基于AMPK-GLUT4 軸探討桑葉生物堿對(duì)妊娠糖尿病小鼠糖耐量異常及胰島素抵抗的作用機(jī)制研究

喬艷華 白章瑩 王俊芳 李曉敏 田 瑩

1.河北省邯鄲市婦幼保健院保健科，河北邯鄲 056000；2.河北省邯鄲市婦幼保健院產(chǎn)科，河北邯鄲 056000；3.河北省邯鄲市婦幼保健院檢驗(yàn)科，河北邯鄲 056000；4.河北省邯鄲市婦幼保健院兒科，河北邯鄲 056000；5.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北邯鄲 056001

妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是妊娠期一種常見并發(fā)癥，在妊娠期首次發(fā)現(xiàn)或出現(xiàn)糖代謝異常，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是GDM 重要特征，IR 與葡萄糖和脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)異常密不可分[1]。目前，臨床治療GDM 主要方法為日常生活飲食、運(yùn)動(dòng)干預(yù)和胰島素注射等，由于治療效果差且長期服用降糖藥物存在潛在的副作用，故不適合GDM 治療。中藥能有效改善IR，桑葉作為治療糖尿病常用藥物之一，因其能減緩IR 作用引起眾多學(xué)者關(guān)注[2]。桑葉富含人體必需氨基酸，還包括多糖、黃酮、生物堿類等活性成分，具有抑菌、降血糖、抑制腫瘤、緩解炎癥、抗氧化等作用[3-5]。桑葉生物堿是從桑葉中提取的活性成分，具有降血糖、改善動(dòng)物腎損傷、氧化損傷等藥理作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以GDM 小鼠為研究對(duì)象，分析桑葉生物堿對(duì)小鼠糖耐量異常及IR 作用，旨在發(fā)掘桑葉生物堿在GDM 治療中的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠60 只和雄性小鼠30只，體重（20±3）g，6 周齡，購于上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2021-0010，合格證號(hào)：SCXK（滬）2021-0010，購入后保持室內(nèi)溫度（23±2）℃，空氣濕度（50±5）%，光照晝夜交替12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)河北省邯鄲市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物、主要試劑和儀器

桑葉生物堿（生產(chǎn)批號(hào)：19130-96-2，純度：98%）購于陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司；二甲雙胍（生產(chǎn)批號(hào)：100664-202106）購于中美上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號(hào)：S8050）購于北京Solarbio 公司；C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）（貨號(hào)：DG-Elisa）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）[貨號(hào)：YY（bio）-elisa-012145]酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購于美國R＆D 公司；蛋白BCA試劑盒（貨號(hào)：BCA1-1KT）購于美國Sigma 公司；兔抗鼠腺苷酸蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、磷酸化腺苷酸蛋白激酶（p-hosphorylated AMP-activated protein kinase，p-AMPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單抗、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（glucose transporters 4，GLUT4）多抗、羊抗兔二抗-HRP 購于英國Abeam 公司；80W-Mini-protean tetra 電泳儀、XCell ⅡBlot Module 小型轉(zhuǎn)印模塊垂直電泳槽購于美國SatanCruz 公司。

1.3 研究方法

1.3.1 建模、分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法取50 只處于發(fā)情期雌性小鼠，高糖脂飲食喂養(yǎng)6 周后與25 只雄性小鼠同籠過夜，次日，顯微鏡觀察雌性小鼠出現(xiàn)精子或黏液栓現(xiàn)象，即妊娠成功，記為妊娠第1 天，取受孕成功45 只雌性小鼠（5 只未受孕），妊娠5 d 后禁食12 h，腹腔注射35 mg/kg STZ 溶液，誘導(dǎo)GDM 模型[8]。造模后，禁食12 h，小鼠尾部取血，測其空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）；25%葡萄糖1 ml 灌胃，2 h 后于小鼠尾部采血，測其2 h 餐后血糖（2-hour postprandial blood glucose，2hPBG），若7.8 mmol/L≤2hPBG＜11.1 mmol/L 且持續(xù)1 周即造模成功[9]。

取建模成功的40 只小鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、桑葉生物堿低劑量組、桑葉生物堿高劑量組、陽性藥物組，每組10 只；選余下10 只未參與造模且妊娠成功的雌性小鼠做對(duì)照組。

1.3.2 干預(yù)方法 建模成功后，依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]的用量，桑葉生物堿低、高劑量組及陽性藥物組分別尾靜脈注射100、200、100 mg/kg 藥物溶液；對(duì)照組及模型組給予等體積無菌生理鹽水。1 次/d，共計(jì)8 周。

1.3.3 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（oral glucose tolerance test，OGTT）給藥第7 周進(jìn)行OGTT，各組小鼠禁食、不禁水12 h，25%葡萄糖溶液（2 g/kg 體重）灌胃后，采用尾部采血方法，測定并記錄小鼠0.5、1、2 h的血糖值。

1.3.4 生化指標(biāo)檢測 給藥第8 周依次通過血糖儀、全自動(dòng)分析儀檢測小鼠血清FBG 和空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INs），計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法（homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR），穩(wěn)態(tài)模型胰島β 細(xì)胞功能指數(shù)（homeostasis model assessment-pancreatic β-cell function，HOMA-β）。HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINs（μIU/ml）/22.5，HOMA-β=20×FINs（mU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5][10]。

1.3.5 細(xì)胞相關(guān)因子檢測 生化指標(biāo)檢測結(jié)束后，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測血清CRP、TNF-α、IL-6 水平?？贵w包被過夜（100 μl，37℃、60 min），加樣（100 μl，37℃、60 min），添加酶標(biāo)抗體（100 μl，37℃、60 min），底物液顯色（90 μl，37℃、10 min），終止液停止反應(yīng)（50 μl），酶標(biāo)儀測450 nm 處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CRP、TNF-α、IL-6 水平。

1.3.6 RT-PCR 檢測肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 表達(dá)處死小鼠，取肝臟組織，勻漿，用Trizol 法提取RNA，測純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA。反應(yīng)體系：1.5 μl Taq聚合酶、0.5 μl 正反向引物、4 μl 模板cDNA、13.5 μl ddH20。擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95℃，30 s）、變性（95℃，5 s）、退火（59℃，30 s），共40 個(gè)循環(huán)，加熔解曲線，降溫（50℃，30 s）。GAPDH 為內(nèi)參對(duì)照，采用2-△△Ct法，反復(fù)多次，取Ct 均值。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot 檢測肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白表達(dá) 處死小鼠，取肝臟組織，加RIPA 裂解液，離心（6 000 r/min，15 min，離心半徑為20 cm）取上清液，蛋白BCA 試劑盒測總蛋白濃度，樣品電泳分離（100 V，80 min）、轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶磷酸鹽緩沖液封閉2 h，樣品與AMPK（1∶200）、p-AMPK（1∶100）、GLUT4（1∶500）一抗4℃過夜孵育，TBST 緩沖液洗膜，加HRP 標(biāo)記IgG 二抗室溫孵育2 h（1∶2 000），洗膜、曝光、顯影。Image J 軟件測樣品及GAPDH 條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平計(jì)算，即目標(biāo)條帶與GAPDH 條帶灰度比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較進(jìn)行LSD-t 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠OGTT 血糖比較

整體分析發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組與模型組血糖時(shí)間、組間、交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：對(duì)照組2 h 血糖低于0.5、1 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組不同時(shí)間點(diǎn)血糖兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：模型組0.5、1、2 h 血糖高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 對(duì)照組與模型組不同時(shí)間點(diǎn)OGTT 血糖比較（mmol/L，±s）

表2 對(duì)照組與模型組不同時(shí)間點(diǎn)OGTT 血糖比較（mmol/L，±s）

注 與本組0.5 h 比較，aP＜0.05；與本組1 h 比較，bP＜0.05；與對(duì)照組同期比較，cP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。

整體分析發(fā)現(xiàn)：模型組與給藥組血糖時(shí)間、組間、交互作用比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：桑葉生物堿低、高劑量組不同時(shí)間點(diǎn)血糖兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。組間比較：桑葉生物堿低、高劑量組0.5、1、2 h 血糖低于模型組；桑葉生物堿高劑量組0.5、1、2 h 血糖低于桑葉生物堿低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 模型組與給藥組不同時(shí)間點(diǎn)OGTT 血糖水平比較（mmol/L，±s）

表3 模型組與給藥組不同時(shí)間點(diǎn)OGTT 血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與本組0.5 h 比較，aP<0.05；與本組1 h 比較，bP＜0.05；與模型組同期比較，cP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組同期比較，dP＜0.05。OGTT：口服葡萄糖耐量試驗(yàn)。

2.2 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較

模型組HOMA-IR 高于對(duì)照組，HOMA-β 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組HOMA-IR 低于模型組，HOMA-β 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組HOMA-IR 低于桑葉生物堿低劑量組，HOMA-β 高于桑葉生物堿低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較（±s）

表4 各組小鼠HOMA-IR、HOMA-β 比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。HOMA-IR：胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法；HOMA-β：穩(wěn)態(tài)模型胰島β 細(xì)胞功能指數(shù)。

2.3 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較

模型組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組血清CRP、TNF-α、IL-6 水平低于桑葉生物堿低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）

表5 各組小鼠血清CRP、TNF-α、IL-6 水平比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。CRP：C 反應(yīng)蛋白；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素-6。

2.4 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 比較

各組肝臟組織AMPK mRNA 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組肝臟組織GLUT4 mRNA 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組肝臟組織GLUT4 mRNA 高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組肝臟組織GLUT4 mRNA 高于桑葉生物堿低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 水平比較（±s）

表6 各組小鼠肝臟組織AMPK、GLUT4 mRNA 水平比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4。

2.5 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較

各組肝臟組織AMPK 蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組肝臟組織p-AMPK、GLUT4蛋白水平低于對(duì)照組（P＜0.05）；桑葉生物堿低、高劑量組肝臟組織p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于模型組（P＜0.05）；桑葉生物堿高劑量組肝臟組織p-AMPK、GLUT4 蛋白水平高于桑葉生物堿低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表7。

表7 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較（±s）

表7 各組小鼠肝臟組織AMPK、p-AMPK、GLUT4 蛋白水平比較（±s）

注 與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桑葉生物堿低劑量組比較，cP＜0.05。AMPK：腺苷酸蛋白激酶；p-AMPK：磷酸化腺苷酸蛋白激酶；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4。

3 討論

IR 指胰島素靶組織對(duì)胰島素敏感性及葡萄糖代謝能力下降，是代謝綜合征中心環(huán)節(jié)[11]。GDM 主要病理生理特征和2 型糖尿病類似，即出現(xiàn)明顯IR 現(xiàn)象和胰島素分泌不足，使得機(jī)體糖脂代謝紊亂，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)被異常激活[12-13]。因妊娠晚期機(jī)體內(nèi)激素變化使得胰島素敏感性減弱，胎盤分泌胰島素酶促進(jìn)機(jī)體胰島素降解，進(jìn)而導(dǎo)致生理性IR；妊娠前機(jī)體內(nèi)已存在IR 的患者，妊娠后期因胎盤分泌拮抗胰島素的激素增加，致使血糖升高、IR 增強(qiáng)，即病理性IR[14]。

被過度激活的母體炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)能影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，引起IR 從而導(dǎo)致糖脂代謝紊亂[15]。炎癥在IR 中發(fā)揮重要作用。CRP 作為炎癥標(biāo)志物，直接參與炎癥過程從而引起IR[16]。本研究結(jié)果顯示，桑葉生物堿可調(diào)控葡萄糖吸收速率，明顯提升GDM 小鼠口服葡萄糖耐量；且能有效抑制IR 發(fā)生，使血清HOMA-β 水平升高，HOMA-IR、CRP、TNF-α、IL-6 水平降低。提示桑葉生物堿能夠修復(fù)胰島細(xì)胞功能損傷、調(diào)節(jié)血糖、改善小鼠糖耐量異常與IR 作用。

參與IR 生物信號(hào)傳導(dǎo)途徑眾多，AMPK 是一種代謝主調(diào)節(jié)劑，與許多代謝疾病密不可分[17]。AMPK即AMP 依賴的蛋白激酶，廣泛參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)代謝過程，是以IR 為主要病理基礎(chǔ)的代謝性疾病臨床治療新靶點(diǎn)[18-19]。GLUT4 是AMPK 通路中胰島素調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，脂肪組織中GLUT4高表達(dá)可增強(qiáng)胰島素敏感性及葡萄糖耐量；GLUT4通路又在治療糖尿病中取得新進(jìn)展[20]。AMPK 可通過誘導(dǎo)GLUT4 向漿膜轉(zhuǎn)移或經(jīng)其磷酸化后啟動(dòng)GLUT4因子表達(dá)。且AMPK 磷酸化后可激活GLUT4 并促進(jìn)糖代謝[21]。AMPK 在調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、維持線粒體穩(wěn)態(tài)等多方面發(fā)揮改善機(jī)體IR 的作用[22]。中藥提取物基于AMPK 改善IR[23-24]。高迎春等[25]發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物能夠發(fā)揮抑制IR 作用，通過介導(dǎo)AMPK 上下游信號(hào)通路級(jí)聯(lián)，改善IR。本研究結(jié)果顯示，桑葉生物堿各劑量組肝臟組織p-AMPK蛋白、GLUT4 mRNA 和蛋白水平均較模型組升高。提示桑葉生物堿可能是通過AMPK-GLUT4 軸調(diào)控葡萄糖代謝，降低IR。

綜上所述，桑葉生物堿可改善GDM 小鼠炎癥反應(yīng)、調(diào)控血糖并抑制IR，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)MPKGLUT4 途徑有關(guān)。桑葉是藥食同源的一種物質(zhì)，開發(fā)桑葉活性功能成分，治療GDM 有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，前景廣闊。