富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對SH-SY5Y細(xì)胞及腦缺血/再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的機(jī)制研究△

陳克成，鄭毅男，楊力，李慶杰

1.沈陽市功能性蛹蟲草產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 沈陽 110013；2.仰望星空醫(yī)學(xué)研究院，吉林 四平 136001；3.遼寧生物時(shí)代健康食品有限公司，遼寧 沈陽 110013；4.澳大利亞三葉草健康研究院，澳大利亞 悉尼NSW 2000；5.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130021

腦卒中具有高發(fā)病率、致殘率和死亡率的特點(diǎn)，已成為一種主要危害健康的疾病，且近年來發(fā)病率和發(fā)病年齡呈上升趨勢。其中，缺血性腦卒中占比較大，對腦卒中急性期的有效治療是降低患者向后遺癥期發(fā)展的關(guān)鍵。蛹蟲草Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link.又稱北冬蟲夏草，屬子囊菌門，肉座目，麥角菌科[1]，是一種價(jià)值很高的食藥用菌，也是野生冬蟲夏草的理想替代物。蛹蟲草富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和其他生物活性成分，如核苷化合物、蟲草多糖、蟲草酸等，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、對抗炎癥、殺菌、阻止病毒復(fù)制及抗氧化自由基等藥理作用[2-3]。硒作為世界衛(wèi)生組織確定的必需營養(yǎng)素之一，是唯一具有免疫調(diào)節(jié)功能的營養(yǎng)素，其與抵抗病毒感染直接相關(guān)，使人體免疫的調(diào)節(jié)能力提高[4]。蛹蟲草與硒均具有明確的免疫調(diào)節(jié)作用，目前，人工栽培技術(shù)已可以指向性在蛹蟲草中富集硒元素，故富硒蛹蟲草提取物在目前市場流通中極具潛力。本研究探究富硒蟲草肽對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 和腦缺血/再灌注（I/R）損傷大鼠的保護(hù)作用，以支持富硒蟲草的神經(jīng)損傷修復(fù)作用。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體（SPF）級健康雄性SD 大鼠90只，體質(zhì)量（220±20）g，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號為SCXK（吉）2018-0007。長春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)本研究動物實(shí)驗(yàn)（批準(zhǔn)號：2022526）。

1.2 細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供。

1.3 試藥

尼莫地平片（nimodipine，批號：BJ18197，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；大鼠核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB（批號：20210303）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，批號：20210412）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1，批號：20210208）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號：20210709）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；丙二醛（MDA）測試盒（批號：20211006）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒（批號：20210930）、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（批號：20210927）、木瓜蛋白酶試劑盒（批號：20210713）均購自南京建成生物工程研究所；青霉素（批號：20210510，上海源葉生物科技有限公司）；富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽（SECM，富硒蛹蟲草子實(shí)體經(jīng)木瓜蛋白酶酶解后獲得，多肽含量90%；1 g SECM 相當(dāng)于20 g 富硒蛹蟲草子實(shí)體，批號：20220101）由遼寧生物時(shí)代健康食品有限公司提供；噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、岡田酸、脂多糖（LPS）均購自美國Sigma公司。

1.4 儀器

Neofuge 1600R 型臺式低溫高速離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器股份有限公司）；S10 型手提式高速分離器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；L3200 型線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司）；DHG-9031 型電熱恒溫水浴箱（上海精密儀器儀表有限公司）；680 型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；IX71 型倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；BC-J160S 型二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；LD5-2B 型離心機(jī)（北京雷勃爾離心機(jī)有限公司）；LDZX-30KBS型蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 動物實(shí)驗(yàn)

2.1.1 大鼠I/R 模型的制備 參考文獻(xiàn)[5]方法制備I/R 損傷模型，并將大鼠禁食12 h。經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛[0.35 mL·（100 g）-1]進(jìn)行麻醉，仰臥位固定在鼠板上，75%乙醇消毒大鼠頸部手術(shù)區(qū)域，沿頸部正中縱向切口，在切開皮膚并直接分離組織后，露出右頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），完全剝離血管表面迷走神經(jīng)。連接CCA 和ECA 的近端，用動脈夾暫時(shí)夾住CCA 的遠(yuǎn)端，在CCA 中離動脈分叉3 mm 處切開1 個(gè)小切口，通過小切口插入鋼絲螺栓的硅膠端，然后松開動脈夾，快速將線栓經(jīng)過動脈分叉處繼續(xù)送入ICA，當(dāng)線栓上的黑點(diǎn)接近動脈分叉處時(shí)減緩進(jìn)線栓的速度，感到輕微阻力時(shí)停止插入。結(jié)扎固定CCA 與線栓，在切口處給予青霉素預(yù)防感染，縫合切口，將線栓尾端留在皮膚外。將大鼠置于電熱毯上，缺血2 h后輕輕取出線栓，然后灌注24 h。

2.1.2 動物分組及給藥 取富硒蛹蟲草磨成粉，稱取l kg置于燒杯中，加入蒸餾水9000 mL，木瓜蛋白酶50 g，置水浴鍋中溫度55 ℃保持3 h。酶解結(jié)束再采用沸水浴10 min，4000 r·min-1離心10 min（離心半徑為9.4 cm）得上清液，減壓濃縮至500 mL即得SECM。取90只大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、SECM 低劑量組（SECM-L，4.86 g·kg-1）、SECM 中劑量組（SECM-M，8.10 g·kg-1）、SECM 高劑量組（SECM-H，11.34 g·kg-1）和尼莫地平組（15 mg·kg-1），每組15 只。給藥組大鼠每天灌胃給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。于第6 天晚上將大鼠禁食不禁水飼養(yǎng)，第7天按照模型制備方法造模。通過灌胃給予假手術(shù)組大鼠和模型組大鼠相同體積的蒸餾水。

2.1.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測

2.1.3.1 神經(jīng)功能評分 大鼠灌注24 h 后，利用Longa 五分制評分法對神經(jīng)功能進(jìn)行評價(jià)[5]：正常行走，沒有神經(jīng)功能破損，0 分；垂直提起時(shí)左前爪無力或未完全伸直，輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，1分；行走時(shí)轉(zhuǎn)到對側(cè)即左轉(zhuǎn)，中度局灶性神經(jīng)功能缺損，2 分；行走時(shí)向左側(cè)跌倒，嚴(yán)重局灶性神經(jīng)功能缺損，3分；不能自主行走，意識低下，4分。

2.1.3.2 生化指標(biāo)測定 將大鼠大腦前半部分按質(zhì)量-體積（1∶9）加入預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液，于冰上使用高速分離器制成腦組織勻漿，采用ELISA法檢測各組大鼠腦組織勻漿中NF-κB、VEGF、ICAM-1、PAI-1 的表達(dá)水平，MDA 含量，以及SOD、GSH-Px活性。所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 SECM 含藥血清制備 取SD 大鼠50只，分為空白對照組（蒸餾水）和SECM組（3 g·kg-1·d-1），每組25 只，灌胃給藥，給藥體積為10 mL·kg-1，每天2次，連續(xù)3 d。第3天晚7點(diǎn)禁食不禁水，第4天早上灌胃2 h 后，CCA 取血，分離血清，4 ℃、4000 r·min-1離心5 min（離心半徑為9.4 cm），取上層血清，在56 ℃孵育30 min 滅活后，將樣品用0.22 μm 微孔膜濾過并進(jìn)行殺菌，即得到含SECM血清，將其儲存在-20 ℃的冰箱中，備用。

2.2.2 SECM對SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用

2.2.2.1 SH-SY5Y 細(xì)胞存活率測定 將濃度為1×105個(gè)/mL 的處于對數(shù)生長時(shí)期的SH-SY5Y 細(xì)胞接種至96 孔板，每個(gè)孔均為100 μL，置于37 ℃，飽和濕度，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h后換新鮮培養(yǎng)基，空白孔和對照孔加入培養(yǎng)液150 μL 及空白血清50 μL，每組設(shè)3 個(gè)平行孔；樣品孔加入培養(yǎng)液150 μL 及含SECM 100%、50%、25%、12.5%、6.25%的血清50 μL，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，將每組的3 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育24 h，加入5 mg·mL-1MTT 溶液20 μL，并繼續(xù)孵育4 h。取出培養(yǎng)板，以2000 r·min-1離心10 min（離心半徑為9.4 cm），小心吸出上清液。加入DMSO 150 μL，振蕩10 min 以溶解晶體，并用酶標(biāo)儀在490 nm 處測量每個(gè)孔的吸光度（A），按公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2.2.2 SH-SY5Y細(xì)胞過氧化氫、岡田酸致細(xì)胞損傷的半數(shù)抑制濃度（IC50）測定 將岡田酸0.1 mg加入無血清培養(yǎng)基（40 μmol·L-1）3 mL，超聲處理5 min，使岡田酸全部溶解，分裝，-20 ℃保存，用前稀釋至所需濃度。將濃度為1×105個(gè)/mL的處于對數(shù)生長時(shí)期的SH-SY5Y細(xì)胞接種至96孔板，每孔均為100 μL，培養(yǎng)24 h后，對照孔分別加入培養(yǎng)液100 μL，樣品孔分別加入過氧化氫和岡田酸至終濃度分別為100、200、400、800 μmol·L-1和10、20、40、80 nmol·L-1，每組設(shè)3 個(gè)平行孔，將每組的3 個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT 法測定細(xì)胞存活率，通過擬合曲線，計(jì)算IC50。

2.2.2.3 SECM對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù) 將濃度為1×105個(gè)/mL的處于對數(shù)生長時(shí)期的SH-SY5Y細(xì)胞接種至96孔板，每孔均為100 μL，培養(yǎng)24 h后，空白孔、對照孔和模型孔各加入培養(yǎng)液200 μL，樣品孔設(shè)置5 個(gè)濃度梯度，分別加入培養(yǎng)液150 μL 及含SECM 100%、50%、25%、12.5%、6.25%的血清50 μL，培養(yǎng)12 h后，模型孔和樣品孔加入過氧化氫溶液，使過氧化氫終濃度為420 μmol·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT 法測定細(xì)胞存活率。該結(jié)果反映的是SECM 對過氧化氫損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。同法檢測SECM 對35 nmol·L-1岡田酸損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的Descriptive進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)，結(jié)果采用（）表示，組間比較釆用方差分析中的Dunnett法。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能評分

各組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀情況見表1。其中，尼莫地平組大鼠和SECM 給藥各組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀均明顯低于模型組大鼠，可見低、中和高劑量SECM 及尼莫地平均能改善I/R損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，且以高劑量SECM 組和尼莫地平組中大鼠改善效果最為明顯。

表1 各組大鼠的神經(jīng)功能結(jié)果 只

3.2 生化指標(biāo)測定結(jié)果

與假手術(shù)組對比發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦中MDA含量顯著提高（P<0.01），GSH-Px 和SOD 活性明顯下降（P<0.01）；與模型組比較，SECM 給藥組能明顯降低I/R 大鼠腦組織中MDA 含量（P<0.05，P<0.01），提高GSH-Px 和SOD 活性（P<0.05，P<0.01），見表2。

表2 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響（,n=10）

表2 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-Px的影響（,n=10）

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表3、表4同。

與假手術(shù)組相比發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦中PAI-1、VEGF 表達(dá)水平顯著提高（P<0.01）；與模型組相比發(fā)現(xiàn)，SECM 給藥組能明顯下調(diào)I/R 大鼠腦組織中PAI-1、VEGF 的表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01），見表3。

表3 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織PAI-1、VEGF的影響（,n=10）

表3 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織PAI-1、VEGF的影響（,n=10）

與假手術(shù)組相比發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦中NF-κB、ICAM-1 表達(dá)水平明顯提高（P<0.01）；與模型組相比發(fā)現(xiàn)，SECM 給藥組能明顯下調(diào)I/R 大鼠腦組織中NF-κB、ICAM-1 的表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01），見表4。

表4 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織NF-κB、ICAM-1的影響（,n=10）

表4 富硒蛹蟲草子實(shí)體多肽對大鼠腦組織NF-κB、ICAM-1的影響（,n=10）

3.3 對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用

3.3.1 SECM 對SH-SY5Y 細(xì)胞存活率影響 結(jié)果表明，SECM 對正常狀態(tài)下的SH-SY5Y 細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)具有促進(jìn)增殖作用，且呈量效關(guān)系（圖1）。

圖1 SECM作用下的SH-SY5Y細(xì)胞存活率（,n=3）

3.3.2 過氧化氫、岡田酸致SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的IC50隨著過氧化氫濃度的升高，對SH-SY5Y 細(xì)胞的損傷作用逐漸增強(qiáng)，通過擬合曲線計(jì)算其IC50為420 μmol·L-1（圖2、圖3）。同理，岡田酸致SHSY5Y 細(xì)胞損傷的IC50為35 nmol·L-1（圖4、圖5）。從2 種損傷因子的IC50值可以看出，SH-SY5Y 細(xì)胞對上述損傷因子的敏感性有很大區(qū)別，2 種細(xì)胞毒素作用強(qiáng)度比較為岡田酸>過氧化氫。

圖2 過氧化氫對SH-SY5Y細(xì)胞毒性（×100）

圖3 過氧化氫作用于SH-SY5Y細(xì)胞的IC50（,n=3）

圖4 岡田酸對SH-SY5Y細(xì)胞毒性（×100）

圖5 岡田酸作用于SH-SY5Y細(xì)胞的IC50（,n=3）

3.3.3 SECM 對SH-SY5Y 細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 取SH-SY5Y細(xì)胞與SECM預(yù)先孵育12 h后，加入損傷因子過氧化氫（420 μmol·L-1）、岡田酸（35 nmol·L-1），SECM（100%）對SH-SY5Y 細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用（表5），其中SECM（100%）對過氧化氫損傷的保護(hù)作用更為顯著。

表5 SECM對過氧化氫及岡田酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用（,n=3） %

表5 SECM對過氧化氫及岡田酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用（,n=3） %

注：與對照組比較，△△△P<0.001；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；表6同。

3.3.4 SECM對受損SH-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用 SECM（100%）對預(yù)先暴露于損傷因子過氧化氫（420 μmol·L-1）及岡田酸（35 nmol·L-1）的SH-SY5Y細(xì)胞均具有很好的修復(fù)作用（表6）。

表6 SECM對過氧化氫、岡田酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用（,n=3） %

表6 SECM對過氧化氫、岡田酸損傷SH-SY5Y細(xì)胞的修復(fù)作用（,n=3） %

4 討論

過氧化氫是一種活性氧，是活性很強(qiáng)的羥自由基的前體，其產(chǎn)物能夠穿透細(xì)胞膜對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[6]。過氧化氫誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死的主要機(jī)制是氧化應(yīng)激引起的自由基損傷[7]。岡田酸主要來源于一種海洋生物的提取物，是一種蛋白磷酸酯酶抑制劑[8]。岡田酸在體內(nèi)可抑制磷酸酯酶活性，產(chǎn)生高度磷酸化的蛋白質(zhì)[9]。Tau 是一種微管相關(guān)神經(jīng)元蛋白，岡田酸能夠引起tau的過度磷酸化，致使微管解聚，神經(jīng)細(xì)胞骨架破壞，正常軸突運(yùn)輸系統(tǒng)受損，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的退行性變化[10]。本研究結(jié)果提示：1）過氧化氫與岡田酸均能對SH-SY5Y 細(xì)胞造成損傷，其中岡田酸最嚴(yán)重。2）SECM 含藥血清對不同原因造成的SH-SY5Y 細(xì)胞損傷均具有很好的保護(hù)和修復(fù)作用，細(xì)胞的保護(hù)和修復(fù)作用可能是多因素的綜合效應(yīng)，即SECM 的作用途徑不是單一的，而是通過多種途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。3）抗氧化應(yīng)激損傷可能是SECM 對SH-SY5Y 細(xì)胞的主要保護(hù)途徑。

臨床上缺血性腦卒中多為半側(cè)大腦出現(xiàn)梗死，局灶性I/R 模型更符合缺血性腦血管病的特點(diǎn)。I/R引起的損傷主要有2 個(gè)因素，一個(gè)是由缺血引起的損傷，另一個(gè)是由血液供應(yīng)恢復(fù)導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷，故I/R模型是目前研究藥物對缺血性腦血管病治療作用的常用動物模型[11]。尼莫地平是第二代二氫吡啶Ca2+通道拮抗劑，具有親脂性，可通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，顯著減少腦梗死體積和神經(jīng)元凋亡，使短暫性局灶性腦缺血的損傷降低33%，是目前腦血管疾病治療的首選藥物，已成為公認(rèn)的神經(jīng)保護(hù)藥物，故本研究選用該藥物作為陽性對照藥[12]。缺血性腦卒中急性期可快速激活免疫炎癥反應(yīng)，引起繼發(fā)性腦損傷，血管黏附分子VCAM-1 和ICAM-1 水平是心腦血管疾病病變炎癥和活血效應(yīng)的重要評價(jià)指標(biāo)[13]。本研究結(jié)果表明，SECM 可明顯降低I/R 損傷大鼠腦組織中NF-κB 和ICAM-1 的表達(dá)水平。氧化應(yīng)激損傷通常被作為I/R期間導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的主要機(jī)制之一，MDA 作為氧化應(yīng)激的特異性標(biāo)志物，SOD 作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH-Px可清除體內(nèi)的脂類氫過氧化物，三者均是氧化應(yīng)激過程中首要檢測指標(biāo)[14]。本研究結(jié)果顯示，SECM組大鼠腦組織中MDA 含量較模型組明顯降低，而GSH-Px 和SOD 活性明顯升高，說明抗氧化亦是SECM 保護(hù)腦組織的機(jī)制之一。PAI是纖維蛋白原激活劑的生理抑制劑，由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放。體內(nèi)PAI 水平越高，血栓形成的可能性越高，危險(xiǎn)因素越高[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SECM 可明顯降低模型組大鼠腦組織中PAI-1 的表達(dá)水平。VEGF 是已知的最有效和特異性強(qiáng)的血管生長因子，用于血管再生，神經(jīng)保護(hù)和缺血后神經(jīng)元再生及對腦損傷的保護(hù)[16]。在本研究中，SECM 組大鼠腦組織中VEGF水平明顯降低，說明SECM 具有活血化瘀和腦神經(jīng)保護(hù)作用。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛹蟲草多糖具有提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、改善酒精性肝損傷等多種活性[17]。本研究考察了SECM 對SH-SY5Y 細(xì)胞的影響，結(jié)果表明富硒蛹蟲草多肽具有很好的神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞保護(hù)修復(fù)作用。同時(shí)，本研究通過制備大鼠腦I/R 模型，發(fā)現(xiàn)SECM 對腦I/R大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，為將其開發(fā)為創(chuàng)新藥物提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。