海南茄子根結線蟲病原鑒定及抗性砧用種質篩選

鄒 敏 陶 濤 楊 洋 周珊珊 張世才 陳國康 王永清* 田時炳*

（1 重慶市農(nóng)業(yè)科學院，重慶 401329；2 西南大學植物保護學院，重慶 400716）

茄子（SolanummelongenaL.）是我國設施栽培的主要蔬菜之一，長期連作重茬栽培已導致嚴重的根結線蟲等土傳病害發(fā)生。利用抗性砧木進行嫁接栽培是控制茄子根結線蟲病害的有效措施（周寶利，1997；劉富中 等，2021）。

根結線蟲（Meloidogynespp.）是全球農(nóng)作物生產(chǎn)上重要的病原物之一，危害包括經(jīng)濟作物、糧食作物等在內的3 000 多種植物（Abad et al.，2003；Jones et al.，2013）。目前，國際上已報道的根結線蟲有100 余種（Bernard et al.，2017）。在我國，北方保護地設施蔬菜上最常見的是南方根結線蟲（M.incognita）（金娜 等，2022），而南方最常見的有南方根結線蟲、花生根結線蟲（M.arenaria）、北方根結線蟲（M.hapla）和爪哇根結線蟲（M.javanica）（趙磊 等，2010；賈美清和吳光紅，2011）。海南省是我國重要的南菜北運基地，也是主要的農(nóng)作物南繁南鑒試驗基地，但根結線蟲發(fā)生嚴重，病原種類繁多，且在不同地區(qū)和作物間存在不同優(yōu)勢種群。其中，湛江根結線蟲（M.zhanjiangensis）是危害海南省番石榴的優(yōu)勢種群（芮凱 等，2005），南方根結線蟲是危害海南省腎茶的優(yōu)勢種群（于旭東 等，2009），南方根結線蟲和象耳豆根結線蟲（M.enterolobii）是危害海南省葫蘆科蔬菜的優(yōu)勢種群（黃偉明，2010），擬禾本科根結線蟲（M.graminicola）是危害海南省水稻的優(yōu)勢種群（羅激光，2019）。近年來，研究人員通過對海南省18 個市縣的根結線蟲進行鑒定，明確象耳豆根結線蟲已取代南方根結線蟲成為蔬菜上的優(yōu)勢類群（龍海波等，2015；李周容 等，2020）。

本試驗于2019-2022年在重慶南繁南鑒蔬菜示范基地（海南省樂東縣利國鎮(zhèn)）茄子南繁加代時進行，利用形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定明確基地內茄子根結線蟲病原種類，通過病土苗期鑒定法與田間病圃誘發(fā)鑒定相結合，篩選高抗根結線蟲的茄子種質，以期為高抗根結線蟲茄子砧木的培育奠定理論依據(jù)和材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從重慶南繁南鑒蔬菜示范基地田間病圃采集根結線蟲病株根系，用于根結線蟲病原種類鑒定；58份砧用茄子種質由重慶市農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所茄科蔬菜創(chuàng)新團隊從全國各地搜集、保存（表1），用于根結線蟲抗性鑒定。本試驗田間病圃鑒定于2019年開始進行，在前期調查中已發(fā)現(xiàn)病情指數(shù)大于60 的感病種質LJ-12 等（即感病種質），且此次鑒定的種質中包含抗病種質水茄，因此，在病土苗期鑒定時不再另設抗病、感病對照。

表1 58 份砧用茄子種質編號及拉丁名

1.2 方法

1.2.1 病原體形態(tài)學鑒定 用手術刀在發(fā)病的植株根部直接挑取發(fā)育比較成熟的雌性線蟲若干于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察，輕壓線蟲，使其內容物流出，變得相對透明。用挑針固定線蟲，手術刀切割線蟲腹部末端，將線蟲分為前后兩大部分，后半部分繼續(xù)切割，整理殘片后觀察其會陰花紋并拍照記錄（劉丹 等，2021）；觀察線蟲前半部分的形態(tài)結構，切取頭部的口針，利用目尺在40 倍顯微鏡下分別測量線蟲口針長度和DEGO 長度（指背食道腺開口至口針基部球的距離）。

1.2.2 病原體 rDNA-ITS 鑒定 取植株發(fā)病部位進行研磨處理，使用DNA 提取試劑盒（TaKaRa 公司）提取根結線蟲DNA。使用特異性引物對提取的DNA 進行PCR 擴增。不同種類根結線蟲PCR擴增的特異性引物均參考李榮蘭等（2023）的方法進行設計，詳見表2。

表2 根結線蟲PCR 鑒定引物信息

PCR 反應體系為50 μL：25 μL 2×Es Tax Master Mix，19 μL ddH2O，2 μL 模板DNA，2 μL上游引物，2 μL 下游引物。PCR 反應程序為：94℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。使用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，膠回收之后送生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序。獲得的序列與NCBI 序列數(shù)據(jù)庫進行同源序列比對分析，利用MEGA 11.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 抗病性鑒定 病土苗期接種鑒定于2021年12月上旬進行。田間挖取根結線蟲重病植株根系周圍土層深5～25 cm 的土壤，與無病蟲商品育苗基質按照體積比1∶1 混勻，用于茄子種質育苗。每穴播種2～3 粒，常規(guī)育苗管理，間苗時每穴保留1 株壯苗。播種50 d 后將植株連根拔起，清水洗凈根部，調查各植株根結線蟲發(fā)病情況。3 次重復，每重復10 株。根結分級標準：0 級，無根結；1 級，1/3 以下須根有根結；3 級，1/3～2/3 的須根有根結；5 級，2/3 以上須根有根結或主根有根結。

田間病圃誘發(fā)鑒定于2019-2021年進行。每年9月中旬進行茄子育苗，10月中旬定植于基地根結線蟲病圃，每年每份種質定植20 株，翌年春季試驗結束時（2月中下旬）將植株連根拔起，調查根系根結線蟲發(fā)病情況。分級標準（張銘真，2017）：0 級，無根結；1 級，根結不明顯，占整株根系1%～5%；2 級，根結部分占整株根系6%～25%；3 級，根結部分占整株根系26%～50%；4 級，根結部分占整株根系51%～75%；5 級，根結部分占整株根系75%以上。

根據(jù)2 種抗病性鑒定方法調查的病情等級，計算病情指數(shù)：DI=∑（病級×該級病株數(shù)）／（最高病級×調查株數(shù)）×100，并根據(jù)各自3 次重復的結果計算平均病情指數(shù)。依據(jù)目前國際通行的以根結線蟲病情指數(shù)（DI）劃分抗性等級（陸景偉 等，2022）：DI=0，免疫（I）；0＜DI≤20.0，高抗（HR）；20.0＜DI≤40.0，抗?。≧）；40.0＜DI≤60.0，感?。⊿）；60.0＜DI≤80.0，中感（MS）；80.0＜DI≤100.0，高感（HS）。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲的形態(tài)學鑒定

顯微鏡下觀察到根結線蟲雌蟲會陰花紋，有1個呈方形的背弓，尾端區(qū)有1 個清晰的旋轉紋，平滑至波形，在側區(qū)出現(xiàn)斷裂紋和叉形紋?？卺樝虮巢繌澢?，針錐前半部呈圓柱狀，后半部呈圓錐狀，口針平均直徑為15.21 μm，DEGO 平均長度為2.98 μm。初步確定為南方根結線蟲（M.incognita）（圖1）或花生根結線蟲（M.arenaria）。同時，通過形態(tài)觀測根結線蟲30 頭，其中具有方形背弓的南方根結線蟲28 頭，檢出頻率為93.33%；而背線腹線在側線交叉的花生根結線蟲2 頭，檢出頻率僅為6.67%。表明南方根結線蟲是侵染海南茄子的優(yōu)勢類群。

圖1 南方根結線蟲形態(tài)特征（左為會陰花紋，右為口針及食道）

2.2 根結線蟲rDNA-ITS 鑒定

以提取的病原線蟲DNA 為模板，使用根結線蟲通用引物和5 種特異性引物進行擴增之后，南方根結線蟲特異性引物檢測得到長度為935 bp 的擴增片段（NanFang），花生根結線蟲特異性引物檢測得到長度為410 bp 的擴增片段（HuaSheng）。將其克隆后所獲得到的測序結果與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)用南方根結線蟲特異性引物擴增的序列與南方根結線蟲KP411871.1的一致性為99.89%，用花生根結線蟲特異性引物擴增的序列與花生根結線蟲MW315990.1 的一致性為99.76%，以爪哇根結線蟲（M.javanica）KF041313.1 作為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結果顯示，NanFang 和HuaSheng 這2 個序列分別與南方根結線蟲（M.incognita）、花生根結線蟲（M.arenaria）的序列聚為一類（圖2）。

圖2 基于不同根結線蟲rDNA-ITS 序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 砧用茄子種質的抗病性鑒定

兩種方法對58 份砧用茄子種質的抗病性鑒定結果見表3，病土苗期接種鑒定的病情指數(shù)為0～71.59，田間病圃誘發(fā)鑒定的病情指數(shù)為0.40～72.80，2 種方法鑒定參試種質的整體病情程度基本一致，病土苗期鑒定的總病情指數(shù)高于田間病圃誘發(fā)鑒定。其中，抗性等級相同的種質有34份，占58.62%，病情指數(shù)之差＜20.0 的種質有53份，占91.38%。病土苗期鑒定將參試種質抗性劃分為5 級，其中免疫1 份、高抗5 份、抗病25 份、感病22 份、中感5 份；田間病圃鑒定將參試種質抗性劃分為4 級，其中高抗9 份、抗病23 份、感病21 份、中感5 份。根據(jù)2 種方法的抗病性鑒定結果，對根結線蟲表現(xiàn)為高抗的砧用茄子種質有6份，分別為水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。

表3 58 份砧用茄子種質的根結線蟲病抗性鑒定結果

3 討論

本試驗發(fā)現(xiàn)，在重慶南繁南鑒蔬菜示范基地（海南省樂東縣利國鎮(zhèn)），茄子不是受單一根結線蟲種類侵染，而是由南方根結線蟲和花生根結線蟲復合侵染。根據(jù)顯微鏡下30 頭根結線蟲形態(tài)特征觀測顯示，具有方形背弓的南方根結線蟲檢出頻率占93.33%，而花生根結線蟲檢出頻率僅為6.67%，即南方根結線蟲為該南繁基地田塊的優(yōu)勢病原線蟲，該結果與前人研究結果基本一致（陳綿才 等，2001；賈本凱，2012）。據(jù)此，后續(xù)開展的茄子砧用種質抗病性鑒定所針對的病原線蟲為南方根結線蟲（M.incognita）。據(jù)研究報道，在我國重慶、四川等多數(shù)根結線蟲發(fā)病地區(qū)，南方根結線蟲是主要種類（羅佳 等，2021；陸景偉 等，2022）。因此在南繁基地獲得的茄子抗性評價結果，對重慶、四川等以南方根結線蟲為優(yōu)勢類群的地區(qū)具有重要參考及應用價值。

本試驗以田間病土作為接種病源，同時采用病土苗期接種鑒定和田間病圃誘發(fā)鑒定，2 種方法鑒定的茄子種質整體病情程度基本一致。其中，抗性等級評價相同的種質有34 份，抗性等級評價相鄰的種質有23 份，僅1 份種質（Ng1-047）抗性等級評價相差2 級（苗期評價為抗病，田間評價為中感）。同時，苗期鑒定的總病情指數(shù)高于田間鑒定，對于高抗種質的篩選更加嚴苛。對比2 種方法可知，82.76%的種質田間鑒定抗性評價級別優(yōu)于（或等于）苗期鑒定，其中3 份田間表現(xiàn)高抗的種質（BW9、Ng1-015、Ng1-018），苗期鑒定結果為抗病。因此，苗期鑒定方法可靠，同時縮短鑒定時間，為根結線蟲鑒定提供了新方法。最后，結合2種方法的鑒定結果，并以病情指數(shù)較高的結果進行最終評價，篩選出高抗根結線蟲的茄子砧用種質6份，這些種質可為茄子抗病育種奠定材料基礎。

4 結論

根據(jù)病原線蟲形態(tài)學和rDNA-ITS 分子生物學鑒定結果，確定南方根結線蟲為侵染海南茄子的優(yōu)勢類群；結合病土苗期接種與田間病圃誘發(fā)2 種方法的抗病性鑒定結果，篩選出高抗根結線蟲的砧用茄子種質6 份，分別為水茄、蒜芥茄、LJ-7、Ng1-039、Ng1-021、Ng1-003。