基于lncRNA MALAT1/Slug/Smad通路調控上皮間質轉化探討白花蛇舌草抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲

華杭菊，陳武進，倪卓娜，劉錦洪，安虹霖，黃 彬，4，林久茂，4*

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；3.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福建 福州 350122；4.福建省中西醫(yī)結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122）

大腸癌（包括結腸癌和直腸癌）是我國臨床中常見的消化道惡性腫瘤之一，容易出現(xiàn)復發(fā)及轉移，60%～80%大腸癌患者確診時屬于晚期［1］。目前研究顯示：大腸癌發(fā)生轉移的重要機制之一為上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），上游信號鋅指轉錄因子Slug 是導致EMT 的關鍵調節(jié)因子，其介導的Slug/Smad相關通路能夠促進EMT的發(fā)生，進而促進大腸癌細胞的侵襲和轉移［2］。長鏈非編碼RNA（lncRNA）肺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在多種腫瘤中表達異常，對腫瘤細胞轉移有重要調控功能［3-4］。研究發(fā)現(xiàn) lncRNA MALAT1 可上調Slug 的表達，提高EMT，從而促進癌細胞轉移［5］。白花蛇舌草（Hedyotis DiffusaWilld.，HDW）具有清熱解毒、消癰散結等功效，現(xiàn)代研究表明HDW可抑制結腸癌細胞增殖和血管新生，誘導細胞凋亡，逆轉多藥耐藥，且無明顯的毒副作用［6-7］。前期研究發(fā)現(xiàn)，HDW 可通過抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導的結直腸上皮間質轉化，減少結腸癌細胞的遷移和侵襲［8］，但HDW 抑制腫瘤轉移的機制尚未完全闡明，對HDW 是否通過調控lncRNA MALAT1/Slug/Smad通路影響EMT 表達，進而抑制大腸癌細胞的遷移和侵襲，還需進一步明確。本實驗構建穩(wěn)定過表達lncRNA MALAT1的人結腸癌HCT-116穩(wěn)轉細胞系，通過HDW 干預，以期進一步明確lncRNA MALAT1/Slug/Smad 通路在大腸癌EMT 和轉移中的作用，以及HDW 發(fā)揮藥效的關鍵機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人結腸癌細胞株HCT-116 購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 實驗試劑 RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液均購自美國Life Technologies公司；Transwell 板、基質膠均購自美國Corning 公

司；四甲基偶氮唑藍干粉（美國Sigma 公司）；TRIzol試劑盒［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；NE-PER 核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒（美國Thermo 公司）；逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；過表達慢病毒lncRNA MALAT1（上海吉凱基因科技有限公司）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Slug、Snail、TGF-β、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Smad2/3、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、GAPDH 抗體和二抗（HRP）均購自美國CST 公司。

1.3 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱均購自美國Thermo 公司；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)LASV 4.1、Countstar 全自動細胞計數(shù)儀均購自美國Life 公司；電泳儀、電泳槽、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 HDW 藥液制備 HDW 全草用85%乙醇回流提取3 次并過濾，合并提取液，濃縮至無醇味，提取液在旋轉蒸發(fā)儀上蒸發(fā)得到浸膏，真空干燥后得到干燥粉末，即HDW 提取物。稱取HDW 提取物粉末0.5 g，加入高壓滅菌超純水1 mL，配制成0.5 g/mL HDW 藥液，置于4 ℃冰箱中保存待用。

2.2 細胞培養(yǎng) 將HCT-116 細胞培養(yǎng)于含有10%FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d 更換RPMI-1640 培養(yǎng)液，每3 d 傳代1次。細胞匯合度達到80%左右時應用0.25%胰酶消化并傳代。

2.3 細胞分組及病毒轉染 取對數(shù)生長期HCT-116 細胞按2×105個/孔接種于6 孔細胞板中，每組設3 個復孔，置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞達80%匯合度時，將細胞分為空白組、藥物組、病毒組和藥物聯(lián)合病毒組。空白組和藥物組加入不含lncRNA MALAT1的空載慢病毒液，病毒組和藥物聯(lián)合病毒組加入含lncRNA MALAT1 過表達的慢病毒液。感染4 d 后，當感染效率達90%以上時，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入1 mg/L 的嘌呤霉素篩選7 d，獲得穩(wěn)定轉染的細胞系。

2.4 藥物干預 空白組和病毒組用0 mg/mL HDW藥液干預，藥物組和藥物聯(lián)合病毒組用0.5 mg/mL HDW 藥液干預。

2.5 RT-qPCR 法檢測細胞lncRNA MALAT1 mRNA相對表達水平 取各組細胞，按2.5×105個/mL 細胞密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL。按“2.4”項下方法干預24 h，使用TRIzol 試劑提取總RNA。應用逆轉錄試劑盒將RNA 反轉錄成cDNA，應用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。具體操作按照試劑盒說明書進行。引物序列由中國寶生物工程（大連）有限公司提供，見表1，lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

表1 引物序列

2.6 MTT 法檢測細胞活力 按1×105個/mL 將細胞接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細胞貼壁后按“2.4”項下方法干預，每組均設8 個復孔。干預培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL 的0.5 mg/mL MTT 后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄液體后加入100 μL DMSO，室溫放置10 min，充分振蕩混勻后于酶標儀450 nm 波長下檢測吸光度OD 值，計算細胞活力。

2.7 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合能力 按照2.5×105個/mL 將細胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，細胞培養(yǎng)至匯合度達到80%～90%時，進行劃痕，PBS 溶液清洗2 次，按“2.4”項下方法干預，分別在干預0、6、24 h 后于顯微鏡下觀察細胞劃痕修復情況。

2.8 Transwell 實驗檢測細胞遷移、侵襲能力 按2.5×105個/mL細胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后按“2.4”項下方法干預24 h，吸棄各孔溶液后進行消化。用空白培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為2.5×105個/mL，將200 μL 細胞懸液滴加于不用基質膠包被（遷移實驗）或預先基質膠包被（侵襲實驗）的Transwell 上室，下室加入700 μL 完全培養(yǎng)基，放入恒溫箱培育12 h。將小室拿出用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%的結晶紫染色15 min，超純水漂洗3 次，用棉簽將上室未遷移細胞擦拭掉，倒置顯微鏡下觀察，隨機取5 個視野拍照，以遷移、侵襲至小室底部的細胞數(shù)作為細胞轉移能力評價指標。

2.9 Western blot 檢測細胞相關蛋白表達量 藥物干預同前，干預后棄上清用PBS 清洗，應用 NEPER 核蛋白和胞漿蛋白抽提試劑盒提取蛋白，用BCA 法做蛋白質定量，進行電泳、轉膜，一抗加入Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin、p-Smad2/3、Smad2/3、E-cadherin（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃下?lián)u床過夜，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。加入對應種屬的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。滴加電化學發(fā)光（ECL）發(fā)光液，在顯影板上用ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)成像，并用Image Lab 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料屬于正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t檢驗；方差不齊采用Dunnett's T3 進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 4 組lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平比較 與空白組比較，藥物組lncRNA MALAT1 mRNA相對表達水平明顯降低（P＜0.05），病毒組lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平明顯升高（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組lncRNA MALAT1mRNA 相對表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

圖1 4 組lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平比較

3.2 4 組細胞活力比較 與空白組比較，藥物組細胞活力明顯降低（P＜0.05），病毒組細胞活力明顯升高（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組細胞活力明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組細胞活力比較

3.3 4 組細胞劃痕愈合能力比較 病毒轉染后lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平的提升促進了的HCT-116 細胞的細胞劃痕愈合能力。HDW 可以顯著性抑制HCT-116 細胞的劃痕愈合能力，并且HDW 對過表達lncRNA MALAT1 的HCT-116 的劃痕愈合能力仍具有抑制作用。見圖3。

圖3 4 組劃痕實驗細胞形態(tài)圖（×200）

3.4 4 組細胞遷移、侵襲能力比較 與空白組比較，病毒組HCT-116 細胞遷移和侵襲能力提高。HDW不僅對于正常HCT-116 細胞的遷移、侵襲能力有顯著性抑制作用，并且對過表達lncRNA MALAT1 的HCT-116 細胞遷移、侵襲能力仍具有抑制作用。見圖4。

圖4 4 組Transwell 遷移、侵襲實驗圖（×200）

3.5 4 組相關蛋白表達量比較 與空白組比較，藥物組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達量和p-Smad/Smad 明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達量明顯提高（P＜0.05）；病毒組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達量和p-Smad/Smad 明顯提高（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）；與病毒組比較，藥物聯(lián)合病毒組Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量和p-Smad/Smad 明顯降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達量明顯提高（P＜0.05）。見圖5、表2。

圖5 4 組相關蛋白條帶圖

表2 4 組相關蛋白表達量比較（±s）

表2 4 組相關蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與病毒組比較，2） P＜0.05。

Vimentin 0.96±0.05 0.49±0.031）1.40±0.071）0.85±0.032）組別空白組藥物組病毒組藥物聯(lián)合病毒組Slug 0.98±0.06 0.72±0.031）1.32±0.081）0.83±0.062）Snail 0.94±0.04 0.73±0.091）1.48±0.041）1.11±0.042）TGF-β 0.95±0.04 0.65±0.081）1.43±0.091）0.97±0.052）p-Smad/Smad 0.99±0.06 0.34±0.041）1.03±0.081）0.86±0.052）E-cadherin 0.70±0.041）1.25±0.031）0.43±0.051）0.52±0.042）N-cadherin 0.97±0.03 0.65±0.081）1.40±0.011）0.97±0.062）

4 討 論

目前大腸癌早期主要以手術為主，晚期以放化療、免疫治療及營養(yǎng)支持治療為主。中醫(yī)藥在大腸癌康復治療過程中起到重要作用，可增強大腸癌康復過程中放化療效果，減少免疫、靶向治療毒副作用，改善大腸癌晚期并發(fā)癥作用，特別是在預防大腸癌復發(fā)、轉移過程中起到重要作用［9］。大腸癌屬于中醫(yī)學“腸蕈”“積聚”“腸積”等范疇，其病機為濕熱與癌毒郁結大腸，濕熱傷腸絡，毒邪蘊毒成癰，以濕熱瘀毒為主要證候特征，其主要治則是清熱利濕、解毒散結、化瘀消癰。HDW 為茜草科耳草屬植物，性寒、味微苦、微甘，歸胃經、大腸經、小腸經，具有清熱解毒、消痛散結、利尿除濕等功效，符合大腸癌的辨證論治。

EMT 是腫瘤發(fā)生侵襲轉移的重要步驟。EMT的主要分子特征為細胞黏附分子E-cadherin 表達的喪失和N-cadherin、Vimentin 表達升高。EMT 轉化過程受到Slug、Snail 等轉錄因子的調控，Slug 蛋白被認為是EMT 轉化過程的重要調控因子［10］。lncRNA 在腫瘤轉移中的作用被逐漸重視，并被證實可以抑制包括大腸癌在內的多種腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，lncRNA MALAT1 可上調Snail、TGF-β的表達［11］。進一步與下游轉錄因子Smad 結合形成復合物轉入細胞核內，并與其他轉錄因子或者輔助蛋白一起調控靶基因轉錄，使E-cadherin 表達降低，N-cadherin、Vimentin 表達升高，提高EMT 能力，進而使腫瘤細胞的轉移能力增強［3-5］。因此，阻斷l(xiāng)ncRNA MALAT1/Slug/Smad 通路調控EMT 是有效的防治腫瘤轉移方式。

本研究構建穩(wěn)定過表達lncRNA MALAT1 的HCT-116 穩(wěn)轉細胞系，與空白組比較，藥物組HDW可下調lncRNA MALAT1 mRNA 相對表達水平，抑制腫瘤細胞的生長，而病毒組中單獨過表達lncRNA MALAT1 后促進了腫瘤細胞增殖、遷移能力。此外，lncRNA MALAT1 過表達后再進行HDW 的干預，腫瘤細胞增殖、遷移能力下降，提示MALAT1 是藥物的靶點之一。

研究結果顯示：lncRNA MALAT1過表達后HCT-116 細胞Slug、Snail、TGF-β、N-cadherin、Vimentin蛋白表達量和Smad2/3 蛋白磷酸化程度明顯上調，E-cadherin 蛋白表達量明顯下調，而藥物組和藥物聯(lián)合病毒組均可以逆轉上述相關蛋白的表達。提示lncRNA MALAT1 可通過激活Slug/Smad 通路促進大腸癌的EMT 和轉移，而HDW 抑制大腸癌細胞遷移和侵襲的藥效關鍵機制之一是MALAT1/Slug/Smad 信號通路，減少EMT，進而抑制大腸癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，HDW 可明顯下調MALAT1進而顯著抑制Slug/Smad 通路活化，降低了腫瘤的侵襲性，進而抑制腫瘤轉移。但由于人體腫瘤轉移過程中免疫、激素調節(jié)、營養(yǎng)、環(huán)境以及治療的相互影響，白花蛇舌草準確的抗腫瘤機制需要更深入地研究。