天山雪蓮總酚酸對(duì)脂多糖刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子釋放的影響及其機(jī)制研究△

顏麗珊，邱新宇a，康建英，顧春宇，張碩峰，張超，王亦巍，孔靜，羅贛*，張翼*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.北京遠(yuǎn)大九和藥業(yè)有限公司，北京 102433

炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫應(yīng)答中的重要部分，可被外源性病原體相關(guān)分子模式或內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式激活，促進(jìn)免疫細(xì)胞的募集，進(jìn)而啟動(dòng)高效的組織修復(fù)[1]。同時(shí)，炎癥反應(yīng)參與疾病發(fā)生發(fā)展。在疾病急性發(fā)作期間，組織常駐細(xì)胞感知炎性刺激物，釋放大量細(xì)胞因子、趨化因子、自由基等炎癥介質(zhì)，募集中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等到達(dá)病灶，釋放更多炎癥因子，導(dǎo)致免疫失衡[2]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等慢性炎癥性疾病中，巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等的長(zhǎng)期浸潤可導(dǎo)致組織損傷、纖維化甚至失去功能[3]?？梢?，改善炎癥反應(yīng)是治療炎性疾病的關(guān)鍵策略之一。

天山雪蓮（Saussureae Involucratae Herba）是維吾爾族常用藥，具有溫腎助陽、祛風(fēng)勝濕、通經(jīng)活血的功效，臨床上用于治療關(guān)節(jié)炎[4]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5]、腱鞘炎[6]、胰腺炎[7]等疾病。現(xiàn)代研究顯示天山雪蓮含有黃酮、酚酸、木脂素、苯丙素類化合物等多種活性成分[8]，具有抗炎[9-10]、抗氧化[11]、抗腫瘤[12-13]、改善脂代謝[14]等藥理作用?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版中規(guī)定蘆丁、綠原酸為天山雪蓮的質(zhì)量控制成分[15]。本課題組前期研究結(jié)果表明天山雪蓮富含蘆丁的黃酮有效部位具有良好的抗炎活性[16]，而天山雪蓮富含綠原酸的總酚酸類成分抗炎作用尚不明確。因此，本研究運(yùn)用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型，在體外探討天山雪蓮總酚酸（PSI）抗炎的作用及其機(jī)制，有利于開發(fā)利用天山雪蓮資源。

1 材料

1.1 細(xì)胞

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 細(xì)胞株由北京中醫(yī)藥大學(xué)朱枝祥副教授惠贈(zèng)。

1.2 樣品

天山雪蓮購自新疆當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)羅贛副教授鑒定為Saussurea involucrata（Kar.et Kir.）Sch.-Bip的干燥地上部分。

1.3 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：A22GB158496，純度≥98%）購于上海源葉生物技術(shù)科技有限公司；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-201811，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；分析級(jí)乙醇、甲醇、甲酸、氫氧化鈉和鹽酸購于北京化工廠；Griess 試劑（批號(hào)：SLBZ0827）、LPS（批號(hào)：0000110441）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：WXBD4591V）購于美國Sigma 公司；噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)：0793）、牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：0332060311）、制膠溶液（批號(hào)分別為4680083111、4880070211、3291040121）和脫脂奶粉（批號(hào)：7861012421）購于北京蘭博利德商貿(mào)有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：2233206）、青霉素-鏈霉素雙抗試劑（批號(hào)：2149393）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：2233207）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：2233203）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：2231188）購于以色列Biological Industries 公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）抗猝滅封片劑（批號(hào)：D4911830）購于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液（批號(hào)：092120201120）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；前列腺素E2（PGE2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（批號(hào)：011071907B）購于英國Enzo Life Sciences公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6，批號(hào)：219273-001）、IL-10（批號(hào)：178229001）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)：20499005）、趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1，批號(hào)：214571002）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α（MIP-1α，批號(hào)：221767-001）、色譜級(jí)乙腈（批號(hào)：212213）、調(diào)節(jié)激活正常T 細(xì)胞表達(dá)分泌因子（Rantes，批號(hào)：189155002）ELISA 試劑盒購于美國Thermo Fisher 公司；核蛋白提取試劑盒（批號(hào)：20211217）購于北京索萊寶科技有限公司；化學(xué)發(fā)光底物（ECL）溶液（批號(hào)：180-5001）購于上海天能科技有限公司；一抗β-肌動(dòng)蛋白（βactin）、核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB/p65、磷酸化（p）-NF-κB/p65、κB 抑制因子（IκB）α、p-IκBα、p-IκB激酶（IKK）α/β、TANK 結(jié)合激酶1（TBK1）、p-TBK1、c-Jun、p-c-Jun、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）p38、p-p38、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2、p-ERK1/2、c-jun N-末端激酶（JNK）、p-JNK抗體、Alexa 488 山羊抗兔二抗和辣根過氧化氫酶（HRP）山羊抗兔二抗均購于美國CST 公司；一抗IKKα（批號(hào)：#D0717）、特異性蛋白-1（Sp1，批號(hào)：#B1317）購于美國Santa Cruz 公司；一抗干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）抗體（批號(hào)：GR3257922-1）、山羊抗小鼠二抗（批號(hào)：GR3395730-9）購于英國Abcam公司；P-IRF3抗體（批號(hào)：04866#220）購于亞諾法生技股份有限公司。

1.4 儀器

AB-8 型大孔樹脂（南開大學(xué)化工廠）；ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard? Pre-Column（1.8 μm）均購于美國沃特世公司；FD-1D-80 型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；Milli-Q?Reference 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；Heracell 150I 型二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；BJ-2CD 型超凈工作臺(tái)（上海博迅公司）；Spectrostar Nano 型酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH 公司）；5810R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德公司）；UltraVIEW VOX 型轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡（美國PerkinElmer 公司）；SIMF140BDL 型制冰機(jī)（日本松下公司）；5200 型多道化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PowerPac HC型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 PSI的富集

稱取天山雪蓮70 g并粉碎，加入70%乙醇700 mL回流提取，重復(fù)3 次，每次1 h。用紗布濾過后，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，并于60 ℃真空干燥，得到天山雪蓮乙醇提取物（17.82 g，出膏率25.46%）。AB-8 型大孔樹脂使用前用乙醇浸泡過夜，再用水洗至無醇味。依次用5%氫氧化鈉溶液和5%鹽酸浸泡5 h，然后水洗至中性，于60 ℃過夜干燥。預(yù)處理后的樹脂濕法裝柱（100 cm×3.5 cm），徑高比為1∶8，柱體積（BV）為270 mL。將天山雪蓮乙醇提取物16 g 與水50 mL混合并超聲30 min，然后注入樹脂柱中，流速為2 BV·h-1。4 BV 水洗滌后，依次用15%乙醇和40%乙醇各6 BV在室溫下洗脫，收集第4 BV的水洗脫液和15%乙醇洗脫液，在60 ℃真空干燥，得到PSI凍干粉（949.9 mg）。

2.2 天山雪蓮乙醇提取物、PSI 中綠原酸和蘆丁的含量測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備 分別精密稱取天山雪蓮乙醇提取物0.023 9 g 及PSI 0.005 4 g，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即分別得天山雪蓮乙醇提取物供試品溶液和總酚酸供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取綠原酸對(duì)照品4.41 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.441 mg·mL-1的綠原酸母液。精密稱取蘆丁對(duì)照品3.26 mg，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.326 mg·mL-1的蘆丁母液。精密移取綠原酸母液290 μL、蘆丁母液770 μL至同一個(gè)2 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得綠原酸質(zhì)量濃度為63.945 μg·mL-1、蘆丁質(zhì)量濃度為125.51 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 色譜條件 采用ACQUITY UPLC? HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）和Van Guard?Pre-Column（1.8 μm）進(jìn)行乙醇提取物、總酚酸中蘆丁和綠原酸的含量測(cè)定。流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，5%～9%A；6～12 min，9%～13%A；12～19 min，13%～16%A；19～28 min，16%～17%A；28～40 min，17%～28%A），流速為0.3 mL·min-1，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RAW264.7 細(xì)胞用含10% 血清和1% 雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)皿中的細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代或分盤。PSI凍干粉用PBS溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到PSI 母液，存儲(chǔ)于-20 ℃?zhèn)溆?。將?xì)胞分為對(duì)照組、LPS 組和PSI 不同質(zhì)量濃度給藥組。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

將RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔6×103個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度（6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00、300.00、400.00 μg·mL-1）的PSI孵育1 h。除對(duì)照組外，各組加入LPS（終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1）孵育24 h 后，每孔加入5 mg·mL-1的MTT 溶液（終質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1）10 μL，在37 ℃孵育3 h。棄上清液，用100 μL/孔DMSO 溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀570 nm 測(cè)量每孔的吸光度。

2.5 Griess法檢測(cè)一氧化氮（NO）釋放水平

將RAW264.7 細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板上，每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度PSI孵育1 h。除對(duì)照組外，每孔加入LPS（終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1）培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，-20 ℃儲(chǔ)存。96 孔板每孔加入培養(yǎng)液100 μL，再加入Griess 試劑100 μL，在室溫孵育10 min 后，在酶標(biāo)儀540 nm 測(cè)定吸光度，利用NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO的生成量。

2.6 ELISA檢測(cè)炎癥因子釋放水平

按照各ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)板經(jīng)過封閉，加入對(duì)照品溶液或細(xì)胞培養(yǎng)液樣品孵育，洗板后加入生物素標(biāo)記抗體孵育，洗板后加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，洗板后加底物溶液，避光顯色5～15 min。每孔加入終止溶液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定各孔吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線折算出每孔光密度對(duì)應(yīng)的炎癥因子濃度。

2.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

將RAW264.7細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度的PSI，孵育1 h。除對(duì)照組外，各組加入LPS 刺激30 min 后，收集細(xì)胞。加入RIPA 裂解液，冰浴裂解，在12 000 r·min-1離 心10 min（離心半徑為9.5 cm），上清液為細(xì)胞總蛋白；或按照核蛋白提取試劑盒說明書操作，分離提取細(xì)胞漿蛋白與核蛋白。Bradford 法測(cè)定蛋白濃度，98 ℃變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）凝膠電泳、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜電轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉封閉液室溫孵育1 h，加入相應(yīng)的一抗，4 °C 孵育過夜后，洗滌3 次，二抗孵育1 h，洗滌3 次。條帶于ECL 顯色液中孵育，使用多道化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影并拍照。條帶圖像用ImageJ 1.52r 軟件進(jìn)行灰度分析，并除以內(nèi)參蛋白β-actin或Sp1灰度值，得到待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2.8 免疫熒光檢測(cè)蛋白定位

將RAW264.7 細(xì)胞種于4 孔腔室載玻片中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同質(zhì)量濃度PSI，孵育1 h。除對(duì)照組外，各組加入LPS 刺激30 min后，進(jìn)行固定透膜，2% BSA 溶液封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜。洗滌3 次，用Alexa Fluor488 標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h。使用DAPI 抗猝滅封片劑染色封片之后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett后續(xù)多重比較檢驗(yàn)組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 基于超高效液相色譜法（UPLC）的PSI 中綠原酸與蘆丁的含量測(cè)定

采用UPLC 對(duì)天山雪蓮乙醇提取物、PSI 中的綠原酸和蘆丁含量進(jìn)行測(cè)定[16]。如圖1所示，天山雪蓮乙醇提取物含有綠原酸和蘆丁，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.99%和2.67%。PSI中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23.60%，相較乙醇提取物，綠原酸含量大幅度提升，但未檢測(cè)到蘆丁，說明大孔吸附樹脂可以有效富集天山雪蓮中的酚酸類成分。

圖1 天山雪蓮乙醇提取物、PSI中綠原酸和蘆丁的UPLC圖

3.2 PSI 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

如圖2A所示，PSI質(zhì)量濃度為6.25～400 μg·mL-1時(shí)對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力無顯著影響，故選用12.50、25.00、50.00、100.00 μg·mL-1作為PSI 給藥質(zhì)量濃度。在LPS刺激下，RAW264.7細(xì)胞釋放的NO 水平顯著升高（P<0.01），PSI 質(zhì)量濃度為12.5～100 μg·mL-1時(shí)能顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)基中的NO 含量（P<0.05，P<0.01）。PSI 同時(shí)能劑量依賴性地抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞釋放PGE2（圖2B）。LPS 能促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞細(xì)胞因子（TNF-α、IL-10 和IL-6）和趨化因子（MCP-1、MIP-1α和Rantes）的產(chǎn)生，PSI 能顯著抑制上述細(xì)胞因子和趨化因子生成（圖2C）。結(jié)果表明，PSI 能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的釋放。

3.3 PSI 對(duì)Toll 樣受體4（TLR4）信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

TLR4在包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞表面表達(dá)，能夠識(shí)別LPS，介導(dǎo)其所引起的一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而釋放出大量的炎癥因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[17]。進(jìn)一步采用Western-blot 法檢測(cè)PSI 對(duì)TLR4 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的影響。如圖3 所示，LPS 刺激后，RAW264.7 細(xì) 胞 IκBα、IKKα/β、p65、TBK1、ERK1/2、JNK、p38、及c-Jun的磷酸化水平明顯提高（P<0.05，P<0.01），PSI 質(zhì)量濃度為50、100 μg·mL-1時(shí)能劑量依賴性地降低除JNK 以外上述蛋白的磷酸化表達(dá)水平。此外，在LPS 刺激下，RAW264.7 細(xì)胞IRF3 磷酸化水平與對(duì)照組相比升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PSI 能顯著降低IRF3的磷酸化（P<0.05，P<0.01）。上述結(jié)果說明PSI能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞TLR4信號(hào)通路的激活。

圖3 PSI對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞TLR4信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

3.4 PSI對(duì)p65、IRF3和c-Jun入核的影響

在LPS的刺激下，TLR4信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子p65、IRF3 和c-Jun 能從胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，與DNA 結(jié)合，從而促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[18]，因此，分別采用Western blot 和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p65、IRF3和c-Jun 在RAW264.7 細(xì)胞中核轉(zhuǎn)位情況。如圖4A～4C 示，LPS 刺激后，p65、IRF3 和c-Jun 在細(xì)胞質(zhì)分布減少，核內(nèi)分布增多。而PSI 質(zhì)量濃度為50.00、100.00 μg·mL-1時(shí)能夠劑量依賴性地抑制p65、IRF3和c-Jun 的入核。此外，如圖4D、圖4E 所示，發(fā)現(xiàn)LPS 顯著促進(jìn)p65、IRF3 和c-Jun 在細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)水平（P<0.01），而PSI劑量依賴性地降低其在核內(nèi)的表達(dá)（P<0.05，P<0.01）。PSI 對(duì)p65 和c-Jun 在胞漿中的表達(dá)水平無顯著影響。上述結(jié)果提示PSI能夠抑制LPS 刺激下NF-κB、IRF3 和c-Jun 的入核，從而下調(diào)相關(guān)炎癥因子的釋放。

圖4 PSI對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞p65、IRF3和c-Jun核轉(zhuǎn)位的影響

4 討論

本研究采用大孔樹脂富集天山雪蓮的總酚酸成分，通過UPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PSI富含綠原酸，而不含蘆丁。綠原酸等酚酸類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，被認(rèn)為是第七類營養(yǎng)素[19]，具有抗氧化等多種藥理活性。綠原酸廣泛分布于藥用植物中，近年來多項(xiàng)研究表明，綠原酸具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和改善代謝等作用[20]，是天山雪蓮發(fā)揮抗炎作用的主要有效成分之一。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將測(cè)定PSI 中其他酚酸類成分，并檢測(cè)其抗炎作用及相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步明確其抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)天山雪蓮的酚酸類有效成分作為抗炎藥物提供藥理學(xué)依據(jù)。

巨噬細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫防御細(xì)胞，參與清除機(jī)體內(nèi)微生物病原體和組織碎片，募集中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等其他免疫細(xì)胞進(jìn)入炎性組織，共同協(xié)助恢復(fù)機(jī)體免疫平衡。在病理狀態(tài)下，過度活化的巨噬細(xì)胞能夠放大炎癥反應(yīng)，引起組織損傷[21]，在肺炎、關(guān)節(jié)炎[22]、胰腺炎[23]等炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。在本研究中，筆者采用經(jīng)典的LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型，來探討PSI 的抗炎作用及作用機(jī)制。研究結(jié)果表明PSI能有效的抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的過度釋放，提示PSI 能夠改善LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。因此，結(jié)果表明總酚酸類成分是天山雪蓮發(fā)揮抗炎作用、防治炎性疾病的潛在有效部位之一。

TLR4是免疫應(yīng)答重要的一員，也是各種急慢性疾病的藥物靶點(diǎn)[24-26]。TLR4 含有24 個(gè)重復(fù)的富含亮氨酸序列，以便促進(jìn)蛋白與蛋白的相互結(jié)合，通過此結(jié)構(gòu)來識(shí)別病原體及其產(chǎn)物[27]。激活巨噬細(xì)胞中的TLR4 信號(hào)能夠募集細(xì)胞內(nèi)多種接頭蛋白，從而磷酸化激活下游的IKKα/β復(fù)合物，后者促進(jìn)IκBα磷酸化，引起其泛素化降解，釋放NF-κB/p65，使得游離在胞漿中的NF-κB/p65 磷酸化活化，從而進(jìn)入細(xì)胞核中，與DNA 結(jié)合，促進(jìn)炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，PSI 能顯著抑制IKKα/β、IκBα和p65 的磷酸化，并降低p65 的入核，提示PSI 可能通過TLR4/p65 信號(hào)通路從而抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子的釋放。同時(shí)，TLR4 信號(hào)活化激酶TBK1，使IRF3 磷酸化二聚化并移位到核內(nèi)，啟動(dòng)趨化因子、Ⅰ型干擾素基因的表達(dá)[29]。此外，TLR4信號(hào)還可以激活包括ERK1/2、p38和JNK在內(nèi)MAPKs 蛋白激酶，最終導(dǎo)致激活子蛋白1（AP-1）亞基如c-Fos、c-Jun 等的激活和入核，與DNA 應(yīng)答元件結(jié)合，啟動(dòng)炎癥因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子的合成及釋放[30]。本研究結(jié)果顯示，PSI 能降低LPS 誘導(dǎo)的TBK1、IRF3、MAPKs和c-Jun 的磷酸化活化，并抑制IRF3 和c-Jun 的入核，表明PSI 也能通過TLR4/IRF3 和TLR4/c-Jun 信號(hào)通路抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究在體外水平研究了PSI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞炎癥模型炎癥因子釋放的影響，揭示了PSI 對(duì)TLR4 信號(hào)通路的抑制作用可能是其發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制。本研究為天山雪蓮及其相關(guān)制劑防治炎癥性疾病的臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)，本課題組后續(xù)將在動(dòng)物水平進(jìn)一步驗(yàn)證PSI治療炎性疾病的藥效，并驗(yàn)證其作用機(jī)制。