經(jīng)典名方芍藥甘草湯古代與現(xiàn)代煎煮方法的差異性分析△

高永堅(jiān)，曾杉，林碧珊，陳偉彥，彭丹丹，董家銘，王艷霞

國藥集團(tuán)廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

經(jīng)典名方療效確切，傳承至今仍廣泛應(yīng)用，具有明顯的特色與優(yōu)勢。為支持經(jīng)典名方的研究及創(chuàng)新開發(fā)，促使其轉(zhuǎn)化成質(zhì)量高、療效好的經(jīng)典產(chǎn)品，國家相關(guān)部門相繼出臺了《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》[1]和《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[2]（以下簡稱《指導(dǎo)原則》）。經(jīng)典名方芍藥甘草湯出自東漢張仲景[3]的《傷寒論》，其中記載“傷寒脈浮，自出汗，小便數(shù)，心煩，微惡寒，腳攣急……若厥愈足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸”，原處方為“白芍藥、甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服”。張仲景的芍藥甘草湯被歷代醫(yī)家推崇，其加減組方一直沿用至今，是國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表（25首方劑）》[4]中的經(jīng)典名方之一。該方由白芍和炙甘草組成，白芍酸苦微寒，益陰養(yǎng)血；炙甘草甘溫，補(bǔ)中緩急。兩藥合用，有滋陰血、緩攣急的作用，臨床上用芍藥甘草湯治療肌肉痙攣、關(guān)節(jié)拘急、疼痛均有較好療效。根據(jù)《經(jīng)方本原劑量問題研究》[5]中東漢時(shí)期度量衡換算標(biāo)準(zhǔn)，一兩約為現(xiàn)代13.8 g，一升為200 mL，一合為20 mL。若按古代煎煮方法，則取白芍藥、炒甘草各55.2 g，加水600 mL，煮取至300 mL 的藥液，提取過程中飲片利用率低，致使大量飲片被浪費(fèi)。而現(xiàn)代臨床應(yīng)用多參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[6]，加水煎煮2次，可將飲片中有效成分充分提取，節(jié)省資源，降低成本。古今2種煎煮方法的制備工藝存在較大差異，因此本研究以干膏率、指紋圖譜及有效成分含量為考察指標(biāo)，進(jìn)一步進(jìn)行對比研究，優(yōu)化本方的制備工藝。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS105DU 型十萬分之一天平、AL104 型萬分之一天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品芍藥苷（批號：110736-202145，純度：94.6%）、沒食子酸（批號：110831-201605，純度：90.8%）、甘草苷（批號：111610-201607，純度：93.1%）、苯甲酸（批號：100419-201703，純度：99.9%）、甘草酸銨（批號：110731-201720，純度：97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷（批號：8619，純度：95.0%）、芹糖甘草苷（批號：6969，純度：98.0%）、異甘草苷（批號：6387，純度：98.0%）、甘草素（批號：4280，純度：98.0%）、苯甲酰芍藥苷（批號：4633，純度：95.0%）均購自成都德思特生物有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。白芍（購自安徽省亳州市，批號分別為BS301、BS302、BS303）、甘草（購自甘肅省定西市，批號分別為GC301、GC302、GC303）按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版[7]檢驗(yàn)均合格。白芍飲片按《中國藥典》2020 年版[7]炮制而得，炒甘草飲片按《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》2018 年版[8]炮制而得。

2 方法與結(jié)果

2.1 古代方法煎煮

取白芍、炒甘草各55.2 g，加入陶瓷壺中，加水600 mL，使用武火500 W 煮沸后，調(diào)至文火200 W煎煮30 min，350目篩趁熱濾過，得煎液。

2.2 現(xiàn)代方法煎煮

按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[6]方法煎煮，得煎液。

2.3 特征圖譜測定

2.3.1 供試品溶液的制備 取相當(dāng)于飲片量1 g 的古代煎煮方法制備的芍藥甘草湯煎液，精密稱定，置50 mL量瓶中，加水至約15 g，再加甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 取沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、甘草素、異甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，分別加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為80 μg·mL-1的混合溶液。

2.3.3 色譜條件 Waters Cortecs T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，5%A；4～15 min，5%～36%A；15～21 min，36%～100%A；21～25 min，100%～5%A），流速為0.25 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進(jìn)樣體積為1 μL。

2.3.4 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液與空白溶劑各1 μL 注入液相色譜儀測定，結(jié)果表明，在空白溶劑色譜相應(yīng)位置上無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，在供試品溶液色譜相應(yīng)位置上與對照品色譜相應(yīng)位置上的色譜峰都相對應(yīng)，說明該方法專屬性較好（圖1）。

2.3.5 精密度考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，所得色譜圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.3.3 項(xiàng)下色譜條件測定，所得色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取2 種方法制備的煎液適量，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h測定，所得色圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），其相似度均大于0.90，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 古代煎煮方法和現(xiàn)代煎煮方法的圖譜分析 按2.3.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，對比古代煎煮方法和現(xiàn)代煎煮方法的液相色譜圖（圖2）。在含相同飲片量的情況下，2 種煎煮方法所得煎液色譜圖的色譜峰數(shù)目基本一致，無明顯差異。

圖2 芍藥甘草湯古代煎煮方法和現(xiàn)代煎煮方法特征圖譜

2.3.9 特征圖譜的建立與共有峰指認(rèn) 將2 種煎煮方法的芍藥甘草湯色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012 版），進(jìn)行多點(diǎn)校正，以古代煎煮方法的特征圖譜為參照圖譜，建立芍藥甘草湯2 種煎煮方法的對照特征圖譜。由于1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖峰的峰分離效果差且峰面積小，故暫不考慮此峰。利用對照品比對法匹配了沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、芹糖甘草苷、甘草苷、苯甲酸、異甘草苷、甘草素、苯甲酰芍藥苷、甘草酸10 個(gè)共有峰。2 種煎煮方法的特征圖譜相似度均為0.996，大于0.99。

2.3.10 相對保留時(shí)間、相對峰面積及峰面積分析 以峰3芍藥苷為參照峰（S峰），2種煎煮方法的芍藥甘草湯共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積結(jié)果見表1，相對保留時(shí)間的RSD 均小于1.0%，表明各共有峰具有較高的相似性；在含相同飲片量的前提下，對比2 種煎煮方法所得煎液的相對峰面積，結(jié)果現(xiàn)代煎煮方法與古代煎煮方法的相對峰面積的RSD 均小于1.0%，表明其相對峰面積結(jié)果差異較小。但是，綜合分析2 種煎煮方法的色譜峰峰面積（表2），現(xiàn)代煎煮方法的主要色譜峰峰面積均在古代煎煮方法的2 倍以上，表明現(xiàn)代煎煮方法所得煎液中各化合物的含量高于古代煎煮方法，飲片利用率較高，現(xiàn)代煎煮方法明顯優(yōu)于古代煎煮方法。

表1 芍藥甘草湯古代煎煮方法與現(xiàn)代煎煮方法相對保留時(shí)間和相對峰面積

表2 芍藥甘草湯古代煎煮方法與現(xiàn)代煎煮方法共有峰的峰面積

2.4 含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 取相當(dāng)于飲片量1 g 的芍藥甘草湯煎液，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加水至約15 g，再加甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為100、50、100 μg·mL-1的混合溶液，即得。

2.4.3 色譜條件 芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測定采用2.3.3項(xiàng)下色譜條件。

2.4.4 專屬性考察 精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液與空白溶劑各1 μL，注入液相色譜儀測定，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，與空白溶劑相比，在供試品溶液色譜相應(yīng)位置上無對應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說明該方法專屬性較好。

圖3 芍藥甘草湯與混合對照品HPLC圖

2.4.5 線性關(guān)系考察 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為400 μg·mL-1的對照品儲備液；取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為400 μg·mL-1的對照品儲備液；取甘草苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度為200 μg·mL-1的對照品儲備液。分別取芍藥苷對照品儲備液和甘草酸銨對照品儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為400.0、200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg·mL-1的溶液；取甘草苷對照品儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg·mL-1的溶液。按2.4.3項(xiàng)下色譜條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得芍藥苷、甘草苷、甘草酸線性回歸方程分別為Y=4 990.9X-2 204.9（r=0.999 9）、Y=7 892.1X+3 833.3（r=1.000 0）、Y=3301X+930.56（r=1.000 0），結(jié)果表明芍藥苷、甘草苷、甘草酸在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取2.1 項(xiàng)下制備的煎液適量，按2.4.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.3 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD 分別為1.45%、1.70%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取2.1 項(xiàng)下制備的煎液適量，按2.4.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.3項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、3、6、9、12、24、36、48 h進(jìn)樣，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸峰面積的RSD分別為1.63%、1.65%、1.69%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.1 項(xiàng)下制備的煎液適量，按2.4.1 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.4.3 項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 分別為0.59%、0.69%、1.75%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的芍藥甘草湯煎液0.60、1.30、2.10 g，各平行處理3 份，分別按1∶1加入低（50%）、中（100%）、高（150%）質(zhì)量濃度的芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對照品溶液，按2.4.1 項(xiàng)下供試品溶液的制備方法處理后按2.4.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算芍藥苷、甘草苷、甘草酸的加樣回收率分別為102.35%、97.84%、100.76%，RSD分別為1.34%、1.38%、1.38%，表明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 芍藥甘草湯中3個(gè)成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 mg

2.4.10 樣品測定 取2 種方法制備的煎液適量，按2.4.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，參照2.4.3項(xiàng)下色譜條件測定，測得古代和現(xiàn)代煎煮方法煎液的芍藥苷、甘草苷、甘草酸處方量見表4，處方中芍藥苷、甘草苷、甘草酸處方量現(xiàn)代煎煮方法約為古代煎煮方法的2 倍。結(jié)果表明，現(xiàn)代煎煮方法的飲片利用率明顯高于古代煎煮方法。

表4 芍藥甘草湯古代和現(xiàn)代煎煮3個(gè)成分處方量

2.5 干膏率

分別取2 種煎煮方法制得的煎液約10 g，精密稱定，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，取出，置于干燥器中，冷卻0.5 h后，精密稱定質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算固含率，按公式（2）計(jì)算干膏率。

結(jié)果表明，芍藥甘草湯現(xiàn)代煎煮方法的干膏率明顯高于古代煎煮方法，且現(xiàn)代煎煮方法干膏率約為古代煎煮方法的2倍（表5）。

表5 芍藥甘草湯古代和現(xiàn)代煎煮方法的干膏量和干膏率

3 討論

經(jīng)典名方芍藥甘草湯由白芍和炒甘草2 味中藥組成，雖然藥味較少，但其化學(xué)成分復(fù)雜，不同煎煮方法可能導(dǎo)致復(fù)方中有效成分含量發(fā)生變化，進(jìn)而影響復(fù)方功效及臨床療效，因此考察煎煮方法尤為重要。芍藥甘草湯含芍藥苷、甘草苷、甘草酸和多糖等成分，芍藥苷為常用中藥白芍的主要有效成分，是一種單萜類糖苷化合物，具有抗自由基損傷、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、保護(hù)腦血管系統(tǒng)、抑制腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫作用等功效[9]；甘草苷和甘草酸是甘草的主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫作用[10]。本研究以干膏率、有效成分含量及指紋圖譜對芍藥甘草湯的2 種煎煮方法進(jìn)行差異性分析，推測產(chǎn)生差異的原因包括：1）白芍和甘草在處方中的劑量都比較大，按古代煎煮方法，煎煮水量較少、時(shí)間較短，不能將有效成分充分提取出來。2）按現(xiàn)代方法進(jìn)行煎煮所得處方的干膏率、有效成分含量是古代煎煮方法的2 倍。芍藥甘草湯的現(xiàn)代煎煮方法能較好地提取芍藥苷、甘草苷、甘草酸成分，其飲片的利用率高于古代煎煮方法，可以避免藥材的大量浪費(fèi)。

芍藥甘草湯原文記載為“以水三升，煮取一升五合，去滓”。結(jié)合《指導(dǎo)原則》[2]、《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[6]及具體情況，有必要合理確定制備工藝。芍藥甘草湯的現(xiàn)代煎煮方法能較好地提取芍藥苷和甘草苷等有效成分，且現(xiàn)代煎煮方法更易貼合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際情況，更適于制劑的工業(yè)轉(zhuǎn)化。綜合考慮，現(xiàn)代煎煮方法可能更適用于芍藥甘草湯的制劑開發(fā)。

綜上所述，本研究結(jié)合《指導(dǎo)原則》[2]，以制劑與基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量基本一致為目標(biāo)，從干膏率、有效成分含量、指紋圖譜角度對經(jīng)典名方芍藥甘草湯的2 種煎煮方法差異進(jìn)行探討分析，以期為煎煮工藝不明確的經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)制備及制劑生產(chǎn)研究提供參考。