八寶丹聯(lián)合順鉑抑制胃癌耐藥細胞生長和轉(zhuǎn)移的機制研究

蘭煒蘭，林久茂，趙錦燕*

（1.福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，福建 南平 353000；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；4.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 350122）

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，雖然臨床治療胃癌水平不斷提高，但其5 年生存率仍然很低，主要原因是胃癌的轉(zhuǎn)移和化療藥物產(chǎn)生耐藥［1-2］。因此尋找新的治療策略抑制胃癌轉(zhuǎn)移和逆轉(zhuǎn)耐藥性是臨床面臨的挑戰(zhàn)。胃癌轉(zhuǎn)移和耐藥是逃避凋亡的過程，而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的異質(zhì)性和可塑性在胃癌轉(zhuǎn)移和耐藥過程中起關(guān)鍵作用［3］，是胃癌細胞獲得轉(zhuǎn)移特征的潛在機制。EMT 通過降解胃癌細胞間的黏附結(jié)構(gòu)，從而增強胃癌細胞的侵襲性，并引導胃癌細胞對化療產(chǎn)生耐藥，最終導致治療失?。?-5］。此外，患者產(chǎn)生耐藥后通過改變細胞形態(tài)促進胃癌耐藥細胞發(fā)生EMT，使其更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移和耐藥是相互影響、相互促進的關(guān)系［6-8］。因此，深入探究胃癌細胞耐藥與其在EMT 中轉(zhuǎn)移的潛在機制，將為腫瘤耐藥臨床研究提供新的依據(jù)。

八寶丹（BBD）具有明顯的抗腫瘤的作用，臨床上長期用于各種消化道腫瘤的輔助治療［9-10］。前期研究表明：八寶丹促進胃癌耐藥細胞的凋亡和自噬，逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥［11］，抑制胃癌耐藥細胞生長及轉(zhuǎn)移［12］，但其聯(lián)合化療藥物的作用及機制卻不明確。順鉑（cisplatin，DDP）作為常用的一線抗腫瘤藥物，其療效已得到廣泛檢驗，是胃癌最有效的化療藥物之一，尤其是對胃癌晚期患者［13-14］，但后期容易出現(xiàn)耐藥。因此，本研究初步觀察八寶丹聯(lián)合順鉑對胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP 生長及遷移、侵襲的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP 購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗藥物 BBD 購自廈門中藥廠股份有限公司（0.3 g/粒，批號：180901），取0.3 g BBD 研磨成粉末，加入12 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），超聲助溶，配置成25 mg/mL BBD 母液，滅菌搖勻后，冷藏4 ℃?zhèn)溆?。順鉑（DDP，MKG2946）購于美國Sigma 公司。取約1 mg DDP 粉末，加入1 mL PBS 溶液溶解搖勻后，制成1 mg/mL DDP 母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 實驗試劑 0.25% 胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Gibco 公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉（美國Sigma 公司）；PBS（美國Hyclone公司）；遷移侵襲板（美國Biocoat 公司）；RIPA 裂解液（上海碧云天生物有限公司）；GAPDH、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9、MMP-2抗體、二抗兔抗和鼠抗均購自美國CST 公司。

1.4 實驗儀器 超純水凈化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；-80 ℃超低溫冰箱、低速離心機均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；微孔板酶標儀（德國Tecan 公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；制冰機（日本Sanyo 公司）；干式恒溫金屬浴（上海培清科技有限公司）；小型垂直電泳槽、Trans-blot 小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀、超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用含有雙抗（各100 μg/mL 青霉素和鏈霉素）和10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)SGC7901/DDP 細胞，為了確保SGC7901/DDP 細胞的耐藥性，在培養(yǎng)液中加入1 μg/mL DDP溶液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待SGC7901/DDP 細胞密度長至約65%～75%時，胰酶消化，離心、棄上清液，重懸，按1∶3 接種傳代，在后續(xù)干預(yù)實驗時均不加入1 μg/mL DDP 溶液。

2.2 DDP 和BBD 干預(yù)濃度篩選 將對數(shù)生長期SGC7901/DDP 細胞消化后接種于96 孔板中，分別加入0、1、2、4、6、8、10、16、32 μg/mL DDP 溶液和0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL BBD 溶液干預(yù)48 h，棄上清加入100 μL MTT 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄液體加入100 μL DMSO 溶液，避光放置10 min，振勻，在酶標儀570 nm 波長處檢測OD 值，通過公式計算細胞活力。

結(jié)果顯示：2 μg/mL DDP 和0.25 mg/mL BBD開始對SGC7901/DDP 細胞具有抑制作用，隨著濃度的增大其抑制作用也增強。結(jié)合臨床用藥都是從小劑量開始和容易產(chǎn)生藥物耐受，選擇開始起作用的濃度作為聯(lián)合用藥的劑量，見圖1。

圖1 不同濃度DDP 和BBD 對SGC7901/DDP 細胞活力的影響

2.3 細胞分組與干預(yù) 將SGC7901/DDP 細胞分為對照組、DDP 組、BBD 組和聯(lián)合組，對照組加入常規(guī)培養(yǎng)基，DDP 組加入2 μg/mL DDP 溶液，BBD 組加入0.25 mg/mL BBD 溶液，聯(lián)合組加入0.25 mg/mL BBD 溶液和2 μg/mL DDP 溶液，均干預(yù)48 h。

2.4 細胞活力檢測 將對數(shù)生長期的SGC7901/DDP 細胞消化后接種于96 孔板中，按“2.3”項下方法干預(yù)48 h，按“2.2”項下MTT法檢測4組細胞活力。

2.5 Transwell 遷移和侵襲實驗 將SGC7901/DDP細胞按4.0×105個/孔均勻接種于6 孔板中培養(yǎng)，按“2.3”項下方法干預(yù)48 h，收集活細胞，用不含F(xiàn)BS培養(yǎng)基將細胞稀釋至濃度為2.5×105個/mL 的細胞液，取200 μL 細胞液分別接種于侵襲板或遷移板小室的上層，同時取0.75 mL 含10% FBS 培養(yǎng)基放入下室，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察下室有無細胞遷入，若有，取出小室，用4%多聚甲醛固定上下室12 min，再用結(jié)晶紫染色10 min，用PBS 溶液輕輕清除小室里側(cè)（上室）細胞，待晾干后，倒置顯微鏡觀察并拍照，通過統(tǒng)計5 個視野中遷移板和侵襲板下層的細胞數(shù)目來評價SGC7901/DDP 細胞迀移和侵襲能力。

2.6 黏附實驗 按“2.3”項下方法干預(yù)48 h，經(jīng)消化后調(diào)整細胞濃度，按4.0×105個/孔再次接種于6 孔板孵育6 h，棄上清，PBS 溶液輕輕洗2 遍，甲醛固定，采用0.1%結(jié)晶紫染色13 min，顯微鏡下觀察并隨機拍照，每組隨機取3 張照片統(tǒng)計細胞數(shù)目，取均值，作為每組細胞黏附數(shù)。

2.7 Western blot 檢測遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達量 按“2.3”項下方法干預(yù)48 h，棄上清，用RIPA 液裂解細胞，BCA 法測定蛋白濃度。經(jīng)加熱變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉30 min，PBS 溶液清洗后置于E-cadherin（1∶500）、N-cadherin（1∶500）、Vimentin（1∶500）、MMP-9（1∶500）、MMP-2（1∶500）一抗中4 ℃搖床過夜，PBS 溶液清洗，置于二抗溶液（1∶500）中孵育1 h。PBS 溶液漂洗后加顯色液避光反應(yīng)45 s，ECL 發(fā)光液顯影，用Bio-Rad 系統(tǒng)成像并保存記錄，用ImageJ 軟件檢測條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 28.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組細胞活力比較 見圖2。

圖2 4 組細胞活力比較

3.2 4 組遷移和侵襲情況比較 給藥組干預(yù)48 h后，遷移、侵襲細胞數(shù)較對照組明顯減少（P＜0.05）；聯(lián)合組遷移、侵襲的細胞數(shù)較BBD 組和DDP 組明顯減少（P＜0.05）。見圖3、圖4。

圖3 4 組細胞遷移和侵襲圖（×200）

圖4 4 組細胞遷移和侵襲數(shù)目比較

3.3 4 組細胞黏附力比較 給藥組黏附細胞數(shù)較對照組明顯減少（P＜0.05）；聯(lián)合組黏附細胞數(shù)較BBD組和DDP組明顯減少（P＜0.05）。見圖5。

圖5 4 組細胞黏附力情況比較（×200）

3.4 4 組遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達量比較 與對照組比較，DDP 組和BBD 組N-cadherin、Vimentin、MMP-9 蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）；BBD組MMP-2蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。與DDP 組和BBD組比較，聯(lián)合組N-cadherin、Vimentin、MMP-9、MMP-2蛋白表達量均明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達量明顯升高（P＜0.05）。見表1、圖6。

表1 4 組遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

表1 4 組遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與DDP 組比較，2） P＜0.05；與BBD 組比較，3） P＜0.05。

MMP-2 1.00±0.05 1.00±0.05 0.90±0.041）0.73±0.052）3）組別對照組DDP組BBD組聯(lián)合組N-cadherin 1.00±0.05 0.88±0.051）0.81±0.041）0.46±0.042）3）E-cadherin 1.00±0.05 1.28±0.051）1.38±0.051）1.51±0.062）3）Vimentin 1.00±0.04 0.87±0.041）0.85±0.051）0.53±0.042）3）MMP-9 1.00±0.05 0.90±0.051）0.89±0.041）0.66±0.032）3）

圖6 4 組遷移和侵襲相關(guān)蛋白條帶圖

4 討 論

胃癌根據(jù)臨床癥狀歸屬于中醫(yī)學“噎嗝”“反胃”“胃脘痛”“癥瘕”“積聚”等范疇，其病因主要與六淫邪毒、飲食不潔、生活起居不規(guī)律、情志失調(diào)有關(guān)，正氣虛弱，脾胃損傷也可導致機體的陰陽失調(diào)，運化失常，臟腑、氣血、經(jīng)絡(luò)功能的障礙，從而引起濕毒、氣滯、痰凝、血瘀交阻于胃，聚集成塊，形成胃癌［11］。因此，胃癌的中醫(yī)治則主要為清熱祛濕、健脾行氣、活血化瘀。八寶丹主產(chǎn)于福建，主要由羚羊角、珍珠、牛黃、麝香、蛇膽、三七等中藥組成，具有清濕熱、利肝膽、散瘀滯之效。

研究發(fā)現(xiàn)：發(fā)生EMT 的胃癌細胞更容易誘導胃癌細胞發(fā)生化療耐藥，而胃癌細胞可通過誘導EMT 來增強胃癌細胞的遷移和侵襲力，使胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生更強的耐藥性［15-17］。E-cadherin 是維持上皮完整性黏附連接的一個重要組分，N-cadherin 介導細胞間的黏附，是腫瘤遷移侵襲的一個重要因子。E-cadherin 和N-cadherin 的異常表達會導致腫瘤細胞的侵襲和遷移增加，并導致化療耐藥和治療失?。?8-20］。Vimentin 負責細胞骨架的完整性，其對細胞的靈活性很重要。在間充質(zhì)細胞研究中發(fā)現(xiàn)：抑制E-cadherin 和增強Vimentin 的表達會增加細胞骨架的強度和柔韌性以及遷移和侵入組織的能力，使其在遷移過程中不易受損，且更具靈活性，促進胃癌耐藥細胞轉(zhuǎn)移并導致耐藥［21-22］。本研究結(jié)果顯示：八寶丹聯(lián)合順鉑能明顯降低胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲能力，抑制N-cadherin、Vimentin 蛋白表達，上調(diào)E-cadherin 蛋白表達，其聯(lián)合結(jié)果比單一應(yīng)用八寶丹和順鉑效果好，提示八寶丹聯(lián)合順鉑可能通過下調(diào)N-cadherin、Vimentin 表達來抑制胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，而E-cadherin的上調(diào)可能與癌細胞遷移能力降低及其對細胞死亡的敏感性有關(guān)。

EMT 另一個標志特征是上皮細胞完整性丟失，其通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白酶，降低上皮細胞間接觸的黏附連接，并會降解上皮鈣粘素，使細胞或細胞群侵入其細胞外基質(zhì)使腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移［23］。相關(guān)報道也顯示：MMPs 的激活顯著增加轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，而MMPs 的低表達可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲［24］。本研究結(jié)果顯示：八寶丹聯(lián)合順鉑干預(yù)胃癌耐藥細胞可降低MMP-2 和MMP-9 的蛋白表達，其降低程度較單一應(yīng)用八寶丹和順鉑明顯，提示八寶丹聯(lián)合順鉑通過下調(diào)MMP-2、MMP-9 相關(guān)蛋白，抑制胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，增加了胃癌耐藥細胞對DDP 的敏感性。

綜上所述，八寶丹聯(lián)合順鉑通過上調(diào)E-cadherin 和下調(diào)N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，抑制了胃癌耐藥細胞的遷移和侵襲，增強胃癌耐藥細胞對DDP 的敏感性。