水蘇糖抗衰老活性及機(jī)制研究△

陳旭，梁佳政a，李志恒，丁克林，高雅婷，柳志誠，劉永剛*，張園園*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.安徽萬花草生物科技有限公司，安徽 亳州 236000

衰老是一種常見的、自發(fā)性的生理過程，機(jī)體代謝率減慢及器官功能下降導(dǎo)致機(jī)體的老化[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，隨著年齡的增長，體內(nèi)會產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）自由基，當(dāng)ROS 含量高于正常值時，會誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而對機(jī)體造成損害，最終導(dǎo)致壽命的縮短[3]。目前研究表明，植物多糖大多數(shù)都具有抗衰老的功效[4]。利用植物多糖研發(fā)抗氧化功能性食品和保健食品具有重要意義。

秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）是一種以多種細(xì)菌為食的無害的真核生物，具有壽命短、易操作、易觀察、與人類基因高度同源的優(yōu)點[5-7]。線蟲老齡化標(biāo)志顯著，如體長明顯縮短、脂褐素濃度升高、運(yùn)動能力（吞咽速率、頭部擺動頻率）減弱和神經(jīng)系統(tǒng)退化等[8]，這些性質(zhì)給實驗提供了大量的可觀測指標(biāo)。因此，線蟲能夠作為一種模式生物，對藥物篩選及藥物抗衰老機(jī)制研究起到很大的作用。

本研究通過線蟲模型探究水蘇糖的抗衰老機(jī)制，以期為其在衰老及其他疾病治療方面的應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 試藥

水蘇糖（合肥千盛生物科技有限公司，批號：221205，純度≥98%）；3%過氧化氫試劑（南京建成生物工程研究所）；1-苯氧基-2-丙醇（上海麥克林生化科技有限公司）；M9 緩沖液、NGM 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、線蟲裂解液按照常規(guī)方法配制[16]。

1.2 菌株及線蟲

菌株和線蟲均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所惠贈；缺陷型大腸埃希菌Escherichia coliOP50；野生型線蟲株N2；線蟲株TJ356，基因型：zls356 [daf-16p::daf-16a/b::GFP+rol-6 (su1006)]，綠色熒光蛋白（GFP）融合衰變加速因子-16（DAF-16）蛋白；線蟲株CF1553，基因型：muls84 [(pAD76)sod-3p::GFP+rol-6 (su1006)]，GFP 融合超氧化物歧化酶-3（SOD-3）蛋白；線蟲株VC475，基因型：hsp-16.2 (gk249) V，hsp-16.2缺陷型。

1.3 儀器

Revco PLUS 型-80 ℃低溫冰箱（美國Thermo公司）；SW-CJ-2FD標(biāo)準(zhǔn)型雙人單面凈化工作臺（蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司）；SPX-250 型生化培養(yǎng)箱（北京科偉永興儀器有限公司）；SMZ745 型體式顯微鏡、D-LH/LC 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 線蟲培養(yǎng)及同期化

線蟲在已接種E.coliOP50 300 μL 的培養(yǎng)板中，于22 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。為防止線蟲生長時間過長，導(dǎo)致數(shù)量過多或者進(jìn)入饑餓狀態(tài)甚至dauer 時期，2～4 d 需要進(jìn)行轉(zhuǎn)板。同時為了避免細(xì)菌、螨蟲等污染，要定期對線蟲環(huán)境進(jìn)行消毒。

為了確保實驗期間所有線蟲都在相同的生長時期，采用次氯酸鈉漂白法對線蟲進(jìn)行同期化處理。用移液槍吸取M9 緩沖溶液1 mL 將成蟲轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，待線蟲靜置沉降后，吸取上清液后再加入裂解液1 mL 對線蟲進(jìn)行裂解，振蕩8～10 min 后，用低速離心機(jī)離心1.5 min（3000 r·min-1，離心半徑為1 cm），吸取上清液。然后用M9緩沖液沖洗2～3 遍，離心棄去上清液后，用移液槍將離心管底部線蟲吸出，滴在NGM無菌區(qū)內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h左右，使線蟲生長至L4期，用作后續(xù)給藥處理。

2.2 水蘇糖抗衰老活性研究

2.2.1 體長測定 實驗分為4 組，分別為對照組和水蘇糖低、中、高劑量組（100、150、200 μmol·L-1）。將同期化后生長至L4期的N2線蟲分別轉(zhuǎn)移至對照組和水蘇糖組培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中生長1 d后，將線蟲用M9 緩沖液沖洗轉(zhuǎn)移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后，在倒置顯微鏡下觀察載玻片，用倒置顯微鏡自帶的軟件對線蟲的體長進(jìn)行測量。每組不少于30條。

Seminar教學(xué)的核心環(huán)節(jié)就是匯報工作，宣講自己對于課題的研究成果、某種學(xué)術(shù)觀點的認(rèn)識見解，然后師生在此基礎(chǔ)上展開討論，這都需要研究生具有較強(qiáng)的綜合表達(dá)能力。Seminar教學(xué)過程需要學(xué)生邏輯清晰地闡明學(xué)術(shù)觀點，簡明扼要、重點突出地回答師生提問，并能夠圍繞一個主題進(jìn)行有理有據(jù)的辯論，科學(xué)理性地說服他人。通過上述過程，研究生可以在邏輯思維、口頭交流、PPT展示、著裝儀表等綜合能力方面得到明顯提高，有助于其完成研究生階段的中期開題和畢業(yè)答辯。

2.2.2 頭部擺動能力測定 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養(yǎng)箱中生長48 h 后，將線蟲放入空NGM板上。線蟲頭尾來回擺動至初始位置則為1 次。用體視顯微鏡觀察并記錄20 s 內(nèi)每只線蟲的頭部擺動次數(shù)。每組線蟲不少于30條。

2.2.3 脂褐素含量測定 線蟲分組及處理同2.2.1項下，N2 線蟲在培養(yǎng)箱中生長5 d 后，將線蟲轉(zhuǎn)移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5% 1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，采用380 nm 激發(fā)波長、420 nm 發(fā)射波長，拍下不同組別的熒光照片。每組不少于60 條線蟲。

2.2.4 吞咽次數(shù)測定 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養(yǎng)箱中生長5 d 后，使用顯微鏡觀察每條線蟲咽部的活動，記錄其末端球狀物在20 s內(nèi)的吞咽次數(shù)。每組至少統(tǒng)計30條線蟲。

2.2.5 氧化應(yīng)激實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養(yǎng)箱中生長3 d 后，將其轉(zhuǎn)移到含有0.4% H2O2的培養(yǎng)皿中，并使用體式顯微鏡觀察，記錄每小時線蟲的死亡情況，直到線蟲完全死亡。每組實驗最少統(tǒng)計30條線蟲。

2.2.6 熱應(yīng)激實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，N2 線蟲在培養(yǎng)箱中生長3 d 后，轉(zhuǎn)移至空NGM板上，置于37 ℃條件下，用顯微鏡觀察并記錄每小時線蟲死亡數(shù)量，直至線蟲全部死亡。每組不少于30條線蟲。

2.3 水蘇糖抗衰老作用機(jī)制研究

2.3.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉(zhuǎn)位實驗 線蟲分組及處理同2.2.1 項下，TJ356 線蟲給藥3 d 后，線蟲發(fā)育到成蟲階段，每組線蟲用麻醉劑（0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液）處理，待線蟲麻醉后，通過倒置熒光顯微鏡統(tǒng)計各組線蟲總數(shù)及處于細(xì)胞質(zhì)、中間、細(xì)胞核狀態(tài)線蟲的占比。其中當(dāng)線蟲體內(nèi)無如圖1 所示的綠色熒光斑點狀的細(xì)胞核時可以判定其為細(xì)胞質(zhì)狀態(tài)；當(dāng)線蟲體內(nèi)只有細(xì)胞核而無如圖1 所示的細(xì)胞質(zhì)時可以判定為其為細(xì)胞核狀態(tài)；當(dāng)線蟲體內(nèi)既有細(xì)胞核又有細(xì)胞質(zhì)時可以判定其為中間狀態(tài)。每組不少于60條。

圖1 線蟲細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核圈定示意圖

2.3.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達(dá)實驗 CF1553線蟲是一種GFP 標(biāo)記SOD-3 蛋白的線蟲，用熒光顯微鏡下觀察其綠色熒光強(qiáng)度，可以直觀反映出SOD-3 蛋白的表達(dá)情況[16]。線蟲分組及處理同2.2.1項下，卵期的CF1553 線蟲給藥處理3 d 后，將成年線蟲轉(zhuǎn)移至載玻片上，每組線蟲用麻醉劑（0.5%1-苯氧基-2-丙醇溶液）20 μL 處理，待線蟲麻醉后置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍攝圖片測定熒光強(qiáng)度。每組至少統(tǒng)計30條線蟲。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25 軟件和單因素方差分析對結(jié)果進(jìn)行定量分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 6.02軟件分析生存曲線的可靠度。

3 結(jié)果與分析

3.1 水蘇糖抗衰老活性研究

3.1.1 體長測定 線蟲體長代表性圖見圖2。給藥1 d 后，對照組線蟲體長為（461.74±38.35）μm。與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1組均可使線蟲的體長增加，分別為（476.73±28.82）、（473.97±22.51）、（480.09±25.38）μm，其中高濃度組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗結(jié)果表明，水蘇糖對線蟲的體長有一定的促進(jìn)作用。

圖2 測量線蟲體長代表性圖（×40）

3.1.2 頭部擺動能力測定 對照組線蟲20 s頭部擺動次數(shù)為26.1±5.6。與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1處理可增加線蟲頭部擺動次數(shù)，分別為31.3±3.4、31.9±3.3、30.3±2.2，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

3.1.3 線蟲脂褐素含量的測定 線蟲隨著衰老會出現(xiàn)體內(nèi)藍(lán)色熒光增加的現(xiàn)象。與對照組比較，水蘇糖處理后線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖3、圖4）。

圖3 水蘇糖各濃度組線蟲體內(nèi)脂褐素?zé)晒鈭D（×40）

圖4 水蘇糖對線蟲脂褐素的影響（,n=60）

3.1.4 吞咽次數(shù)測定 結(jié)果表明，對照組線蟲20 s內(nèi)吞咽次數(shù)為46.6±6.4。與對照組比較，水蘇糖100 μmol·L-1組線蟲20 s 內(nèi)抽咽次數(shù)有所增加，為46.8±5.8，水蘇糖150、200 μmol·L-1組線蟲20 s內(nèi)吞咽次數(shù)有所減少，分別為44.9±5.1、44.1±5.6，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

3.1.5 氧化應(yīng)激實驗 線蟲生存曲線如圖5 所示，與對照組比較，在氧化應(yīng)激條件下，水蘇糖各濃度組線蟲生存率升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 氧化應(yīng)激下水蘇糖對線蟲壽命的影響

3.1.6 熱應(yīng)激實驗 如圖6 所示，與對照組比較，水蘇糖100、150、200 μmol·L-1組處理后線蟲生存曲線均明顯右移，100、150 μmol·L-1組線蟲存活時間延長40%，200 μmol·L-1濃度組存活時間延長50%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。

圖6 熱應(yīng)激條件下水蘇糖對線蟲壽命的影響

3.2 水蘇糖抗衰老作用機(jī)制研究

3.2.1 TJ356 線蟲DAF-16 蛋白核轉(zhuǎn)位實驗 在對照組中觀察到的熒光點較少，DAF-16::GFP 的熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為（61.20±0.04）%，中間定位的占比為（38.25±0.01）%，細(xì)胞核定位的占比為（0.55±0.01）%。用不同濃度水蘇糖處理后觀察到的熒光點明顯增多，其中在100 μmol·L-1組中，DAF-16::GFP 的熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為（14.49±0.05）%，中間定位占比為（71.74±0.11）%，細(xì)胞核定位占比為（13.77±0.02）%；150 μmol·L-1組中DAF-16::GFP 熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為（2.03±0）%，中間定位占比為（82.43±0.12）%，細(xì)胞核定位占比為（15.54±0.03）%；200 μmol·L-1組中DAF-16::GFP 熒光細(xì)胞質(zhì)定位占比為（3.15±0）%，中間定位占比為（66.93±0.07）%，細(xì)胞核定位占比為（29.92±0.10）%。水蘇糖可明顯促進(jìn)線蟲DAF-16從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移。

3.2.2 CF1553 線蟲SOD-3 蛋白表達(dá) 各組CF1553線蟲體內(nèi)GFP 熒光圖見圖7。對照組相對熒光強(qiáng)度為1.00±0.29，與對照組比較，給藥3 d后，水蘇糖能夠顯著提高線蟲的相對熒光強(qiáng)度，分別為1.27±0.41、1.28±0.45和1.26±0.39，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明水蘇糖可以有效地激活DAF-16 的核轉(zhuǎn)錄，使SOD-3蛋白的活性顯著提升。

圖7 水蘇糖各濃度組CF1553線蟲體內(nèi)GFP熒光圖（×40）

4 討論

本研究探究了水蘇糖抗衰老的活性作用和分子機(jī)制。隨著年齡的增長、線蟲衰老程度的加深，其肌肉功能不斷減退，對外界刺激越來越不敏感，因此通過測定線蟲頭部擺動頻率和應(yīng)激能力可以在一定程度上了解線蟲的衰老進(jìn)程。脂褐素常作為衰老的檢驗指標(biāo)之一[17]。本研究對以上指標(biāo)進(jìn)行測定，實驗結(jié)果表明，水蘇糖能夠顯著增加線蟲頭部擺動頻率，提高線蟲熱應(yīng)激能力并且降低線蟲體內(nèi)脂褐素的含量。以上結(jié)果證明了水蘇糖能夠改善線蟲身體狀況，延緩線蟲的衰老進(jìn)程，進(jìn)而對其機(jī)制進(jìn)行了探究。

線蟲的吞咽速率與線蟲的健康狀況有關(guān)，也與線蟲的衰老程度有關(guān)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥4 d后與對照組相比，水蘇糖組線蟲吞咽速率無明顯變化。說明水蘇糖不影響線蟲對食物的攝取能力，因此水蘇糖的抗衰老機(jī)制并不依賴于熱量限制[18-19]。

胰島素/胰島素樣生長因子1 信號通路（IIS）信號通路參與調(diào)節(jié)線蟲機(jī)體的抗應(yīng)激能力、衰老等一系列生理過程。當(dāng)IIS 的上游活性因子受到抑制時，DAF-16轉(zhuǎn)錄因子就會被激活，從而引起核轉(zhuǎn)位，這將有助于提高機(jī)體的抗逆性，從而延長線蟲的壽命[20]，同時也可以誘導(dǎo)下游的抗逆因子，如SOD-3，從而達(dá)到更好的效果。因此對DAF-16 核轉(zhuǎn)位和SOD-3 結(jié)合GFP 熒光強(qiáng)度進(jìn)行了測定，以探究水蘇糖的抗衰老能力與其中的IIS信號傳導(dǎo)途徑之間的關(guān)系。實驗結(jié)果表明，水蘇糖能夠激活DAF-16轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)TJ356 株線蟲的核轉(zhuǎn)位，并且可以顯著提高CF1553 線蟲熒光強(qiáng)度，增加SOD-3 蛋白表達(dá)量。

綜上所述，水蘇糖顯示出較強(qiáng)的抗衰老活性，可能是通過IIS 通道刺激DAF-16 轉(zhuǎn)錄因子，引起細(xì)胞核轉(zhuǎn)位，提高SOD-3 蛋白質(zhì)表達(dá)水平，進(jìn)而提升細(xì)胞對外界環(huán)境因素的抵御，從而實現(xiàn)延長線蟲壽命的作用。本研究對水蘇糖抗衰老的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，為下一步研究DAF-16上游作用靶點提供了一定的理論基礎(chǔ)，同時也為含有水蘇糖的中藥，如黃精、地黃等抗衰老作用機(jī)制研究提供參考。