載木犀草素納米膠束的制備及其大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

夏志丹，張忠元

武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430015

木犀草素（luteolin，LUT）是從木犀草科草本植物木犀草Reseda odorataL.中提取得到的一種黃酮類化合物[1]，具有消炎、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)活性[2]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)LUT 對(duì)乳腺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等腫瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用。然而，LUT 溶解度為6 μg·mL-1（37 ℃，pH 6.8）時(shí)，其較差的溶解性不利于口服吸收[6]，進(jìn)而嚴(yán)重影響藥物的臨床治療效果。近年來(lái)，研究人員將木犀草素制備成藥物共晶[7]、固體脂質(zhì)納米粒[8]、固體分散體[9-10]等不同新型給藥系統(tǒng)以提高藥物的口服生物利用度。然而，這些制劑有其局限性，如共晶是否會(huì)改變藥理作用尚不明確，固體脂質(zhì)納米粒存在放大生產(chǎn)困難、儲(chǔ)存穩(wěn)定性差等問(wèn)題，固體分散體穩(wěn)定性較差，久貯會(huì)發(fā)生老化現(xiàn)象。

膠束是由兩親性嵌段共聚物在水中溶解后自發(fā)形成的具有“核-殼結(jié)構(gòu)”的高分子聚集體，可以增加藥物的溶解度及滲透性，提高口服生物利用度，延長(zhǎng)藥物在血液循環(huán)中的半衰期，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非特異性攝取，改變藥物的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布，作為一種提高藥物溶解度和生物利用度的有效手段已引起廣大藥學(xué)研究者的廣泛關(guān)注[11]。為此，本研究以Pluronic F127 和Pluronic P123 作為膠束載體材料[12]，將木犀草素制備成納米膠束（nanomicelles，NMs），并通過(guò)大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)評(píng)估其口服生物利用度，為進(jìn)一步提高木犀草素的抗腫瘤的藥用價(jià)值研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

K2025 型高效液相色譜儀（海能未來(lái)技術(shù)集團(tuán)股份有限公司）；ZNCL-GS 型智能控溫集熱式水浴油浴鍋（河南佰年儀器有限公司）；RE-52A 型實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Zetasizer Nano ZS90 型動(dòng)態(tài)光散射儀（英國(guó)馬爾文公司）；JEM-2100Plus 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；M-F24G 型高速冷凍離心機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 試藥

LUT 原料藥（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，純度：98.5%）；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic）F127、Pluronic P123 均購(gòu)于德國(guó)巴斯夫公司；二氯甲烷（百靈威化學(xué)試劑公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)SD 大鼠12 只，2～3 月齡，體質(zhì)量為（200±20）g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2019-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（鄂）2019-0013]。本課題經(jīng)武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2022030012）。

2 方法與結(jié)果

2.1 LUT-NMs的制備

使用溶劑蒸發(fā)-薄膜水化分散法制備LUT-NMs。稱取不同質(zhì)量比的聚合物Pluronic F127 和Pluronic P123 加入到含有二氯甲烷20 mL 的圓底燒瓶中，攪拌溶解；再稱取一定質(zhì)量的LUT加到上述溶液中，攪拌溶解，最終形成透明狀溶液；將該溶液在45 °C水浴溫度和-0.1 MPa真空度下減壓蒸發(fā)揮干有機(jī)溶劑，在瓶?jī)?nèi)壁形成1層半透明狀薄膜；取蒸餾水10 mL加入到燒瓶中，持續(xù)振搖直至形成半透明狀混懸液，混懸液經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過(guò)，并在10 000 r·min-1高速離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液，即得到LUT-NMs。

2.2 包封率測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Aquasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（60∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.2 線性范圍 稱取LUT 原料藥約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，放冷至室溫，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相依次稀釋至0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μg·mL-1，按 照2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并以藥物質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，藥物平均峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸擬合，得回歸方程為A=28 745C-3867（r=0.999 9），表明LUT 在0.05～10.00 μg·mL-1時(shí)與峰面積線性關(guān)系良好。將對(duì)照品儲(chǔ)備液用流動(dòng)相逐步稀釋，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比約為3時(shí)確定為檢測(cè)限，當(dāng)信噪比約為10時(shí)確定為定量限。經(jīng)測(cè)定，LUT的檢測(cè)限質(zhì)量濃度0.01 μg·mL-1，定量限質(zhì)量濃度為0.05 μg·mL-1。

2.2.3 包封率測(cè)定 移取LUT-NMs 溶液1.0 mL 至25 mL 量瓶中，加入少量甲醇進(jìn)行超聲處理，破壞膠束結(jié)構(gòu)，加流動(dòng)相定容，樣品經(jīng)2.2.1 項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)藥物含量，根據(jù)公式（1）計(jì)算包封率。每份樣品測(cè)量3次，取平均值。

其中，W膠束表示包裹在膠束中的藥物含量，W投藥量表示投藥量。

2.3 粒徑及多聚分散系數(shù)（PDI）測(cè)定

取LUT-NMs 用25 ℃蒸餾水適當(dāng)稀釋后，使用Zetasizer Nano ZS90型動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)定其粒徑分布與PDI，在測(cè)定前樣品均需在25 °C條件下平衡180 s。計(jì)算平均值及SD。

目前，武術(shù)界普遍認(rèn)為“峨眉武術(shù)起源于春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，是指峨眉山區(qū)域的峨眉山道、僧武術(shù)與民間武術(shù)且以峨眉命名的各種拳術(shù)、器械、功法和武術(shù)理論等武術(shù)內(nèi)容與形式的總稱”。[3]

2.4 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化LUT-NMs 的處方 在前期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，聚合物與藥物質(zhì)量比（X1）、Pluronic F127 與Pluronic P123 質(zhì)量比（X2）是影響LUT-NMs 的包封率（Y1）、粒徑分布（Y2）和PDI（Y3）的主要因素。因此，本研究采用二因素三水平中心復(fù)合響應(yīng)面法研究這2 個(gè)自變量對(duì)LUT-NMs 的Y1、Y2和Y3的影響[13]。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)確定2 個(gè)變量的范圍，即X1為10∶1～50∶1，X2為1∶1～9∶1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變量見(jiàn)表1。共進(jìn)行了11 次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 LUT-NMs中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變量與水平

表2 LUT-NMs中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.4.2 模型選擇 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件處理，并使用線性回歸擬合線性（Linear）、雙因素交互作用（2FI）和多元二次模型（Quadratic）對(duì)Y1、Y2和Y3進(jìn)行評(píng)估[14]，選擇具有最高調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)（R2）和預(yù)測(cè)R2的模型進(jìn)行判斷（表3），確定Y1，Y2和Y3均采用多元二次模型進(jìn)行擬合，得到的多元二次方程：Y1=1.359 0+2.256 4X1+0.955 7X2-0.021 6X1X2；Y2=82.977 6-0.869 1X1-0.534 7X2+0.009 0X1X2；Y3=0.265 1-0.002 3X1+0.000 9X2-0.000 3X1X2。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到2 個(gè)自變量分別與3 個(gè)因變量之間的方差分析結(jié)果，見(jiàn)表4；關(guān)系圖見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 Y1、Y2和Y3的響應(yīng)面圖

圖2 Pluronic F127與Pluronic P123形成的聚合物膠束臨界膠束濃度（CMC）值

圖3 LUT-NMs的透射電鏡照片（×100 000）

表3 LUT-NMs中Y1、Y2和Y3模型擬合選擇結(jié)果

表4 LUT-NMs實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

表4 方差分析表明，X1和X2對(duì)LUT-NMs 的Y1具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1A 可知，在X1較低的條件下，藥物的Y1較低，這是由于大部分藥物未被膠束包載，藥物會(huì)以沉淀形式析出[15]；當(dāng)聚合物與藥物質(zhì)量比增大后，藥物包封率出現(xiàn)明顯增大趨勢(shì)。在X2較高的條件下，藥物的包封率增大，這是由于LUT 與疏水性較強(qiáng)的Pluronic F127 的親和力高于親水性較強(qiáng)的Pluronic P123，這就意味著當(dāng)Pluronic F127 在聚合物中占比較高時(shí)，會(huì)有更多的藥物被聚合物膠束包載[16]。

表4 方差分析表明，X1和X2對(duì)Y2具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1B 可知，隨著X1增加，Y2出現(xiàn)減小趨勢(shì)，這是由于在聚合物膠束內(nèi)部可以包載的藥物較高，而減少了藥物分子在膠束表面的吸附量[17]，進(jìn)而促使粒徑分布減小；隨著X2增加，Y2出現(xiàn)減小趨勢(shì)，這可能歸因于Pluronic F127 能夠形成更為緊密的膠束結(jié)構(gòu)，提高了膠束空間穩(wěn)定性[18]。

表4 方差分析表明，X1對(duì)Y3具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1C 可知，增加X(jué)1會(huì)降低Y3，并有利于粒徑的均勻分布（PDI降低）。

聚合物納米膠束經(jīng)口服給藥后，會(huì)被完整地吸收進(jìn)入體循環(huán)，因此聚合物納米膠束的包封率高、粒徑分布小且均勻就會(huì)有利于其被充分吸收[19]。因此，本研究以制備LUT-NMs的包封率最大、粒徑分布和PDI 最小為目標(biāo)值，經(jīng)實(shí)驗(yàn)軟件優(yōu)化得到最佳處方：X1為45∶1，X2為5∶1。

2.5 性質(zhì)評(píng)價(jià)

通過(guò)繪制可知，Pluronic F127 與Pluronic P123（質(zhì)量比為5∶1）所形成的聚合物膠束的CMC 值為0.049 mg·mL-1，CMC 值相對(duì)較低，表明其形成的膠束具有較高的穩(wěn)定性，即使在體液極度稀釋后也能保持完整性[21]。

2.5.2 微觀形態(tài) 取LUT-NMs 滴加到涂碳的銅網(wǎng)格上均勻鋪展，之后在LUT-NMs 樣品表面滴加1 滴質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1磷鎢酸染色液，負(fù)染10 min，紅外燈下干燥樣品，在透射電鏡下觀察LUT-NMs的微觀形態(tài)，見(jiàn)圖3。透射電鏡照片顯示，LUT-NMs呈球形，表面光滑，分散均勻，無(wú)聚集，大多數(shù)粒徑不超過(guò)50 nm。

2.5.3 稀釋穩(wěn)定性 為了評(píng)價(jià)LUT-NMs 在不同pH溶液中的抗稀釋能力，分別用pH 1.2、4.5、6.8 緩沖液將其稀釋至200 倍，在稀釋后的6、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)觀察外觀，取樣檢測(cè)LUT-NMs的粒徑分布，評(píng)估其物理穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 LUT-NMs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（,n=3） nm

表5 LUT-NMs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（,n=3） nm

稀釋穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LUT-NMs 經(jīng)pH 1.2、4.5、6.8 緩沖液稀釋后24 h 內(nèi)，樣品均無(wú)絮凝分層，也無(wú)藥物沉淀析出，粒徑基本無(wú)變化，表明LUT-NMs 在不同pH 溶液中具有良好的抗稀釋能力。這不僅與膠束的較低CMC相關(guān)，還可能是由于聚合物與LUT 之間存在的氫鍵或范德華力等作用力，可以預(yù)測(cè)LUT-NMs經(jīng)口服給藥進(jìn)入胃腸道內(nèi)可以保持完整性，并避免藥物泄漏[22]。

2.5.4 體外藥物釋放 采用動(dòng)態(tài)膜透析法考察LUT-NMs 在不同pH 介質(zhì)溶液中的釋藥速率。分別采用pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.5 乙酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，3 種介質(zhì)溶液中均加入質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1吐溫80 作為增溶劑，介質(zhì)溶液體積為200 mL，水浴溫度為37 ℃，磁子轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。取LUT-NMs 2 mL 加入到前處理好的透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量：12～14 kDa）中，系緊兩端，放入到釋放介質(zhì)中，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h）取出釋放介質(zhì)2 mL（并立即補(bǔ)充等量預(yù)熱的空白介質(zhì)），過(guò)濾后檢測(cè)藥物含量，繪制累積藥物釋放-時(shí)間曲線圖（圖4）。

圖4 LUT-NMs在不同pH介質(zhì)中的體外藥物釋放曲線（,n=6）

通過(guò)體外考察LUT-NMs 在不同pH 介質(zhì)中的釋藥速率來(lái)評(píng)估其在體內(nèi)環(huán)境中的可能的釋藥狀態(tài)。由釋放曲線可知，LUT-NMs 在不同pH 釋放介質(zhì)中藥物釋放速率基本一致，前期釋藥速率較快，推測(cè)是吸附在納米膠束表面的藥物釋放所致；而在后期釋藥速率較慢，可能是包裹在膠束內(nèi)部的藥物通過(guò)擴(kuò)散，或者載體材料溶蝕后藥物釋放所致。

2.6 藥動(dòng)學(xué)研究

采用體質(zhì)量為（200±20）g 的SD 大鼠對(duì)LUTNMs 進(jìn)行體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究。將大鼠隨機(jī)分為A 和B兩組（給藥前禁食12 h），A 組大鼠灌胃給予LUT混懸液（以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分散），B 組大鼠灌胃給予LUT-NMs，給藥劑量為40 mg·kg-1，分別在給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 從眼眶靜脈叢收集血液0.5 mL 至肝素化的離心管中，經(jīng)5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），用移液槍分離出血漿，并在-20 °C的冰箱中冷凍。取血漿200 μL加入鹽酸普萘洛爾（5 μg·mL-1）10 μL作為內(nèi)標(biāo)溶液，再將氫氧化鈉溶液（0.5 mol·L-1）20 μL 和乙酸乙酯300 μL置于血漿樣品中，渦旋混合2 min，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），小心收集有機(jī)相，在溫和的氮?dú)饬飨聦⒂袡C(jī)相揮干，將干燥后的殘?jiān)?0 μL 流動(dòng)相重新溶解，渦旋3 min，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液20 μL注入到HPLC 系統(tǒng)中，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)并計(jì)算血藥濃度，低、中、高3 個(gè)藥物濃度的血漿樣品的精密度RSD 均小于15%，絕對(duì)回收率為85%～115%，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則規(guī)定，該方法可用于LUT 在大鼠血漿中的含量測(cè)定。使用DAS 2.0 軟件擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表6，血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖5。藥動(dòng)學(xué)結(jié)果顯示，與口服LUT懸浮液大鼠相比，口服LUT-NMs的大鼠，其達(dá)峰時(shí)間（Tmax）明顯提前，藥物達(dá)峰濃度（Cmax）和藥時(shí)曲線下面積（AUC0-t）均顯著增加，半衰期（T1/2）明顯延長(zhǎng)，生物利用度提高了2.11倍。

圖5 大鼠口服LUT懸浮液和LUT-NMs后的血漿濃度-時(shí)間曲線（,n=6）

表6 LUT混懸劑和LUT-NMs經(jīng)大鼠口服給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（,n=6）

表6 LUT混懸劑和LUT-NMs經(jīng)大鼠口服給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（,n=6）

注：—表示無(wú)此項(xiàng)數(shù)據(jù)；#表示LUT-NMs與LUT混懸劑相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

普朗尼克（Pluronic）是由親水端聚環(huán)氧乙烷（PEO）和疏水端聚環(huán)氧丙烷（PPO）組成的兩親性三嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），分為多種型號(hào)。Pluronic 已被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)可用于體內(nèi)注射，該輔料無(wú)不良反應(yīng)，在體內(nèi)可生物降解，已在生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[23-24]。以Pluronic 作為納米膠束載體具有如下優(yōu)勢(shì)：1）嵌段共聚物的疏水端形成內(nèi)核，可將難溶性藥物包裹在其中，而親水端外殼則保護(hù)藥物免受水環(huán)境的影響；2）具有較低的CMC 值，解離速度慢，穩(wěn)定性好；3）可以提高難溶性藥物的生物利用度[25]。

已有多位研究人員將木犀草素制備成新型給藥系統(tǒng)用于提高藥物的口服生物利用度。例如，燕柳艷等[7]將木犀草素與哌嗪制備成共晶，改善了木犀草素溶解度和體內(nèi)生物利用度，同時(shí)提高了木犀草素的成藥性，然而，木犀草素制備成共晶，其藥理作用是否會(huì)進(jìn)一步發(fā)生改變，還有待深入研究發(fā)掘。楊娟等[8]將木犀草素制備成固體脂質(zhì)納米粒，可促進(jìn)木犀草素口服吸收，提高其生物利用度，但固體脂質(zhì)納米粒促進(jìn)藥物吸收的程度還會(huì)受到納米粒粒徑、納米材料性質(zhì)、表面活性劑種類、納米粒表面親水親脂性及空間特性、體內(nèi)穩(wěn)定性及跨膜吸收過(guò)程中諸多因素的影響，尚需作進(jìn)一步研究。李陽(yáng)杰等[9]采用溶劑揮發(fā)法將木犀草素磷脂復(fù)合物，其生物利用度提高2.09 倍，但溶解度增加不明顯。鄧向濤等[10]以PVP K30為載體，采用溶劑揮發(fā)法將木犀草素分別制備成固體分散體和木犀草素磷脂復(fù)合物固體分散體，2種固體分散體均可顯著提高藥物生物利用度，且磷脂復(fù)合物固體分散體提高更明顯，但制劑制備工藝較為苛刻，需要嚴(yán)格控制水分進(jìn)入反應(yīng)體系。

本研究結(jié)果僅限于木犀草素納米膠束（LUTNMs）的制備和初步體內(nèi)外評(píng)價(jià)，后續(xù)將對(duì)LUTNMs 在動(dòng)物體內(nèi)的組織分布、體內(nèi)安全性等進(jìn)行全面研究，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供更完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有望為提高木犀草素的抗腫瘤的藥用價(jià)值提供新的研究思路。