中藥復(fù)方馥感啉口服液對(duì)不同年齡段SD大鼠發(fā)育毒性

郭健敏＊，張文強(qiáng)＊，鄧應(yīng)華，蒙飛彪，梁純，楊威

（1.廣州灣區(qū)生物醫(yī)藥研究院，廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司，廣東省藥物非臨床評(píng)價(jià)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心中藥非臨床評(píng)價(jià)分中心，廣東省創(chuàng)新藥物評(píng)價(jià)與研究工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510990；2.香港科技大學(xué)生命科學(xué)部，香港 999077）

馥感啉口服液（Fuganlin oral liquid，F(xiàn)GLOL）是一種已獲批上市使用的中藥復(fù)方制劑，來(lái)源于民間經(jīng)驗(yàn)方，主要用于治療兒童氣虛感冒所引起的發(fā)熱、咳嗽、氣喘和咽喉腫痛，在臨床上已使用超過(guò)半個(gè)世紀(jì)［1］。人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指導(dǎo)原則S11 指出，對(duì)于已上市中藥制劑擬增加兒科用藥人群范圍和（或）新適應(yīng)證時(shí)，若無(wú)系統(tǒng)的兒童用藥臨床和非臨床安全性評(píng)價(jià)資料，應(yīng)補(bǔ)充進(jìn)行幼齡動(dòng)物試驗(yàn)（juvenile animal study，JAS）［2］。JAS 評(píng)價(jià)指標(biāo)除一般狀況、體重、攝食量、血液學(xué)及組織病理檢查外，還根據(jù)不同年齡階段的幼齡動(dòng)物發(fā)育特征選擇具體的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，如體格、骨骼、神經(jīng)和性發(fā)育檢查等［3-4］。針對(duì)不同年齡段兒童用藥人群，本研究采用三段式JAS，評(píng)估FGLOL對(duì)不同年齡階段幼年SD大鼠的發(fā)育毒性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選用由孕15 日齡健康SD 大鼠自然分娩的仔大鼠128 只，雌雄各半，體重7～12 g，孕大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于廣東萊恩醫(yī)藥研究院SPF 級(jí)動(dòng)物房，自由攝食、飲水，動(dòng)物房環(huán)境溫度控制在20～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，每小時(shí)最小換氣次數(shù)15 次，12 h 光照/黑暗交替。本研究實(shí)施經(jīng)廣東萊恩醫(yī)藥研究院動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，編號(hào)：IA-SE2019032-01，02和03。

1.2 藥物、試劑和主要儀器

FGLOL（規(guī)格：每支30 mL，濃度：1079 mg·L-1，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025275；批號(hào)：SY1011-9001），廣州一品紅制藥有限公司；（R，S）-告依春、甘草苷、甘草酸銨和蒙花苷對(duì)照品（批號(hào)分別為：11753-202007，111610-201908，110731-201720和111528-201911），中國(guó)食品藥品檢定研究院。Agilent1260 型高效液相色譜儀和Agilent TC-C18型色譜柱，美國(guó)Agilent Technologies 公司；InAlyzer 型雙能X 射線動(dòng)物身體成分分析系統(tǒng)，韓國(guó)MEDIKORS公司；7180型全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；C3510 型全自動(dòng)凝血分析儀，中國(guó)北京普利生儀器有限公司；ELx808型酶標(biāo)分析儀，美國(guó)BioTek 公司；DM3000 型生物顯微鏡，德國(guó)LEICA公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組

根據(jù)FGLOL 臨床擬用的兒科人群，設(shè)計(jì)三段式JAS。第一階段給藥期為出生后4 日齡（postnatal day 4，PND4）至PND21（相當(dāng)于人類(lèi)≤2 歲嬰幼兒時(shí)期），恢復(fù)期PND22～PND42（相當(dāng)于人類(lèi)2～12歲兒童時(shí)期）；第二階段給藥期PND15～PND45（包括人類(lèi)嬰幼兒和兒童時(shí)期），恢復(fù)期PND46～PND61（相當(dāng)于人類(lèi)12～14 歲青少年時(shí)期）；第三階段給藥期PND40～PND105，恢復(fù)期PND106～PND134，此階段大鼠已進(jìn)入青少年時(shí)期，各大系統(tǒng)發(fā)育基本完全，故選擇與常規(guī)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)相結(jié)合的設(shè)計(jì)。

上述三段式JAS 中，均選用PND2仔大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，選擇每窩活仔數(shù)＞10只的整窩仔大鼠，將每窩仔鼠調(diào)整為雌雄各4 只，采用交叉撫育法［5］進(jìn)行分組，每階段試驗(yàn)均分為4 組，即溶劑對(duì)照組和FGLOL 3個(gè)劑量組，每組4窩，每窩8只，雌雄各半，共16 窩128 只，ig 給藥。第一階段：FGLOL 3.88，11.64 和38.75 g·kg-1（約相當(dāng)于臨床1 歲內(nèi)小兒日用量的1.1，3.3 和19.7 倍），給藥容積為5 mL·kg-1，每天1 次，給藥18 d，停藥觀察3 周；第二階段：FGLOL 3.88，11.64 和38.75 g·kg-1（約相當(dāng)于臨床＜6歲小兒日用量的1.7，5.0和16.8倍），給藥容積為10 mL·kg-1，每天1 次，給藥31 d，停藥觀察3 周；第三階段：FGLOL 29.06，58.13 和116.25 g·kg-1（約相當(dāng)于臨床7～12 歲兒童日用量的6.5，12.9 和25.7 倍），給藥容積為15 mL·kg-1，每天1 次，給藥66 d，停藥觀察4 周。溶劑對(duì)照組均給予等體積純水。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

三段式JAS 期間，每天觀察1 次大鼠的一般狀況，每3 d稱量1次仔大鼠體重；仔大鼠離乳后，每周測(cè)定1次攝食量；第一和第二階段試驗(yàn)期間，對(duì)各組大鼠的生長(zhǎng)發(fā)育（耳廓分離、下門(mén)齒萌出、睜眼、張耳、腹毛生長(zhǎng)、睪丸下降和陰道開(kāi)口等）和神經(jīng)反射發(fā)育（翻正反射、痛覺(jué)反射、視覺(jué)定位反射、聽(tīng)覺(jué)驚愕反射、嗅覺(jué)反射、觸須定位反射、斷崖回避反射和瞳孔對(duì)光反射）指標(biāo)進(jìn)行達(dá)標(biāo)率測(cè)定；第三階段試驗(yàn)期間，通過(guò)曠場(chǎng)和八臂迷宮2 項(xiàng)試驗(yàn)測(cè)定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，曠場(chǎng)試驗(yàn)主要測(cè)定大鼠的自主活動(dòng)方式和探索行為（總運(yùn)動(dòng)距離及中心、角落和邊緣運(yùn)動(dòng)距離），八臂迷宮試驗(yàn)主要測(cè)定大鼠的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)和記憶能力（總運(yùn)動(dòng)距離、潛伏期、工作記憶錯(cuò)誤和參考記憶錯(cuò)誤）。各階段試驗(yàn)自PND7起，每周檢查1 次大鼠體格（體長(zhǎng)）；于給藥期結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束時(shí)分別對(duì)各組16/32 和16/16 大鼠的全身和股骨骨密度（bone mineral density，BMD）進(jìn)行檢查；給藥期結(jié)束和恢復(fù)期結(jié)束采血并解剖各組16/32和16/16 只大鼠，用于白細(xì)胞（white blood cells，WBC）數(shù)、紅細(xì)胞（red blood cells，RBC）數(shù)、血小板（platelet count，PLT）數(shù)等血液學(xué)和凝血以及谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GLDH）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）和甘油三酯（triglycerides，TG）等血液生化指標(biāo)的檢測(cè)和組織病理檢查。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

觀察結(jié)果表明，在第一、第二和第三階段的給藥期和恢復(fù)期，各組仔大鼠吸乳、攝食、排泄和毛色等均未見(jiàn)明顯異常。

2.2 攝食量和體重

第一階段恢復(fù)期，F(xiàn)GLOL 3.88，11.64 和38.75 g·kg-1組大鼠攝食量均有增加現(xiàn)象，考慮停藥后大鼠為保持飽腹感會(huì)攝入更多飼料，判斷為正常的生理現(xiàn)象。其余各階段給藥及恢復(fù)期各給藥組大鼠攝食量均未見(jiàn)有指導(dǎo)意義的變化。

第一階段給藥前期，F(xiàn)GLOL 38.75 g·kg-1組雄性大鼠體重明顯低于溶劑對(duì)照組（P＜0.05），但組間差異＜10%，且未見(jiàn)劑量-毒性關(guān)系，認(rèn)為非藥物因素導(dǎo)致；第二和三第階段給藥期及恢復(fù)期，與溶劑對(duì)照組相比，F(xiàn)GLOL各劑量組體重增加均未見(jiàn)明顯差異（圖1）。

Fig.1 Effect of Fuganline oral liquid（FGLOL）on body mass of juvenile rats.A：stage 1，the juvenile SD rats were ig given pure water（vehicle control）and FGLOL（3.88，11.64 and 38.75 g·kg-1），once a day，for 18 d.Rats were observated for 21 d after administration（A）.±s，n=16 in administration period [postnatal day 4（PND4）-PND21]，n=8 in drug stop period（PND22-PND42）.B：stage 2，the juvenile SD rats were ig given pure water and FGLOL（3.88，11.64 and 38.75 g·kg-1），once a day，for 31 d.The remaining rats in each group were observed for 16 d after administration.±s，n=16 in period PND4-PND45，n=8 in period PND46-PND61.C：stage 3，the juvenile SD rats were ig given pure water and FGLOL（29.06，58.13 and 116.25 g·kg-1），once a day，for 66 d.The remaining rats in each group were observed for 28 d after administration.±s，n=16 in period PND40-PND105，n=8 in period PND106-PND134.1：male；2：female.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.3 生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)反射發(fā)育

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，第一和第二階段試驗(yàn)期間，與溶劑對(duì)照組相比、FGLOL 3.88，11.64 和38.75 g·kg-1組仔大鼠生長(zhǎng)發(fā)育和神經(jīng)反射發(fā)育各項(xiàng)檢查指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，達(dá)標(biāo)率均為100%。

Fig.2 Effect of FGLOL on neural reflex development of juvenile rats.See Fig.1C for the rat treatment.A1：open field walking distance of male rats；A2：open field walking distance of female rats；B1：latent period；B2：total distance；C1：working memory errors；C2：reference memory errors.±s,n=16.

第三階段試驗(yàn)期間，與溶劑對(duì)照組相比，F(xiàn)GLOL 29.06，58.13 和116.25 g·kg-1組仔大鼠開(kāi)闊場(chǎng)中總運(yùn)動(dòng)距離及中心、角落和邊緣運(yùn)動(dòng)距離均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；八臂迷宮試驗(yàn)中，F(xiàn)GLOL 各劑量組仔大鼠潛伏期、總運(yùn)動(dòng)距離、工作記憶錯(cuò)誤和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明各組仔大鼠在活動(dòng)正常情況下，未見(jiàn)活動(dòng)減少或焦慮行為，學(xué)習(xí)記憶能力亦呈現(xiàn)一致性。

2.4 體格

體格檢查結(jié)果表明，第一階段給藥期間，與溶劑對(duì)照組相比，F(xiàn)GLOL 38.75 g·kg-1組仔大鼠體長(zhǎng)均明顯降低（P＜0.05），停藥后逐漸恢復(fù)正常，提示在哺乳期ig 給予FGLOL 38.75 g·kg-1可能會(huì)影響仔大鼠的正常進(jìn)食進(jìn)而導(dǎo)致體重降低和體格發(fā)育減緩。第二和第三階段，與溶劑對(duì)照組相比，F(xiàn)GLOL 3.88 g·kg-1組（第二階段）及58.13 和116.25 g·kg-1組（第三階段）大鼠個(gè)別時(shí)間點(diǎn)體長(zhǎng)明顯降低（P＜0.05），但未見(jiàn)持續(xù)性降低，判斷此現(xiàn)象無(wú)生理學(xué)意義（圖3）。

Fig.3 Effect of FGLOL on body length of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：stage 1，±s，n=16（PND7-PND21），8（PND22-PND42）；B：stage 2，±s，n=16 in period PND7-PND42，n=8 in period PND45-PND65；C：stage 3，±s，n=16 in period PND7-PND105，n=8 in period PND106-PND134；1：male；2.female.＊P＜0.05，compared with vehicle control group.

2.5 骨骼

骨骼檢查結(jié)果表明，與溶劑對(duì)照組相比，3 個(gè)階段FGLOL各組大鼠的全身和股骨BMD均未見(jiàn)明顯差異（圖4），表明FGLOL對(duì)骨骼發(fā)育無(wú)明顯影響。

Fig.4 Effect of FGLOL on bone mineral density of juvenile rats.A：stage 1；B：stage 2；C：stage3；1：male；2.female.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=8.

2.6 血液學(xué)和凝血

血液學(xué)和凝血檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，在第一和第三階段給藥末期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL11.64和38.75 g·kg-1組（第一階段）及FGLOL 116.25 g·kg-1組（第三階段）大鼠WBC有明顯降低或升高變化，此變化無(wú)規(guī)律性且在恢復(fù)期得以恢復(fù)，判斷為無(wú)毒理學(xué)意義；第一和第二階段給藥末期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL 3.88 和11.64 g·kg-1組大鼠RBC 顯著升高（P＜0.05）；上述指標(biāo)變化均＜10%，且在恢復(fù)期與正常仔大鼠亦未見(jiàn)明顯差異，考慮到第一和二階段給藥期仔大鼠處于快速發(fā)育階段，RBC發(fā)育和分布均有一定差異，判斷上述變化無(wú)生理學(xué)意義。在第一階段給藥末期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL 3.88和38.75 g·kg-1組仔大鼠PLT 顯著降低（P＜0.05），但變化較小且在正常范圍內(nèi)，認(rèn)為此變化無(wú)毒理學(xué)意義。

Fig.5 Effect of FGLOL on hematology and coagulation of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：stage 1；B：stage 2；C：stage 3；1：white blood cells（WBC）；2：red blood cells（RBC）；3：platelet count（PLT）.±s，n=8.＊P＜0.05，compared with vehile control group of the same time and gender.

2.7 血液生化

血液生化檢測(cè)結(jié)果表明，在第二階段給藥末期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL 38.75 g·kg-1組仔大鼠GLDH 顯著降低（P＜0.05），在第一和第三階段給藥末期和恢復(fù)期、第二階段恢復(fù)期并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，判斷為無(wú)毒理學(xué)意義；第二和第三階段給藥末期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL 3.88 g·kg-1（第二階段）和FGLOL 116.25 g·kg-1組（第三階段）大鼠BUN均明顯增加（P＜0.05），但組間差異在正常范圍內(nèi)，恢復(fù)期未見(jiàn)此變化，判斷為無(wú)毒理學(xué)意義；第二和第三階段給藥末期和恢復(fù)期，與溶劑對(duì)照組比，F(xiàn)GLOL 3.88和38.75 g·kg-1（第二階段）和FGLOL 58.13 g·kg-1組（第三階段）大鼠TG 明顯降低或升高（P＜0.05），但數(shù)值呈無(wú)規(guī)律變化，且在正常范圍內(nèi)波動(dòng)，認(rèn)為此變化無(wú)生理學(xué)意義（圖6）。

Fig.6 Effect of FGLOL on blood biochemistry of juvenile rats.See Fig.1 for the rat treatment.A：stage 1；B：stage 2；C：stage 3；1：glutamate dehydrogenase（GLDH）；2：urea nitrogen（BUN）；3：triglycerides（TG）.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with vehile control group of the same time and gender.

2.8 組織病理變化

3 個(gè)階段組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，溶劑對(duì)照組和FGLOL 38.75 和116.25 g·kg-1組大鼠心、肝、脾、肺和腎等多個(gè)器官組織，除個(gè)別大鼠個(gè)別器官組織異常變化，其余未見(jiàn)明顯異常變化。3 個(gè)階段溶劑對(duì)照組和高劑量組部分器官組織病理照片見(jiàn)圖7。

Fig.7 Partial pathological photos of juvenile rats by HE staining.See Fig.1 for the rat treatment.

3 討論

近年來(lái)的臨床擴(kuò)展應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GLOL應(yīng)用于咳嗽變異性哮喘效果良好［6-7］。前期藥效學(xué)研究亦證實(shí)，其對(duì)屋塵螨及卵清蛋白誘發(fā)的幼齡動(dòng)物哮喘模型具有顯著改善作用［8-10］。因此，擬新增FGLOL 用于治療兒童哮喘適應(yīng)證的對(duì)癥治療。雖FGLOL 臨床用藥周期較短，但其覆蓋的臨床應(yīng)用兒科人群年齡段較廣，1 歲以內(nèi)～12 歲均可應(yīng)用。因此，在JAS中，如果按照全年齡段連續(xù)給藥，給藥周期遠(yuǎn)超過(guò)治療周期，可能會(huì)產(chǎn)生與臨床應(yīng)用相關(guān)性較小的毒性反應(yīng)，對(duì)藥物臨床應(yīng)用帶來(lái)阻礙［11-12］。本研究采用同一批孕大鼠分娩的仔大鼠，保持動(dòng)物背景一致；并在不同起始年齡段，根據(jù)臨床擬用藥周期和用藥兒童年齡的不同，分別給予短期、中期、中長(zhǎng)期用藥，根據(jù)發(fā)育年齡交叉覆蓋的原則［13-14］，設(shè)計(jì)了三段式JAS，旨在客觀評(píng)價(jià)FGLOL對(duì)幼齡大鼠的發(fā)育毒性。

三段式JAS 研究結(jié)果表明，使用同一批妊娠日期相同的孕大鼠分娩的仔大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，可以較好控制仔大鼠的生長(zhǎng)背景，各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)結(jié)果較為一致，更容易發(fā)現(xiàn)藥物的毒性反應(yīng)。妊娠日期相同的孕大鼠，分娩日期基本可控制在前后3 d，可滿足使用相同年齡的仔大鼠進(jìn)行3～4 個(gè)試驗(yàn)，統(tǒng)籌進(jìn)行減少了孕大鼠的使用數(shù)量，更符合動(dòng)物福利減少和優(yōu)化的設(shè)計(jì)要求［15］。在第三階段的研究中，由于起始給藥年齡與常規(guī)重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)?zāi)挲g一致，因此本研究將2 個(gè)試驗(yàn)糅合到一起，同時(shí)觀察JAS指標(biāo)和重復(fù)給藥毒性指標(biāo)，給藥劑量也較第一階段和第二階段有所增加。結(jié)果顯示，F(xiàn)GLOL安全性良好，未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的明顯毒性。

此外，本研究結(jié)果表明，第一階段給藥期間，F(xiàn)GLOL 38.75 g·kg-1明顯降低大鼠的體重增長(zhǎng)和體格發(fā)育，而FGLOL 3.88和11.64 g·kg-1無(wú)顯著影響，推測(cè)此現(xiàn)象與藥物濃度相關(guān)，對(duì)幼齡大鼠給予濃稠藥物會(huì)影響其覓乳，進(jìn)而影響身體發(fā)育必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，個(gè)別FGLOL 劑量組幼齡大鼠的體重、體格、血液學(xué)、凝血或血液生化指標(biāo)有明顯變化，但變化呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律性或幅度較小，且多在給藥期發(fā)生，恢復(fù)期得以恢復(fù)，判斷此類(lèi)變化無(wú)毒理學(xué)意義；而其他一般狀況、生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)反射發(fā)育、骨骼發(fā)育和組織病理檢查指標(biāo)均未見(jiàn)明顯改變；未見(jiàn)不良反應(yīng)劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）為各階段的高劑量。

綜上所述，F(xiàn)GLOL在PND4（約相當(dāng)于人類(lèi)嬰兒時(shí)期）起開(kāi)始ig 給藥，連續(xù)給藥18 d，對(duì)幼齡SD 大鼠NOAEL 為38.75 g·kg-1，相當(dāng)于臨床1 歲內(nèi)小兒日用量的19.7倍。FGLOL在PND15（約相當(dāng)于人類(lèi)嬰幼兒時(shí)期）起開(kāi)始ig 給藥，連續(xù)給藥31 d，NOAEL為38.75 g·kg-1，相當(dāng)于臨床＜6 歲小兒日用量的16.8倍。FGLOL在PND40（約相當(dāng)于人類(lèi)青少年時(shí)期）起開(kāi)始ig 給藥，連續(xù)給藥66 d，NOAEL 為116.25 g·kg-1，相當(dāng)于臨床7～12 歲兒童日用量的25.7倍。