粒體異檸檬酸脫氫酶2、異檸檬酸脫氫酶3、蘋果酸脫氫酶和琥珀酰輔酶A 連接酶等與能量代謝相關(guān)的蛋白，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)VX 可抑制異檸檬酸脫氫酶2 的活性。該研究首次明確VX 可直接影響機(jī)體的能量代謝，為開發(fā)新的VX 診斷方法提供思路。

圖4 用于研究小分子有毒化合物靶點(diǎn)鑒定的探針結(jié)構(gòu).A：神經(jīng)毒劑VX探針的合成過(guò)程；B：殺螟硫磷及其體內(nèi)代謝物和氟磷酸鹽熒光探針的結(jié)構(gòu)；C：丙烯醛修飾蛋白和點(diǎn)擊探針的反應(yīng)機(jī)制.

3.2 有機(jī)磷殺蟲劑

常規(guī)的有機(jī)磷殺蟲劑毒性較神經(jīng)性毒劑VX低［37］，但接觸有機(jī)磷殺蟲劑可能會(huì)導(dǎo)致人類精子染色體非整倍體以及染色質(zhì)改變，引起精子損傷，導(dǎo)致精子密度降低。殺螟硫磷（fenitrothion，F(xiàn)NT，圖4B，37）是一種重要的有機(jī)磷殺蟲劑，F(xiàn)NT oxon（圖4B，38）是FNT 的體內(nèi)生物活性代謝物。為明確FNT 精子毒性的可能靶點(diǎn)，利用帶生物素標(biāo)簽（圖4B，39）和熒光素標(biāo)簽（圖4B，40）的氟化磷熒光探針，通過(guò)ABPP 技術(shù)發(fā)現(xiàn)FAAH 是FNT 在精子中的主要靶點(diǎn)，而FAAH 也在精子產(chǎn)生和精子運(yùn)動(dòng)能力獲得中起關(guān)鍵作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠ig 給予FNT 10 d后，睪丸或附睪尾的FAAH 活性顯著降低，進(jìn)一步驗(yàn)證了FAAH 可能是有機(jī)磷殺蟲劑引起精子毒性的潛在靶點(diǎn)［38］。

3.3 丙烯醛

丙烯醛（圖4C，41）是一種普遍存在的有毒污染物，主要存在于香煙煙霧、烹調(diào)煙霧以及石油燃料燃燒產(chǎn)生的汽車尾氣中。它與多種疾病有關(guān)，包括酒精性肝損傷、阿爾茨海默病、糖尿病和肺癌。當(dāng)細(xì)胞處于長(zhǎng)期過(guò)度飲酒引起的酒精應(yīng)激等氧化應(yīng)激時(shí)，通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)產(chǎn)生不飽和脂肪酸聚合物。作為結(jié)構(gòu)最小且反應(yīng)性最強(qiáng)的α，β-不飽和親電試劑，丙烯醛可與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽發(fā)生邁克爾加成，生成化合物42（圖4C），影響氧化還原穩(wěn)態(tài)。它還可與蛋白質(zhì)中的親核基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，引起蛋白質(zhì)內(nèi)或蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，但具體作用蛋白尚不明確。研究人員開發(fā)了一種定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法，基于化合物42 和間乙炔苯胺（圖4C，43）反應(yīng)生成席夫堿（圖4C，44），再經(jīng)氰化硼氫化鈉還原生成點(diǎn)擊探針（圖4C，45），通過(guò)間乙炔苯胺來(lái)標(biāo)記丙烯醛結(jié)合的蛋白［39］。結(jié)果表明，丙烯醛靶向＞2300 種蛋白質(zhì)、＞500 個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)，為全面認(rèn)識(shí)丙烯醛的毒性機(jī)制提供了較全面的信息。

4 結(jié)語(yǔ)

ABPP 和AfBPP 技術(shù)的迅速發(fā)展，可對(duì)小分子藥物和（或）毒物的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行全面和定量分析，從而能更全面研究其作用方式，評(píng)估可能的不良反應(yīng)。該技術(shù)的應(yīng)用已將其領(lǐng)域從靶點(diǎn)識(shí)別擴(kuò)展到治療靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和基于靶點(diǎn)的藥物篩選。盡管ABPP 和AfBPP 技術(shù)已取得巨大進(jìn)展，但提升質(zhì)譜鑒定的準(zhǔn)確性是兩者面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。近年來(lái)，氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記、相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記等定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法已較好地解決了這一問(wèn)題。ABPP 和AfBPP 技術(shù)面臨的另外一個(gè)問(wèn)題是非特異性標(biāo)記和低效交聯(lián)［40-41］。相信隨著相關(guān)技術(shù)的不斷成熟，如生物正交化學(xué)和點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)展及學(xué)科交叉的日益深入，ABPP 和AfBPP 技術(shù)將在小分子化合物的藥理毒理機(jī)制研究中發(fā)揮更重要作用。