線粒體示蹤體系的建立及驗證

呂琳，王思涵，3，曾泉，段晗，2，毛壯，王唱垚，2，裴雪濤，3，王華，李艷華，3

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；2.河北大學(xué)生命科學(xué)院，河北 保定 071000；3.華南生物醫(yī)藥研究院華南干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 廣州 510005）

腫瘤放射治療或突發(fā)核事故等都可對人體正常組織造成輻射損傷，不同劑量的電離輻射可對造血系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等造成不同程度的損傷。小腸是輻射損傷最敏感的器官之一［1］，高劑量的電離輻射可導(dǎo)致患者出現(xiàn)小腸缺血、黏膜炎癥、潰瘍、穿孔和壞死等，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［2］。輻射暴露會加重細(xì)胞內(nèi)自由基誘導(dǎo)的大分子物質(zhì)氧化損傷，甚至引起細(xì)胞凋亡，這一結(jié)局可能與線粒體介導(dǎo)的凋亡通路密切相關(guān)［3］。此外，輻射暴露導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多會對生物組織造成損害，有研究表明，高ROS 水平會對線粒體功能產(chǎn)生不利影響［4］。輻射暴露也會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體功能障礙，阻礙細(xì)胞自我更新［5］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類多潛能干細(xì)胞，具有強大的自我更新和多向分化能力。研究表明，MSC 具有促進損傷組織再生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、減輕纖維化、降低ROS 水平、抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等功能［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MSC 可通過細(xì)胞融合、與周圍細(xì)胞形成隧道納米管、緊密連接等方式向受損細(xì)胞遞送細(xì)胞器，如線粒體，以增強受損細(xì)胞活力和增殖能力，減少細(xì)胞凋亡，促進組織損傷修復(fù)［7］。牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSC）是一種來源于牙髓組織的MSC，相比其他來源的MSC，如臍帶來源MSC，DPSC在成骨分化、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡和抗衰老等方面具有顯著優(yōu)勢［8］。

研究表明，MSC 在緩解輻射損傷方面具有巨大潛能［9］，而MSC 是否能夠向輻射損傷組織細(xì)胞遞送線粒體以達到一定的治療效果，目前尚無明確報道。本研究構(gòu)建了可用于示蹤線粒體的質(zhì)粒載體pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2，經(jīng)293T 細(xì)胞包裝獲得慢病毒（Lv-COX8A-DsRed2），感染DPSC 并標(biāo)記其線粒體；利用X 射線照射大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞系IEC-6 細(xì)胞，并在照射后補充穩(wěn)定表達線粒體熒光報告系統(tǒng)的DPSC-COX8A-DsRed2，通過對線粒體的示蹤，探討DPSC能否向輻射損傷的IEC-6細(xì)胞遞送線粒體，探索建立的線粒體示蹤體系是否可標(biāo)記線粒體運動軌跡，為后續(xù)線粒體轉(zhuǎn)移的機制研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞系IEC-6 和人胚腎細(xì)胞系293T由本實驗室保存；DPSC由北京三有利和澤生物科技有限公司惠贈。

慢病毒載體（pSIN-SFFV）和輔助質(zhì)粒（pMD2.G和psPAX2）由本實驗室提供；感受態(tài)細(xì)胞DH5α，北京擎科生物科技有限公司；慢病毒感染增強液，上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、α-MEM 培養(yǎng)基和Opti-MEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；胎牛血清，澳大利亞AusgeneX；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000 和綠色熒光線粒體染色劑MitoTracker Green FM，美國Invitrogen 公司；流式抗體PE-CyTM7 Anti-Human CD90（貨號：561558）、Hoechst33342（貨號：561908）購自美國BD Bioscience 公司；線粒體膜受體線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20 gene，TOMM20）抗體（貨號：ab186735）、驢抗鼠IgG（Alexa Fluor?488）（貨號：ab150073）二抗購自英國Abcam公司；5（6）-羧基二乙酸熒光素N-琥珀酰亞胺酯（CFSE）（貨號：21888），美國Sigma-Aldrich公司。

DL-CF-2ND I 超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)公司；XMTD-6000 恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)公司；YDS-50B-125 液氮罐，Haier 公司；5810R 離心機，美國Eppendorf 公司；3111CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司；INNOVA42R 低溫?fù)u床，美國New Brunswick 公司；uastercycle PCR儀，美國Eppendorf 公司；GEL DOC XR+凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；ECLIPSE Ts2 倒置生物顯微鏡，X-Light V3 共聚焦熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Guava easyCyteTM12HT Base System 流式細(xì)胞儀，美國Luminex公司。

1.2 細(xì)胞傳代和培養(yǎng)

取對數(shù)生長期的DPSC，棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌后，加入0.25%胰酶，37 ℃恒溫箱孵育完全消化后加入新鮮的含有10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基，中和胰酶消化液，收集細(xì)胞懸液，800×g22 ℃，離心5 min，棄上清，用α-MEM+10%FBS 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1∶3比例傳代培養(yǎng)。

取生長狀態(tài)良好的IEC-6細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，使用PBS 洗滌1～2 次，加入0.25%胰酶，37 ℃孵育待完全消化后加入完全培養(yǎng)基以中和消化液，收集細(xì)胞懸液，800×g22 ℃，離心5 min，棄上清，用高糖DMEM+10%FBS 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。

1.3 pSlN-EF1α-COX8A-DsRed2質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

1.3.1 質(zhì)粒載體構(gòu)建

從GenBank 數(shù)據(jù)庫獲取EF1α，COX8A和DsRed2 基因序列，根據(jù)載體構(gòu)建方案，由華大基因合成。COX8A基因編碼線粒體電子呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ中細(xì)胞色素c 氧化酶最小的亞單位，序列中含有靶向定位于線粒體的信號肽序列［10］。我們將慢病毒載體pSIN 中的原有啟動子SFFV 經(jīng)酶切去除后，通過同源重組的方式依次將EF1α、COX8A和DsRed2 基因序列插入，構(gòu)建成慢病毒載體pSINEF1α-COX8A-DsRed2，并同步構(gòu)建了陰性對照慢病毒載體pSIN-EF1α-DsRed2。取質(zhì)粒50 ng轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)12～16 h，挑取單克隆，37 ℃搖床孵育過夜，提取質(zhì)粒，將構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2（COX8ADsRed2）。

1.3.2 質(zhì)粒鑒定

根據(jù)插入的目的基因COX8A、DsRed2 設(shè)計上下游引物，正向引物5'- ACAGATCCAAGCTGTGAC-3'（位于COX8A序列前89bp 處）；反向引物5'-CCTCATAAAGAGACAGCAAC-3'（位于DsRed2序列后167 bp 處），通過PCR 擴增目的基因，PCR反應(yīng)體系如下：12.5 μL Q5 High-Fidelity 2X Mix，1.25 μL 10 mmol·L-1正向引物，1.25 μL 10 mmol·L-1反向引物，100 ng DNA 樣品，最終以無核酸酶水補齊至25 μL。

反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共計30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，10 ℃保持。隨后取5 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 慢病毒制備

將生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞傳代接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度為50%～60%時，細(xì)胞換液，加新鮮的DMEM 無血清培養(yǎng)基10 mL。配制脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系：Opti-MEM 培養(yǎng)基1 mL，COX8ADsRed2 質(zhì)粒8 μg，psPAX2 質(zhì)粒6 μg，pMD2.G 質(zhì)粒2 μg，LipofectamineTM3000 20 μL，P3000 32 μL，混勻后靜置15 min，隨后將混合的轉(zhuǎn)染液緩慢逐滴加入培養(yǎng)基中。12 h 后細(xì)胞換液，緩慢輕柔加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，48～72 h后收集病毒上清至離心管中，4 ℃，3000×g，離心20 min，0.45 μm濾膜過濾，去除細(xì)胞沉淀。4 ℃，120 000×g，離心90 min，棄上清，以100 μL 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，分裝并貯存于-80 ℃。

1.5 慢病毒感染DPSC

取對數(shù)生長期的DPSC，細(xì)胞數(shù)目為6×105接種于6 孔板中，24 h 內(nèi)生長密度達到60%～80%。取濃縮病毒液，用α-MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋100 倍，緩慢滴加到培養(yǎng)皿中，同時加入慢病毒感染增強液每孔40 μL，置于CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育12 h后，更換新鮮的α-MEM 完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h 后，在熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達情況，感染后的細(xì)胞稱為DPSC-COX8A-DsRed2。

1.6 免疫熒光染色檢測DPSC-COX8A-DsRed2 與線粒體膜受體TOMM20共定位

取生長狀態(tài)良好DPSC-COX8A-DsRed2，細(xì)胞數(shù)為1×104接種于共聚焦小皿中，使用4%多聚甲醛室溫孵育10 min，預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，每次5 min；加入0.25% Triton-X-100 破膜，室溫孵育15 min，預(yù)冷的PBS 洗滌3 次，每次5 min；加入10%驢血清（PBS 溶液配制）室溫封閉1 h，吸棄封閉液，按照抗體試劑說明書加入一抗TOMM20抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；隔天取出小皿，恢復(fù)室溫，PBS洗滌3次，每次5 min，加入驢抗鼠IgG 二抗（1∶2000），室溫避光孵育1 h，PBS 洗滌3 次，每次5 min；加入DAPI 溶液（1∶500）室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，共聚焦熒光顯微鏡下觀察DPSC-COX8A-DsRed2 的紅色熒光是否與TOMM20的綠色熒光重合，并拍照記錄。

1.7 活細(xì)胞染色檢測DPSC-COX8A-DsRed2 與線粒體示蹤試劑MitoTracker Green 共定位

取生長狀態(tài)良好DPSC-COX8A-DsRed2，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104接種于共聚焦小皿中，將Mito-Tracker Green試劑用培養(yǎng)基稀釋至300 nmol·L-1，37 ℃避光孵育25 min，37 ℃預(yù)熱的PBS洗滌3次，每次5 min，共聚焦熒光顯微鏡下觀察DPSCCOX8A-DsRed2 的紅色熒光是否與MitoTracker Green的綠色熒光重合，并拍照記錄。

1.8 細(xì)胞輻照和處理

取生長狀態(tài)良好的IEC-6，細(xì)胞數(shù)目為1×104接種于共聚焦小皿中，使用10 Gy X 射線對細(xì)胞進行照射［11］，對其進行CFSE 熒光染色（CFSE 試劑濃度為5 μmol·L-1，標(biāo)記時間10 min）以標(biāo)記IEC-6細(xì)胞，隨后加入細(xì)胞數(shù)每孔為2×103DPSC-COX8ADsRed2 進行共培養(yǎng)，24 h 后通過共聚焦熒光顯微鏡觀察綠色熒光細(xì)胞內(nèi)是否出現(xiàn)紅色熒光以判斷細(xì)胞間發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)移。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測lEC-6 細(xì)胞線粒體數(shù)目和線粒體轉(zhuǎn)移率

取生長狀態(tài)良好的IEC-6，細(xì)胞數(shù)目每孔為5×105接種于六孔板中，使用10 Gy X射線對細(xì)胞進行照射，隨后加入細(xì)胞數(shù)為1×105DPSC-COX8ADsRed2進行共培養(yǎng)24 h。隨后制成細(xì)胞懸液收集于流式管中，對其進行MitoTracker Green 標(biāo)記，試劑濃度為500 nmol·L-1，37 ℃避光孵育25 min，400×g離心5 min；PBS 洗1 次，每管加入PE-CyTM7 Anti-Human CD90試劑5 μL，室溫避光孵育15 min，400×g離心5 min；PBS 洗2 次，300×g離心5 min，500 μL PBS重懸，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體數(shù)目和線粒體轉(zhuǎn)移率。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建pSlN-EF1α-COX8A-DsRed2 質(zhì)粒并成功標(biāo)記牙髓干細(xì)胞DPSC

PCR 結(jié)果顯示（圖1A），載體中插入COX8ADsRed2 基因大小約1500 bp（圖1B），與預(yù)期大小相符。將質(zhì)粒載體pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2送公司測序，結(jié)果顯示插入基因為COX8A及DsRed2基因序列。制備慢病毒（Lv-COX8A-DsRed2）感染DPSC 熒光觀測結(jié)果顯示（圖1C），DPSC 可以表達紅色熒光蛋白，表明DPSC-COX8A-DsRed2 細(xì)胞構(gòu)建成功。

Fig.1 Expression of the mitochondrial fluorescent reporting system in dental pulp stem cells（DPSC）.A：map of pSIN-EF1α-COX8A-DsRed2；B：PCR amplification result of the plasmid；C：the intracellular expression of the red fluorescence protein in DPSC was observed under fluorescence microcopy.

2.2 DPSC-COX8A-DsRed2 表達的紅色熒光蛋白準(zhǔn)確定位于線粒體上

DPSC-COX8A-DsRed2 細(xì)胞進行線粒體膜受體TOMM20免疫熒光染色，結(jié)果可見長梭形細(xì)胞中出現(xiàn)紅色熒光，同時可檢測到TOMM20抗體染色呈現(xiàn)的綠色熒光，兩者可重合為黃色熒光（圖2A 白色箭頭指示位置）。經(jīng)流式分選后的DPSC-COX8ADsRed2 細(xì)胞用MitoTracker Green 進行熒光染色，可見細(xì)胞線粒體為綠色熒光區(qū)域與DPSCCOX8A-DsRed2 顯示的紅色熒光存在共定位，兩者重合為黃色（圖2B）。同時，陰性對照DPSCDsRed2 整個細(xì)胞都標(biāo)記成紅色，與MitoTracker Green指示的綠色熒光區(qū)域并不完全重合（圖2C）。以上結(jié)果表明，構(gòu)建的線粒體熒光報告系統(tǒng)與線粒體膜受體特征蛋白TOMM20 和MitoTracker Green 均存在共定位，COX8A-DsRed2 報告系統(tǒng)可作為一種線粒體熒光探針指示細(xì)胞內(nèi)線粒體的分布。

Fig.2 Fluorescent reporter system accurately localizes to mitochondria.DPSC-COX8A-DsRed2 was stained by TOMM20 protein and MitoTracker Green to verify the red fluorescence was localized in the mitochondria.The localizations were also compared by the negative control DPSC-DsRed2 stained with MitoTracker Green.A：co-localization with TOMM20 protein；the white arrows indicated that the red fluorescence and the green fluorescence were merged；B：co-localization with MitoTracker Green ；C：co-localization between DPSC-DsRed2 and MitoTracker Green.

2.3 DPSC-COX8A-DsRed2 向輻射損傷lEC-6 細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體

輻射損傷共培養(yǎng)體系（圖3A）的熒光成像顯示，DPSC-COX8A-DsRed2 細(xì)胞攜帶的紅色熒光的線粒體轉(zhuǎn)移到了綠色熒光標(biāo)記的IEC-6 細(xì)胞中（圖3B），提示構(gòu)建的線粒體熒光示蹤系統(tǒng)可有效地指示DPSC線粒體的轉(zhuǎn)移。

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未輻射組IEC-6 細(xì)胞相比，輻射組IEC-6 能更多地獲得來自DPSCCOX8A-DsRed2 的線粒體（圖3C）。同時，輻射損傷會導(dǎo)致IEC-6 細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目降低，DPSC 干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目顯著增多（圖3D）。以上結(jié)果表明，DPSC能夠向輻射損傷細(xì)胞轉(zhuǎn)移線粒體，構(gòu)建的線粒體示蹤體系能夠指示細(xì)胞間線粒體的轉(zhuǎn)移。

3 討論

MSC 可通過細(xì)胞與細(xì)胞間的線粒體交換補充受損細(xì)胞功能障礙的線粒體，這一過程稱為MSC與靶細(xì)胞間的線粒體轉(zhuǎn)移［12］。本研究構(gòu)建了一個可定位于線粒體的熒光蛋白報告系統(tǒng)，實現(xiàn)了MSC內(nèi)線粒體的可視化觀察，為研究MSC與靶細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移這一生物學(xué)現(xiàn)象提供必要的工具。

傳統(tǒng)的線粒體示蹤方法是通過使用線粒體示蹤染料實現(xiàn)的，如四甲基玫瑰胺或羅丹明123，這類染料具有正電荷和適當(dāng)?shù)挠H脂性等特點［13］，其標(biāo)記線粒體的主要原理是基于線粒體內(nèi)外膜的膜電位能夠與適當(dāng)正電荷的小分子熒光探針形成靜電作用，使其具有靶向線粒體的特點。除了傳統(tǒng)的陽離子染料作為典型的靶向線粒體探針之外，中性熒光團也可連接到一個帶正電的探針上以獲得靶向線粒體的能力，如經(jīng)典的三苯基膦（TPP）［14］。而在受損線粒體示蹤的應(yīng)用中，這些探針可能存在缺陷，如在標(biāo)記異常線粒體中，特別是依賴于線粒體膜電位的染料，一旦線粒體膜電位喪失就會被洗掉，而需要細(xì)胞進行醛類固定或者包含線粒體能量狀態(tài)影響因子的實驗中應(yīng)用大受限制，同時游離于線粒體之外的熒光染料可能會成為熒光信號的干擾因素［15］。目前常用的線粒體染色劑MitoTracker，是一種可以進入活細(xì)胞標(biāo)記線粒體的染料，包含輕度硫基化的氯甲基活性部分，可以與半胱氨酸殘留物的游離硫醇基發(fā)生反應(yīng)，從而與基質(zhì)蛋白結(jié)合，用固定劑破壞膜電位后不會被洗掉，然而與傳統(tǒng)的陽離子線粒體探針一樣，MitoTracker受限于熒光因外環(huán)境淬滅，無法長時間實時示蹤活細(xì)胞中的線粒體以動態(tài)觀察線粒體轉(zhuǎn)移的過程。近幾年，融合酶標(biāo)簽和化學(xué)感受器表達的線粒體定位的報告載體成為新一代研究線粒體的工具。以該原理作為技術(shù)背景，Johnson 團隊利用定制熒光底物基因與特定基因序列，如標(biāo)簽蛋白SNAP［16］，融合表達對指定亞細(xì)胞區(qū)進行熒光成像［15］。該技術(shù)中，熒光底物和標(biāo)簽融合蛋白將形成原位探針蛋白綴合物，從而實現(xiàn)了線粒體不受其微環(huán)境、細(xì)胞環(huán)境影響的熒光示蹤［17］。

應(yīng)用線粒體定位表達的報告載體可實現(xiàn)活細(xì)胞之間的線粒體轉(zhuǎn)移的示蹤。本研究通過將紅色熒光蛋白（RFP）基因與可定位于線粒體的COX8A蛋白的基因進行融合表達，構(gòu)建了可定位表達于線粒體的紅色熒光報告系統(tǒng)。RFP 是從珊瑚（Discosomasp）中提取的一種與綠色熒光蛋白同源的一種生物發(fā)光蛋白［18］。Clontech 公司將其進行低毒、低寡聚化處理，形成突變體DsRed，具有對組織損傷小、光漂白作用低等優(yōu)點，更適用于深層組織器官的活體成像。DsRed2是Clontech公司對DsRed進行連續(xù)定點突變的人工突變體，與DsRed 相比，其N端凈電荷減少，寡聚化程度降低，在細(xì)胞內(nèi)熒光效率高，更易檢測［19］。本研究為了降低線粒體熒光報告系統(tǒng)對MSC 功能的影響，選擇DsRed2作為熒光報告基因。細(xì)胞色素c 氧化酶COX 家族的蛋白具有線粒體定位信號，將其基因與熒光蛋白基因融合表達可幫助熒光蛋白定位于線粒體。COX8A 是線粒體電子呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ中細(xì)胞色素c氧化酶最小的亞單位［10］，COX8A序列中包含了一段長約15～30 個氨基酸的前導(dǎo)肽序列，也是目前最常用的靶向線粒體的信號肽序列，可將熒光蛋白引導(dǎo)到細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上，實現(xiàn)線粒體的可視化［20］。本研究通過將電子呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ中細(xì)胞色素c氧化酶最小的亞單位COX8A 與紅色熒光蛋白DsRed2 進行融合表達，構(gòu)建了線粒體紅色熒光報告系統(tǒng)COX8ADsRed2。通過COX8A序列中的前導(dǎo)肽將該探針靶向定位到線粒體膜上，從而能夠?qū)崟r觀察到細(xì)胞線粒體的分布及轉(zhuǎn)移。通過與MitoTracker 對比實驗證明，我們構(gòu)建的線粒體報告系統(tǒng)可準(zhǔn)確定位到細(xì)胞線粒體上，并且能夠長時間穩(wěn)定表達紅色熒光，同時通過對其線粒體功能進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)插入序列對于線粒體的功能沒有影響。不僅如此，細(xì)胞感染含該報告系統(tǒng)基因的病毒后經(jīng)過凍存與復(fù)蘇仍能保持紅色熒光穩(wěn)定表達于線粒體上，是實現(xiàn)線粒體實時可視化的理想工具。由于我們構(gòu)建該工具細(xì)胞時選取的是原代MSC，病毒感染效率較低，紅色熒光蛋白表達陽性細(xì)胞的比率約5%，后續(xù)用于示蹤觀察線粒體轉(zhuǎn)移需要對該細(xì)胞進行分選純化。此外，該細(xì)胞經(jīng)多次傳代可能出現(xiàn)細(xì)胞衰老現(xiàn)象，對衰老細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)移相關(guān)功能驗證可能存在限制。

我們課題組前期研究表明，大劑量X 射線照射可以導(dǎo)致腸隱窩細(xì)胞系IEC-6 細(xì)胞凋亡［11］，其線粒體功能發(fā)生障礙。我們將標(biāo)記線粒體的DPSC（即DPSC-COX8A-DsRed2）與輻射損傷的IEC-6細(xì)胞進行共培養(yǎng)，成功捕獲了DPSC向輻射損傷的IEC-6細(xì)胞遞送線粒體這一生物學(xué)現(xiàn)象。本研究工作為后續(xù)開展DPSC 向輻射損傷腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)移線粒體所帶來的生物學(xué)效應(yīng)及其轉(zhuǎn)移機制研究提供了有用的工具。