正源方抗肝纖維化的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證△

龐夏云，任美，蘇潔，周瑞*，劉妍如，宋忠興，唐志書，2*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西中藥資源產(chǎn)業(yè)化省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700

肝纖維化是存在于病毒性肝炎、酒精性肝炎等各種慢性肝臟疾病發(fā)展中的過程中，同時(shí)也是發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的必經(jīng)環(huán)節(jié)[1]。研究表明，肝臟慢性損傷后，處于靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞活化為肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過度積累形成肝纖維化[2-3]。肝纖維化為多數(shù)慢性肝病的共有病理特征，研發(fā)治療肝纖維化的藥物具有重要的意義。臨床上治療肝纖維化的藥物有免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和非特異性抗炎藥等，但此類藥物不良反應(yīng)明顯，不宜長(zhǎng)期服用[4]；傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療疾病具有多層次、多靶點(diǎn)、多途徑、不良反應(yīng)較小等特點(diǎn)，在肝纖維化防治方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[5]。

正源方是臨床經(jīng)驗(yàn)方，由西洋參、當(dāng)歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓組成，臨床上已應(yīng)用多年，具有扶正解毒、生血止血、益氣養(yǎng)陰等功效。本課題組前期完成了正源方提取工藝的研究及高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的建立[6]，同時(shí)證實(shí)了正源方可以改善過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，緩解放化療引起的白細(xì)胞減少及相關(guān)的氣血虧虛證[7-9]。中醫(yī)認(rèn)為濕熱瘀毒和肝郁氣滯是肝纖維化的病因病機(jī)，治療肝纖維化需以肝論治，遵循“方從法立，以法統(tǒng)方”的基本原則[10]?；谡捶椒稣舛尽⑸寡?、益氣養(yǎng)陰的功效，推測(cè)其可能通過促進(jìn)肝細(xì)胞增殖和改善肝的氧化損傷，調(diào)暢氣機(jī)、化瘀通絡(luò)，多方面發(fā)揮養(yǎng)肝護(hù)肝的作用。本研究探討正源方是否具有抗肝纖維化的作用，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法預(yù)測(cè)正源方抗肝纖維化的有效成分、作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，探究正源方抗肝纖維化的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

人肝星狀細(xì)胞LX2 購(gòu)于上海冠導(dǎo)生物工程有限公司。

1.2 試藥

西洋參（批號(hào)：20200701，產(chǎn)地：吉林）、南沙參（批號(hào)：20210301，產(chǎn)地：江蘇）、桔梗（批號(hào)：20210501，產(chǎn)地：陜西）、重樓（批號(hào)：20210102，產(chǎn)地：云南）、仙鶴草（批號(hào)：20200501，產(chǎn)地：陜西）、當(dāng)歸（批號(hào)：20201201，產(chǎn)地：甘肅）均購(gòu)于陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)劉世軍教授鑒定，分別為五加科植物西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根、桔梗科植物沙參Adenophora strictaMiq.的干燥根、桔?？浦参锝酃latycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根、百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.的干燥根莖、薔薇科植物龍芽草Agrimonia pilosaLedeb.的干燥地上部分、傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根。青霉素和鏈霉素（批號(hào)：J1600077，美國(guó)Hyclone 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：02B09A21）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：2001003）、胰蛋白酶（批號(hào)：0055019）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：2030099）均購(gòu)于以色列Biological Industries 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：D-5879，美國(guó)Sigma 公司）；重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1，批號(hào)：rcyc-htgfb1，美國(guó)InvivoGen 公司）；噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)：C0009S）、RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、蛋白酶磷酸酶抑制劑（批號(hào)：P1046）均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：PA115-01，天根生化科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)：TA-09）、PI3K（批號(hào)：60225-1-Ig）、兔二抗（批號(hào)：20000258）、鼠二抗（批號(hào)：20000144）均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K，批號(hào)：AF3241，江蘇親科生物研究中心有限公司）；蛋白激酶B（Akt，批號(hào)：4691S）、磷酸化Akt（p-Akt，批號(hào)：4060S）均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology；ECL 化學(xué)發(fā)光底物（批號(hào)：180-5001，上海天能科技有限公司）。

1.3 儀器

CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；LD5-2A 型低速離心機(jī)（北京雷博爾有限公司）；IX73 型倒置顯微鏡（奧林巴斯顯微光學(xué)技術(shù)公司）；Multiskan GO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、I50i/240i型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Micro17R 型微量冷凍離心機(jī)均購(gòu)于賽默飛世爾科技公司；164-5050 型電泳分析儀、ChemiDocXRS+型蛋白免疫印跡法（WB）曝光儀均購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad有限公司。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 正源方活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://tcmsp-e.com/），以類藥性（DL）≥0.18 和口服生物利用度（OB）≥30%為篩選條件，檢索正源方中當(dāng)歸、仙鶴草、西洋參、桔梗、南沙參、重樓的活性成分，并查閱文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充[11]。利用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）和Similarity Ensemble Approach（http://sea.bkslab.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索Canonical SMILES 號(hào)，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)所收集的靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化處理。

2.1.2 肝纖維化疾病靶點(diǎn)獲取 以“hepatic fibrosis”和“l(fā)iver fibrosis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）和 OMIM（https://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集肝纖維化疾病靶點(diǎn)，整合篩選得到肝纖維化疾病靶點(diǎn)，并運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)肝纖維化疾病靶點(diǎn)進(jìn)行校正。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利 用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線平臺(tái)獲得藥正源方與肝纖維化共有靶點(diǎn)，導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://String-db.org/）進(jìn)行分析，導(dǎo)出與靶點(diǎn)信息相關(guān)的.tsv 文件，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)文件，將network 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，使用插件CytoNCA 計(jì)算節(jié)點(diǎn)的連接度（degree）、介度（betweenness）和緊密度（closeness），篩選出大于二倍中位數(shù)值的靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)并對(duì)其進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

2.1.4 基因本體（GO）生物學(xué)和京都基因與基因組百科全書（KEGG）代謝通路富集分析 利用String 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)分析和KEGG 代謝通路富集分析，并通過在線作圖平臺(tái)微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO生物學(xué)功能氣泡圖（按P值從小到大排序的前5個(gè)條目）和KEGG 代謝通路富集分析氣泡圖（按P值從小到大排序的前20條通路）。

2.1.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)格的構(gòu)建 將KEGG代謝通路結(jié)果與藥物、成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中，構(gòu)建正源方抗肝纖維化的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

2.1.6 分子對(duì)接 選取藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)中較高度值的4 個(gè)活性成分木犀草素、槲皮素、熊果酸、擬人參皂苷RT5，6 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（Akt1）、Jun 原癌基因（JUN）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）和白細(xì)胞介素-2（IL-2），在PubChem 中獲取成分的3D 結(jié)構(gòu)，保存為.sdf格式。并在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)或PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）獲取靶點(diǎn)的3D 結(jié)構(gòu)，保存為.mol2 格式。將成分和靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)CSF Chimera 1.16 進(jìn)行分子對(duì)接，利用AutoDock Vina 插件驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能，將結(jié)合能較高位點(diǎn)可視化處理。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 正源方樣品處理 精密稱取正源方粉末80 mg 于5 mL 離心管中，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基高糖DMEM 4 mL溶解，用0.22 μm的濾膜濾過，制成質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1的母液，并稀釋至合適的質(zhì)量濃度備用。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX2 細(xì)胞置于含有10% FBS和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞相對(duì)密度至80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代，3代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將LX2 細(xì)胞以5×104個(gè)/mL密度培養(yǎng)于96 孔板，將其放入培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，接著加入20、50、100、200、500 μg·mL-1的正源方培養(yǎng)24 h，將0.5 mg·mL-1MTT 加入到96 孔板中，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入DMSO 150 μL，10 min 后，在酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各樣本吸光度（A），通過檢測(cè)不同質(zhì)量濃度正源方的細(xì)胞毒性，進(jìn)一步選擇正源方最適的質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 細(xì)胞分組 將LX2細(xì)胞分為對(duì)照組，模型組（TGF-β110 ng·mL-1），正源方低、中、高質(zhì)量濃度組（20、50、100 μg·mL-1）。

2.2.5 MTT 檢測(cè)正源方對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX2 細(xì)胞活力的影響 將LX2 細(xì)胞按照5×104個(gè)/mL 密度培養(yǎng)于96 孔板，將其放入培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，隨后加入用完全培養(yǎng)基配制的10 ng·mL-1TGF-β1活化24 h，再分別加入不同質(zhì)量濃度正源方培養(yǎng)24 h 后，加入MTT，4 h 后棄上清液，加入DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處各樣本A。

2.2.6 WB 分析檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 利用WB 檢測(cè)細(xì)胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 蛋白表達(dá)。收集6孔板中細(xì)胞，加入RIPA 裂解混合液（RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑）適量進(jìn)行細(xì)胞裂解提取總蛋白，使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，一抗稀釋比例按照說(shuō)明書進(jìn)行稀釋，4 ℃過夜，洗膜，孵育二抗，洗膜，曝光，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。利用Image J 1.53k 軟件檢測(cè)蛋白條帶，以GAPDH 作為蛋白載量對(duì)照，平行實(shí)驗(yàn)3次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 9.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 正源方活性成分及其靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及結(jié)合文獻(xiàn)查詢的相關(guān)結(jié)果[12-13]，收集得到正源方中西洋參、當(dāng)歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓6 味藥物的活性成分145個(gè)，活性成分靶點(diǎn)1109個(gè)，活性成分其中30個(gè)來(lái)自當(dāng)歸、34個(gè)來(lái)自西洋參、24個(gè)來(lái)自南沙參、26個(gè)來(lái)自桔梗、22 個(gè)來(lái)自仙鶴草、9 個(gè)來(lái)自重樓，部分活性成分基本信息見表1。

表1 正源方各藥味部分活性成分

3.2 肝纖維化疾病靶點(diǎn)的篩選

通過OMIM 及GeneCards 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，篩選得到1573個(gè)肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)。

3.3 核心靶點(diǎn)篩選及PPI的構(gòu)建

將正源方及肝纖維化靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0進(jìn)行處理，得到共同靶點(diǎn)415 個(gè)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，使用插件CytoNCA 計(jì)算各靶點(diǎn)的度中心性（degree centrality）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）及接近中心性（closeness centrality），通過設(shè)定度中心性>89、接近中心性>0.553、介數(shù)中心性>0.002 441 51，篩選得到的61個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖1。將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種為“智人（Homo sapiens）”，Clusters選擇“kmeans clustering”選項(xiàng)，設(shè)置3 個(gè)聚類集群，獲取PPI 圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中61 個(gè)節(jié)點(diǎn)、1538 條邊，平均度值50.4，可見節(jié)點(diǎn)大小與其度值呈正相關(guān)，PPI 富集P<0.01。通過網(wǎng)格分析，可得出核心靶點(diǎn)有Akt1、VEGFA、腫瘤壞死因子（TNF）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶3（MAPK3）、IL-1β、信號(hào)傳導(dǎo)和STAT3、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、腫瘤蛋白P53（TP53）等。

圖1 正源方作用于肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖2 正源方抗纖維化靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

采用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選的61 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物學(xué)功能富集分析，得到GO 條目共1753 個(gè)（P<0.05），其中生物過程（BP）條目1595 個(gè)，細(xì)胞成分（CC）條目53 個(gè)，分子功能（MF）條目105 個(gè)，分別占比91%、3%、6%。分別對(duì)3 個(gè)類別GO 分析中P值較小的前5 個(gè)條目以氣泡圖形式展現(xiàn)，見圖3。由GO 分析結(jié)果可知，正源方抗肝纖維化關(guān)鍵靶點(diǎn)中CC 主要分布在膜筏（membrane raft）、小窩（caveola）、囊泡腔（vesicle lumen）及細(xì)胞外間隙（extracellular space）等部位，MF 主要涉及信號(hào)受體結(jié)合（signaling receptor binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）及酶結(jié)合（enzyme binding）等，BP 主要有細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)（regulation of cell death）和細(xì)胞群增殖的調(diào)節(jié)（regulation of cell population proliferation）等。

圖3 正源方抗纖維化靶點(diǎn)GO富集分析

對(duì)61 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 代謝通路富集分析后得到174條信號(hào)通路（P<0.05），其中主要涉及癌癥信號(hào)通路（hsa05200）、乙型肝炎（hsa05161）、HIF-1信號(hào)通路（hsa04066）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（hsa04151）、TNF 信號(hào)通路（hsa04668）等相關(guān)通路，由富集結(jié)果可知，這些通路可能為正源方抗肝纖維化的關(guān)鍵通路，前20 條相關(guān)KEGG 代謝通路的氣泡富集可視化結(jié)果，見圖4。

圖4 正源方抗纖維化靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

3.5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖5。拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中的度值表示節(jié)點(diǎn)間連接數(shù)，度值越高，則表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中重要性越大[14]。從圖5中可知，西洋參、仙鶴草度值最高，說(shuō)明方中西洋參、仙鶴草可能為本方抗肝纖維化的主藥。導(dǎo)出數(shù)據(jù)后對(duì)度值進(jìn)行分析，得出度值靠前靶點(diǎn) 有STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA 和IL-2等，說(shuō)明正源方可能通過這些作用靶點(diǎn)調(diào)控肝纖維化；此外度值靠前的藥物成分有木犀草素、槲皮素、熊果酸、擬人參皂苷RT5等，提示正源方可能通過這些成分作用于STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA 和IL-2 等靶點(diǎn)；PI3K-Akt、TNF 等信號(hào)通路在通路中度值靠前，說(shuō)明PI3K-Akt、TNF 等信號(hào)通路在正源方調(diào)控肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 正源方抗纖維化靶點(diǎn)藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

3.6 分子對(duì)接

對(duì)藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)格中所篩選出的活性成分和關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，獲得主要活性成分與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)結(jié)合能，見表2，將分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見圖6。當(dāng)結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1（1 cal≈4.186 J）時(shí)，主要活性成分與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力；當(dāng)結(jié)合能≤-7.0 kcal·mol-1時(shí)，主要活性成分與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，結(jié)合能越低，主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能力越強(qiáng)[15]。分析圖表可知，木犀草素、槲皮素、擬人參皂苷RT5、熊果酸和木犀草素與STAT3、FGF2、Akt1、JUN、VEGFA和IL-2均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，初步驗(yàn)證了正源方具有潛在治療肝纖維化的作用。

圖6 正源方抗纖維化靶點(diǎn)關(guān)鍵成分對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接可視化分析

表2 正源方抗纖維化靶點(diǎn)主要活性成分與關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)結(jié)合能 kcal·mol-1

3.7 正源方對(duì)LX2細(xì)胞活力的影響

不同濃度的正源方對(duì)LX2 細(xì)胞活力的影響，見圖7A。當(dāng)正源方質(zhì)量濃度為20～100 μg·mL-1時(shí)，無(wú)明顯細(xì)胞毒性；當(dāng)正源方質(zhì)量濃度超過200 μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞活力降低，具有顯著差異（P<0.05，P<0.001）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇正源方質(zhì)量濃度為20、50、100 μg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖7 正源方對(duì)TGF-β1活化的LX2細(xì)胞活力影響（,n=3）

3.8 正源方對(duì)TGF-β1活化的LX2細(xì)胞活力的影響

如圖7B 所示，10 ng·mL-1TGF-β1活化LX-2 后細(xì)胞活力明顯上升（P<0.001），不同質(zhì)量濃度的正源方顯著抑制TGF-β1激活的LX2 細(xì)胞活力，且具有差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。此結(jié)果表明正源方可抑制TGF-β1激活的LX2細(xì)胞活力。

3.9 正源方對(duì)p-PI3K、PI3K、p-Akt 和Akt 蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt顯著升高（P<0.001）。與模型組相比，不同劑量的正源方給藥后，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 顯著降低（P<0.01，P<0.001），具有質(zhì)量濃度依賴性（圖8）。表明正源方可能通過抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路降低活化的LX2細(xì)胞活力，發(fā)揮治療肝纖維化的作用。

圖8 正源方對(duì)p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt蛋白表達(dá)的影響（,n=3）

4 討論

肝纖維化是各種致病因子（病毒、乙醇、自身免疫等）作用肝臟細(xì)胞，造成細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡的病理過程，在損傷因素持久刺激下，有可能進(jìn)一步進(jìn)展成肝硬化，甚至引發(fā)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，包括靜脈曲張出血、腹水、肝性腦病甚至死亡[16-17]。因此，尋找有效延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的治療策略是重大的臨床需求，研究表明中藥可通過減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成與沉積，抑制肝星狀細(xì)胞的活化等方面發(fā)揮抗肝纖維化作用，涉及PI3K-Akt 信號(hào)通路，Janus 激酶2（JAK2）-STAT3 的調(diào)控等[18-19]。正源方是由西洋參、當(dāng)歸、仙鶴草、南沙參、桔梗和重樓組成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，方中西洋參、當(dāng)歸、南沙參的多糖類化合物可保護(hù)肝臟[20-22]，仙鶴草、重樓、桔?？寡缀涂寡趸πэ@著，且仙鶴草不同部位提取物具有抗肝纖維化作用[23-25]，全方共奏益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、解毒活血之功，緩解肝積癥狀。因此，推測(cè)正源方在抗肝纖維化方面有較大潛力。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出正源方的活性成分作用靶點(diǎn)1109個(gè)，肝纖維化疾病靶點(diǎn)1573個(gè)，取得正源方活性成分作用靶點(diǎn)和肝纖維化疾病靶點(diǎn)共同靶點(diǎn)415 個(gè)，同時(shí)篩選出正源方中的多種有效成分如槲皮素、木犀草素、熊果酸和擬人參皂苷RT5等。大量研究表明，槲皮素具有多種藥理作用，可用于治療肝腎疾病、減緩肝纖維化的發(fā)展、抑制肝星狀細(xì)胞增殖[26-27]；木犀草素可抑制肝細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制肝星狀細(xì)胞活化[28]；熊果酸可能通過調(diào)控?zé)燉０废汆堰识塑账崃姿嵫趸?（NOX2）/ROS/Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）活化，減少促炎因子IL-1β的釋放，保護(hù)肝細(xì)胞以減少肝內(nèi)膠原沉積[29]。綜上所述，上述成分可能是正源方抗肝纖維化的主要活性成分。此外，通過PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選核心靶點(diǎn)包括Akt1、IL-1B、TNF等，說(shuō)明正源方可能通過以上核心靶點(diǎn)對(duì)肝纖維化發(fā)揮直接或者間接的治療作用。其中Akt1是PI3K-Akt通路中的重要靶點(diǎn)，且Akt1和Akt2異構(gòu)體在調(diào)節(jié)與酒精性肝病相關(guān)的炎癥和纖維化的發(fā)展中都能發(fā)揮作用[30-31]。PI3K-Akt 信號(hào)通路被激活后，Akt 可發(fā)生轉(zhuǎn)移并且與底物結(jié)合后可發(fā)揮作用，Akt 磷酸化活化后可影響靶蛋白活性，調(diào)節(jié)下游通路，促進(jìn)IL-1β、TNF-α炎癥因子的表達(dá)，誘發(fā)并加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致肝內(nèi)膠原過度分泌，加重肝纖維化病理進(jìn)程[32]。

KEGG和GO富集分析結(jié)果提示，正源方抗肝纖維化與多個(gè)靶點(diǎn)和多條生物途徑有關(guān)，其中顯示HIF-1 和PI3K-Akt 信號(hào)通路起著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道HIF-1 信號(hào)通路主要是缺氧癌細(xì)胞發(fā)生代謝重編程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，HIF-1通過減少氧氣消耗來(lái)抑制線粒體氧化代謝，確保缺氧時(shí)的氧穩(wěn)態(tài)[33]，在TGF-β1活化的LX2 細(xì)胞中，HIF-1 信號(hào)通路報(bào)道較少。研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號(hào)通路是肝星狀細(xì)胞活化與增殖導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要信號(hào)通路，可以調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)，并在乙肝病毒基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮作用[34-35]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，正源方可能通過抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路的激活，提高H2O2誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的活力，并抑制其細(xì)胞凋亡[9]，證實(shí)了正源方發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護(hù)作用與PI3K-Akt 信號(hào)通路有關(guān)，并且有文獻(xiàn)指出PI3K-Akt信號(hào)通路在TGF-β1誘導(dǎo)的LX2 細(xì)胞活化中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[36-38]。因此，本研究驗(yàn)證了正源方對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控作用。

肝星狀細(xì)胞在肝纖維化的形成中起著核心作用，在正常情況下肝星狀細(xì)胞為靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)出現(xiàn)炎癥或機(jī)械刺激損傷時(shí)，靜止的肝星狀細(xì)胞被激活轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并進(jìn)一步分泌細(xì)胞外基質(zhì)，影響肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞的重建，最終形成瘢痕組織，進(jìn)而演變?yōu)楦卫w維化[39]。TGF-β1是肝星狀細(xì)胞的一種有效的促纖維化細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[40]。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建TGF-β1誘導(dǎo)的LX2 細(xì)胞活化模型，進(jìn)行細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示正源方可顯著抑制TGFβ1激活的LX2 細(xì)胞活力，并降低p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平，說(shuō)明正源方抗肝纖維化作用機(jī)制與抑制PI3K-Akt 信號(hào)通路的激活，影響肝星狀細(xì)胞的活化有關(guān)，具體表現(xiàn)為下調(diào)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt水平，抑制活化后的LX2 細(xì)胞活力。然而，本研究?jī)H采用正源方提取物在細(xì)胞水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有一定的局限性，本課題組后續(xù)將進(jìn)一步分析正源方的入血成分，并進(jìn)行正源方動(dòng)物水平抗肝纖維化的作用研究。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法建立正源方抗肝纖維化的藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，接著運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)部分作用靶點(diǎn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，最后采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正源方抗肝纖維化機(jī)制可能與抑制肝星狀細(xì)胞活化，調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路有關(guān)。