基于正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯水提液對(duì)高糖培養(yǎng)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性影響

曹俊昌，石 穎，胡艷紅，胡 俊，陳 勝

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

隨著城市化、人口老齡化以及生活方式的改變，全球糖尿病發(fā)病率逐年快速增長(zhǎng)。根據(jù)2021 年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，目前全球20～79 歲人群中有糖尿病患者5.37 億，預(yù)計(jì)2045 年將增長(zhǎng)至7.83 億［1］。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的眼部并發(fā)癥，是導(dǎo)致工作年齡人群失明的主要原因，其發(fā)病率及致盲率也逐年增長(zhǎng)。一項(xiàng)綜合了1980 年—2008 年全球35 項(xiàng)DR 患病相關(guān)研究的薈萃分析表明，全球范圍內(nèi)糖尿病患者中DR 的患病率達(dá)34.6%［2］；另一項(xiàng)納入全球59 項(xiàng)研究的薈萃分析結(jié)果表明，2020 年全世界成年DR患者人數(shù)估計(jì)為1.031 億；2045 年，這一數(shù)字預(yù)計(jì)將增加至1.605 億［3］。在我國(guó)糖尿病患者中DR 的患病率為22.4%，也已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯在治療DR上有較好的臨床增效作用，可改善患者視力和中醫(yī)證候等［5］，但其潛在的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。近年來(lái)，高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究逐漸成為探討DR 機(jī)制的主要研究模型［6-8］，在不同研究中，高糖造模的濃度存在差異，在高糖誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞可表現(xiàn)為細(xì)胞損傷和增殖活性降低。因此，本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞活性為主要指標(biāo)，篩選高糖損傷模型的最佳葡萄糖干預(yù)濃度、補(bǔ)陽(yáng)還五湯水提液保護(hù)高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最佳濃度及最佳作用時(shí)間，以期為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRCECs）購(gòu)自深圳豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)陽(yáng)還五湯由黃芪125 g，當(dāng)歸6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，焯山桃仁3 g，紅花3 g組成，均購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院中藥房。采用水提醇沉法制備補(bǔ)陽(yáng)還五湯水提液（BYHWT）：稱取4 倍量的各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮2 次。第1 次15 倍量水，煎煮1.5 h；第2 次加10 倍量水，煎煮1 h，分別用濾布濾過(guò)，合并濾液，補(bǔ)水，得質(zhì)量濃度為0.1 g/mL 的補(bǔ)陽(yáng)還五湯水提液，快速攪拌并緩慢加入乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，冷藏，靜置14 h，濾過(guò)，揮發(fā)至無(wú)醇味后，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：D5796）、DMEM/F-12 培養(yǎng)基（批號(hào)：D6570）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清（FBS，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：F8318）；PBS 溶液（美國(guó)Hyclone 公司，批號(hào)：ABA212278）；0.25%胰蛋白酶（美國(guó)Gbico 公司，批號(hào)：25200-056）；5%葡萄糖注射液（中國(guó)湖南科倫制藥有限公司，批號(hào)：H43022082）；CCK8 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（全式金生物公司，批號(hào)：FP101-02）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀（中國(guó)北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：DNM-9602）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司，型號(hào)：VMCMMCO-5ACMMO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%FBS 和1%雙抗的高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為4.5 mg/mL），于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次。加適量0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將細(xì)胞以每孔1×104個(gè)接種于96 孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至50%左右，分別加入含4.5、5、10、15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度的培養(yǎng)基和含0、5、10、15.625、31.25、62.5、125、250 mg/mL BYHWT 濃度的高糖培養(yǎng)基各200 μL，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)后，每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定OD 值。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選HRCECs 細(xì)胞培養(yǎng)條件 以葡萄糖濃度（A）、BYHWT 濃度（B）及孵育時(shí)間（C）為3 個(gè)實(shí)驗(yàn)影響因素，每個(gè)因素設(shè)定3 個(gè)水平，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下結(jié)果，選擇相應(yīng)的葡萄糖濃度和BYHWT濃度，按照L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出BYHWT防護(hù)高糖損傷HRCECs 的最佳濃度及最佳作用時(shí)間。以HRCECs 細(xì)胞OD 值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，OD 值高者為佳。

將細(xì)胞以每孔5×104個(gè)接種于3 個(gè)24 孔培養(yǎng)板，3 個(gè)培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)3 個(gè)孵育時(shí)間（24、48、72 h），待細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至50%左右時(shí)，按正交實(shí)驗(yàn)表加新配制相應(yīng)濃度的GS、BYHWT 培養(yǎng)液。37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換相同條件培養(yǎng)液1 次。培養(yǎng)至預(yù)定時(shí)間，每孔加入10 μL 的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的OD 值。

2.4 BYHWT 干預(yù)時(shí)間篩選 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的葡萄糖濃度和BYHWT 濃度，將HRCECs 細(xì)胞分為正常組、模型組（優(yōu)選葡萄糖濃度）與干預(yù)組（優(yōu)選葡萄糖濃度+優(yōu)選BYHWT 濃度），培養(yǎng)24、48、72 h，每日換液1 次，CCK8 法測(cè)定3 組細(xì)胞不同干預(yù)時(shí)間的OD 值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同葡萄糖濃度干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較 與4.5 mg/mL 組比較，隨著葡萄糖濃度增高，HRCECs 細(xì)胞OD 值在不同時(shí)間均大致為先升高后降低趨勢(shì)。干預(yù)24 h 時(shí)，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細(xì)胞OD 值明顯降低；干預(yù)48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時(shí)，OD 值開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中25 mg/mL葡萄糖濃度干預(yù)后OD 值均明顯降低（P＜0.05），提示該濃度可引起細(xì)胞損傷。見表1。

表1 不同糖濃度干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較（±s）

表1 不同糖濃度干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較（±s）

注：與4.5 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.511±0.093 1.765±0.0901）1.775±0.1001）1.754±0.0701）1.715±0.2031）0.848±0.1011）葡萄糖濃度/（mg/mL）4.5 5 10 15 20 25 24 h 0.805±0.059 0.772±0.109 0.810±0.051 0.852±0.075 0.613±0.1141）0.346±0.0501）48 h 0.728±0.053 0.987±0.1771）0.873±0.092 0.975±0.1231）0.613±0.086 0.500±0.0431）

3.2 不同BYHWT 濃度干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較 與0 mg/mL組比較，5 mg/mL BYHWT干預(yù)24 h，10、15.625 mg/mL BYHWT干預(yù)48、72 h后OD值均明顯提高（P＜0.05），提示該濃度可促進(jìn)增殖。見表2。

表2 不同BYHWT濃度干預(yù)HRCECs細(xì)胞OD值比較（±s）

注：與0 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.700±0.121 1.798±0.0601）1.912±0.4191）1.976±0.1531）1.700±0.142 0.848±0.1121）0.763±0.0811）0.660±0.0041）BYHWT濃度/（mg/mL）05 10 15.625 31.25 62.5 125 250 24 h 0.850±0.024 1.178±0.0481）0.875±0.106 0.901±0.073 0.881±0.007 0.867±0.018 0.841±0.042 0.708±0.0051）48 h 1.035±0.055 1.406±0.1021）1.339±0.1431）1.281±0.1261）1.149±0.040 0.826±0.0661）0.712±0.0201）0.656±0.0021）

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表1 可知，當(dāng)葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時(shí)，葡萄糖培養(yǎng)促進(jìn)HRCECs 細(xì)胞增殖的作用開始減弱，因此，選擇篩選15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度作為正交實(shí)驗(yàn)條件。由表2 可知，當(dāng)BYHWT 濃度在5～15.625 mg/mL 時(shí)，HRCECs 細(xì)胞OD值增強(qiáng)，提示該濃度對(duì)HRCECs 細(xì)胞具有保護(hù)作用。正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表3，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表4，方差結(jié)果分析見表5。由表4 極差（R）可知，影響細(xì)胞增殖活性的主次因素是C＞A＞B，即孵育時(shí)間＞葡萄糖濃度＞BYHWT 濃度。經(jīng)方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞增殖活性有顯著性影響，而葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對(duì)細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響。因此，選擇25 mg/mL葡萄糖濃度建立高糖損傷模型，選擇5 mg/mL BYHWT 濃度干預(yù)細(xì)胞，觀察細(xì)胞增殖活性，篩選干預(yù)時(shí)間。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表5 方差結(jié)果分析

3.4 3組不同時(shí)間干預(yù)HRCECs細(xì)胞OD值比較 與正常組比較，模型組干預(yù)24、48、72 h 后OD 值明顯降低（P＜0.05）；干預(yù)組干預(yù)24、48 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05），干預(yù)72 h 后明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組干預(yù)24、48、72 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05）。見表6。

表6 3 組不同時(shí)間干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較（±s）

表6 3 組不同時(shí)間干預(yù)HRCECs 細(xì)胞OD 值比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組干預(yù)組72 h 1.621±0.110 0.848±0.1011）1.320±0.1241）2）24 h 0.860±0.053 0.346±0.0501）0.991±0.1031）2）48 h 0.890±0.099 0.500±0.0431）1.007±0.0782）

4 討 論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，現(xiàn)臨床上被應(yīng)用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病下肢血管病變、糖尿病心血管病變等糖尿病并發(fā)癥［8-9］。視網(wǎng)膜微血管是糖尿病視網(wǎng)膜病變主要的病變部位，在高血糖情況下微血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)慢性炎癥及滲透性損傷［10］。大多數(shù)HRCECs細(xì)胞高糖損傷的模型研究，正常培養(yǎng)HRCECs 細(xì)胞的培養(yǎng)基葡萄糖濃度為1.0～5.5 mg/mL［11-12］，而本研究HRCECs細(xì)胞正常的培養(yǎng)條件要求4.5 mg/mL葡萄糖濃度的培養(yǎng)基，因此為了進(jìn)一步觀察高糖對(duì)該細(xì)胞的損傷作用，本研究探討了5、10、15、20、25 mg/mL葡萄糖濃度對(duì)HRCECs 細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRCECs 細(xì)胞OD 值在不同時(shí)間均大致為先升高后降低趨勢(shì)。干預(yù)24 h 時(shí)，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細(xì)胞OD 值明顯降低；干預(yù)48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時(shí)，OD 值開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)葡萄糖濃度為20 mg/mL 以上時(shí)，培養(yǎng)液對(duì)HRCECs細(xì)胞表現(xiàn)出損傷作用。其中25 mg/mL GS 培養(yǎng)液條件下孵育的HRCECs 細(xì)胞24～72 h OD 值均低于正常組，說(shuō)明增大葡萄糖濃度可以成功制備高糖損傷HRCECs 模型。

在常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，建立細(xì)胞模型多采用不同梯度濃度的藥物干預(yù)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞增殖活性篩選出造模濃度；治療藥物的濃度篩選，也多采用不同梯度濃度干預(yù)細(xì)胞進(jìn)而獲得最佳的藥物干預(yù)濃度，造模濃度和藥物干預(yù)濃度在組合條件下可能出現(xiàn)不同的規(guī)律［13-14］。本文篩選葡萄糖濃度時(shí)提示葡萄糖濃度＞25 mg/mL 干預(yù)48 h 出現(xiàn)細(xì)胞損傷，而篩選BYHWT濃度時(shí)提示BYHWT濃度≤15.625 mg/mL便可以減少細(xì)胞損傷，且隨著濃度降低，損傷減少。理論上用保護(hù)作用最強(qiáng)濃度的藥物干預(yù)損傷最重的細(xì)胞，與保護(hù)作用最弱的藥物干預(yù)損傷最輕的細(xì)胞，此兩者效果應(yīng)該一致，但通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：25 mg/mL 葡萄糖聯(lián)合5 mg/mL BYHWT 的OD 值為0.653 3，而15 mg/mL 葡萄糖聯(lián)合15.625 mg/mL BYHWT 的OD 值為1.1025，有明顯的差異。因此，篩選最佳的損傷模型和保護(hù)性藥物的最佳干預(yù)濃度以及干預(yù)時(shí)間，需要采用正交設(shè)計(jì)分析進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)。

為了明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯水提液對(duì)高糖誘導(dǎo)HRCECs的保護(hù)作用，通過(guò)正交設(shè)計(jì)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：在25 mg/mL 葡萄糖濃度下孵育24 h，即可導(dǎo)致HRCECs 細(xì)胞損傷，而5 mg/mL BYHWT 可保持HRCECs活性。25 mg/mL葡萄糖濃度培養(yǎng)的HRCECs細(xì)胞可以作為高糖損傷模型，5 mg/mL BYHWT 干預(yù)24 h 可用于探討B(tài)YHWT 對(duì)高糖誘導(dǎo)HRCECs 細(xì)胞的保護(hù)作用。這為進(jìn)一步探討B(tài)YHWT 對(duì)高糖誘導(dǎo)HRCECs 細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制研究提供了前期參考依據(jù)。