腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽在海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚生態(tài)養(yǎng)殖模式中的應(yīng)用研究

薛德林 劉志國(guó) 關(guān) 蕾 索艷麗 孫向陽(yáng) 潘華奇 胡江春

1 中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所 沈陽(yáng) 110016

2 遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司 沈陽(yáng) 110022

3 大連翔華生物技術(shù)有限公司 大連 116222

腐植酸作為一種飼料添加劑，使用方便，價(jià)格低廉，同時(shí)具有特殊的功效和作用，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然綠色飼料添加劑[1]。在豆粕發(fā)酵中添加腐植酸具有1+1≥2 的效果[2]。利用腐植酸的螯合特性能降解水體中毒素，抑制細(xì)菌、病毒，激活池水，調(diào)節(jié)pH 值，補(bǔ)充水體養(yǎng)分，吸附和分解氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽等有毒有害物質(zhì)；利用其絡(luò)合特性能夠調(diào)水、凈水，絡(luò)合重金屬處理渾濁、泛底、死藻、油膜、泡沫等水質(zhì)情況；利用其物理特性能夠遮光，控制青苔生長(zhǎng)，調(diào)整菌相、藻相和水色并改良底質(zhì)泥土；利用其收斂特性能夠調(diào)理海刺參腸胃，緩解白便，緩解中毒性腸炎、物理性腸炎等病癥[1]。

近年來(lái)，在海產(chǎn)品養(yǎng)殖中，海刺參和基圍蝦是經(jīng)濟(jì)效益最佳的養(yǎng)殖品種。本試驗(yàn)針對(duì)一種創(chuàng)新型的腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌與海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚混套養(yǎng)模式[2]，研究和分析其增產(chǎn)效果、經(jīng)濟(jì)效益等，為參、蝦、魚混套養(yǎng)模式在遼寧、山東、河北等海參養(yǎng)殖區(qū)域推廣和應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

（1）丁酸梭菌（Closhridium butyricum）：從中國(guó)工業(yè)微生物保藏管理中心購(gòu)買。丁酸梭菌是專性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，在腸道內(nèi)能代謝產(chǎn)生多種B 族維生素、維生素E 和酶類物質(zhì)，厭氧發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生大量淀粉酶，水解淀粉和糖類的最終代謝產(chǎn)物為乙酸、丙酸、丁酸等，其比例為10%∶13%∶68%；發(fā)酵終點(diǎn)為pH 3.5，有機(jī)酸50%；可有效改善養(yǎng)殖動(dòng)物腸道健康，供給腸道內(nèi)益生菌能量，增強(qiáng)免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)。

（2）植物乳桿菌（Lactobacillus acidophilusCICC 6074）：從中國(guó)工業(yè)微生物保藏管理中心購(gòu)買。植物乳桿菌兼性厭氧發(fā)酵，能產(chǎn)生大量乳酸，抗菌肽、蛋白酶和生物活性物質(zhì)。

（3）貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）：從中國(guó)工業(yè)微生物保藏管理中心購(gòu)買。好氧發(fā)酵，生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)，能夠充分利用有機(jī)氮，能分泌產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)、脂肽類抗生素和激素。

（4）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis2018）：從遼寧大連黃海海域底泥中分離得到。好氧發(fā)酵，可產(chǎn)生活性肽，能充分利用有機(jī)氮和含硫物，分解糞便和殘余餌料，降解氨氮、硫化氫和亞硝酸鹽。

（5）海洋膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa2019）：從遼寧大連渤海海域大連瓦房店謝屯五島海參養(yǎng)殖場(chǎng)海參圈中分離得到。好氧發(fā)酵，產(chǎn)生多種酶類物質(zhì)，類胡蘿卜素和蝦青素，有很好的誘食效果。

1.1.2 供試發(fā)酵原料

（1）腐植酸：從內(nèi)蒙古霍林河郭勒樹(shù)艷腐植酸公司購(gòu)買。腐植酸含量≥60%，細(xì)度≤80 目，水分≤15%，pH 5.0。腐植酸參與發(fā)酵可以產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，具有收斂、解毒、消炎、止痢、替抗等功能。

（2）豆粕：黑龍江省九三油脂集團(tuán)生產(chǎn)，市售。顏色為淺黃色，有大豆香味。成分：蛋白質(zhì)50%、賴氨酸3.0%、色氨酸0.7%、蛋氨酸0.9%、水分≤10.0%。

（3）精氨酸發(fā)酵液濃漿粉：從河北精晶藥業(yè)科技股份公司購(gòu)買。蛋白質(zhì)含量≥52%、碳水化合物（糖）≥8.0%、總磷含量≥1.0%、灰分≤5.0%、水分≤8.0%、細(xì)度≤100 目。

（4）麥麩皮：五得利面粉集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，市售。蛋白質(zhì)13.6%、脂肪5.0%、碳水化合物64.5%、水分≤10.0%。

1.1.3 供試設(shè)備

（1）微生物發(fā)酵罐：匯森生物設(shè)備（鎮(zhèn)江）有限公司。

（2）微生物固體發(fā)酵器：上海鵬平生物設(shè)備制造公司。

（3）低溫負(fù)壓流化床：上海鵬平生物設(shè)備制造公司。

（4）微粉機(jī)：上海春谷粉碎機(jī)制造公司。

1.1.4 供試養(yǎng)殖苗種

（1）海刺參：大連翔華生物技術(shù)有限公司萬(wàn)眾海參養(yǎng)殖場(chǎng)，自繁。

（2）基圍蝦：海南騰海水產(chǎn)科技有限公司，外購(gòu)。

（3）藍(lán)子魚：福建漳州東山養(yǎng)殖公司，外購(gòu)。

1.2 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽產(chǎn)品生產(chǎn)工藝

以腐植酸、豆粕為發(fā)酵原料與丁酸梭菌等5 種菌液混合進(jìn)行固體發(fā)酵，低溫烘干粉碎，得腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽產(chǎn)品。其生產(chǎn)工藝為：菌種活化→液體發(fā)酵→固體料與液體菌種混合→微生物固體發(fā)酵器中發(fā)酵→低溫負(fù)壓流化床烘干→微粉機(jī)粉碎→產(chǎn)品保證值檢測(cè)。

1.2.1 液體發(fā)酵

（1）丁酸梭菌培養(yǎng)與發(fā)酵：丁酸梭菌菌種1 支→1000 mL 三角瓶10 瓶（厭氧培養(yǎng)48 h）→500 L 發(fā)酵罐（厭氧發(fā)酵24 h）→5 T 發(fā)酵罐（厭氧發(fā)酵72 h）。發(fā)酵罐液體發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，用平皿培養(yǎng)法檢測(cè)，丁酸梭菌培養(yǎng)密度不低于20×108cfu/mL 為合格產(chǎn)品，無(wú)菌密閉條件下灌裝到5 L 或10 L 塑料瓶中，即得到丁酸梭菌WL21-01 生物制劑，入庫(kù)備用。

（2）植物乳桿菌：培養(yǎng)過(guò)程同丁酸梭菌。區(qū)別為：培養(yǎng)基不一樣，培養(yǎng)方式兼性厭氧，保壓不通氣。植物乳桿菌培養(yǎng)密度不低于80×108cfu/mL為合格產(chǎn)品。

（3）貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌：培養(yǎng)基中C/N=1/5，培養(yǎng)方式好氧發(fā)酵，萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌培養(yǎng)密度不低于200×108cfu/mL為合格產(chǎn)品。

（4）海洋膠紅酵母：培養(yǎng)基中C/N=3/2，培養(yǎng)方式好氧發(fā)酵，培養(yǎng)密度不低于20×108cfu/mL為合格產(chǎn)品。

1.2.2 固體發(fā)酵

（1）液體菌種與原料混合比例：50 ∶100。（2）5 種液體菌種混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1。

（3）4 種發(fā)酵原料混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1。

（4）固體發(fā)酵：液體菌種和發(fā)酵原料放入到固體發(fā)酵器中，經(jīng)好氧、厭氧發(fā)酵過(guò)程，溫度控制在38 ～50 ℃之間，發(fā)酵時(shí)間100 h。

1.2.3 烘干粉碎和產(chǎn)品保證值

（1）烘干：經(jīng)低溫負(fù)壓流化床烘干，入口溫度為100 ℃，出口溫度為40 ℃，物料流化時(shí)間為12 min。（2）粉碎：微粉機(jī)粉碎到200 目，得到腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽。

（3）產(chǎn)品保證值檢測(cè)依據(jù)：粗蛋白按照飼料中粗蛋白測(cè)定方法（GB/T 6432—1994）進(jìn)行測(cè)定；小肽按照飼料中酸溶蛋白的測(cè)定方法（GB/T 22492—2008）進(jìn)行測(cè)定（小肽分子量小于2000 道爾頓）；酸度按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品酸度的測(cè)定方法（GB 5413.34—2010）對(duì)飼料中酸度進(jìn)行測(cè)定；氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸）按照飼料中氨基酸的測(cè)定方法（GB/T 18246— 2000）進(jìn)行測(cè)定；揮發(fā)性鹽基氮按照飼料中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定方法（GB/T 32141—2015）進(jìn)行測(cè)定；水分按照飼料中水分的測(cè)定方法（GB/T 6435—2014）進(jìn)行測(cè)定。pH 值按照水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法（GB/T 5009.45—2003）進(jìn)行測(cè)定。

（4）腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽產(chǎn)品保證值測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽產(chǎn)品保證值Tab.1 Guaranteed value of humic acid soybean meal fermentation peptide products

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

試驗(yàn)時(shí)間：2021 年5 月20 日—10 月20 日。

試驗(yàn)地點(diǎn)：在遼寧省大連市普灣新區(qū)皮口社區(qū)萬(wàn)眾海產(chǎn)品養(yǎng)殖區(qū)（東經(jīng)122°21′，北緯39°34′）進(jìn)行，海刺參收獲2次、基圍蝦收獲多次、藍(lán)子魚收獲1 ～2 次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

表2 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Tab.2 Experimental design of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum

藍(lán)子魚投放水溫應(yīng)穩(wěn)定在18 ℃以上。水溫超過(guò)20 ℃時(shí)，水草、藻類、青苔生長(zhǎng)較旺盛，全池覆蓋率60%，每畝投放藍(lán)子魚苗0.1 kg（300 元/kg）折合投入30 元/畝，投苗規(guī)格為每1000 尾/kg；覆蓋率低的可以按比例減少投放魚苗尾數(shù)。藍(lán)子魚啃食草、藻、苔生長(zhǎng)，排出的糞便通過(guò)微生物作用分解，化害為寶，既消除了糞便對(duì)水草、藻類、青苔的威脅又增加了微生物群體的數(shù)量，為海刺參的生長(zhǎng)提供優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白餌料，促進(jìn)水生環(huán)境的生態(tài)平衡。

秋季水溫低于15 ℃時(shí)，藍(lán)子魚開(kāi)始大量死亡，此時(shí)藍(lán)子魚規(guī)格大約每尾0.20 ～0.25 kg，在此之前必須將魚撈出，出售。

3 結(jié)果分析

3.1 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚產(chǎn)量的影響

腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚產(chǎn)量的影響結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?，試驗(yàn)組1 與對(duì)照組相比，海刺參增重37.0 kg/畝，基圍蝦增重2.6 kg/畝，藍(lán)子魚增重1.9 kg/畝；試驗(yàn)組2 與對(duì)照組相比，海刺參增重41.9 kg/畝，基圍蝦增重2.6 kg/畝，藍(lán)子魚增重2.3 kg/畝；試驗(yàn)組3 與對(duì)照組相比，海刺參增重49.0 kg/畝，基圍蝦增重4.0 kg/畝，藍(lán)子魚增重2.7 kg/畝，海刺參增重率提高26.46%～34.48%；基圍蝦增重率提高23.63%～36.36%，藍(lán)子魚增重率提高38.0%～54.0%。

表3 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚產(chǎn)量的影響Tab.3 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the yield of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.2 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海參圈理化指標(biāo)的影響

腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海參圈中硫化氫、氨氮、亞硝酸鹽、溶解氧、pH 值等理化指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表4。可以看出，與對(duì)照組相比，投放腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌后，海參圈中硫化氫降低0.003 ～0.010 mg/L，氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L，亞硝酸鹽降低0.013 ～0.024 mg/L，溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L，pH 值趨于穩(wěn)定，透明度提高14.6 ～29.8%，濁度降低1.9 ～8.3%，底棲硅藻增加2 ～7 g/m2。

表4 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海參圈理化指標(biāo)的影響Tab.4 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on physical and chemical indexes of sea cucumber ring

3.3 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚養(yǎng)殖模式經(jīng)濟(jì)效益分析

腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚生態(tài)養(yǎng)殖模式經(jīng)濟(jì)效益的分析結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯觯囼?yàn)組1 投入成本增加600 元/畝，收入增加6374 元/畝，凈收益增加5774 元/畝；試驗(yàn)組2 投入成本增加1200 元/畝，收入增加7198 元/畝，凈收益增加5998 元/畝；試驗(yàn)組3 投入成本增加1500 元/畝，收入增加8406 元/畝，凈收益增加6906 元/畝，效果最好。

表5 腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對(duì)海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚養(yǎng)殖模式經(jīng)濟(jì)效益分析Tab.5 Economic benef it analysis of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the culture model of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.4 海參圈投入產(chǎn)出情況統(tǒng)計(jì)分析比較

海參圈投入海刺參苗重量、規(guī)格及其分布和投入產(chǎn)出情況統(tǒng)計(jì)分析比較結(jié)果見(jiàn)表6?？梢钥闯?，海參圈投入海刺參苗重量34 kg/畝以上，規(guī)格是大中小均有，數(shù)量是大小均勻分布，呈現(xiàn)一種合理的分布狀態(tài)，海參圈產(chǎn)出成品參重量188 kg/畝以上。海參圈海刺參幼稚參投入重量與產(chǎn)出成品參重量比為1 ∶5.53（投入1 kg 幼稚參，產(chǎn)出5.53 kg 成品參）。

表6 海參圈投入海刺參苗重量、基圍蝦蝦苗數(shù)量及其投入產(chǎn)出情況統(tǒng)計(jì)分析比較Tab.6 Statistical analysis and comparison of seedling weight of sea stichopus, seedling number of basal shrimp and its input-output in sea cucumber ring

4 結(jié)果與討論

（1）在海刺參養(yǎng)殖中混套養(yǎng)基圍蝦、藍(lán)子魚，以腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽20 kg/ 畝、丁酸梭菌5 kg/ 畝和植物乳桿菌5 kg/畝用量，并按照潮汐期規(guī)律使用6 次，能夠有效調(diào)整水體中的C/N 營(yíng)養(yǎng)比例，促進(jìn)有益微生物繁殖生長(zhǎng)，調(diào)整和改善水體顏色，穩(wěn)定水質(zhì)，增產(chǎn)增收[2，3]。

（2）本試驗(yàn)結(jié)果表明，腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌可以使海刺參增重率提高26.46%～34.48%，基圍蝦增重率提高23.63%～36.36%，藍(lán)子魚增重率提高38.0%～54.0%。經(jīng)測(cè)定，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組海參圈理化指標(biāo)均有變化：硫化氫降低0.003 ～0.010 mg/L、氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L、亞硝酸鹽降低0.013 ～0.024 mg/L、溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L；pH值穩(wěn)定在8.15 ～8.20 之間、透明度提高14.6 ～29.8%、濁度降低1.9 ～8.3%、底棲硅藻增加2 ～7 g/m2。從經(jīng)濟(jì)效益看，試驗(yàn)組3 效果最好，投入成本增加1500 元/畝，收入增加8406 元/畝，凈收益增加6906 元/畝；海刺參苗種重量投入產(chǎn)出比為1 ∶5.53。

（3）在本研究中，海參圈水體和底泥中的動(dòng)物糞便和殘余餌料，腐爛后會(huì)產(chǎn)生硫化氫發(fā)黑發(fā)臭，滋生病菌，生成大量的氨氮和亞硝酸鹽，當(dāng)亞硝酸鹽濃度超標(biāo)時(shí)，就會(huì)造成養(yǎng)殖動(dòng)物的死亡。貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均為好氧菌，能加速參池底部堆積有機(jī)物的分解，將大分子有機(jī)物降解為多肽等小分子有機(jī)物，再降解成為氨基酸、單糖等，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽、硫酸鹽等物質(zhì)，使海參圈中的化學(xué)需氧量，生物需氧量降低，水質(zhì)得到有效改善。同時(shí)，海參圈中有大量的單細(xì)胞藻類等浮游植物，可以作為海刺參的食物。浮游植物又可以通過(guò)光合作用產(chǎn)生大量氧氣和糖類等有機(jī)物，這為棲息在底部的海刺參的呼吸、有機(jī)物的分解提供了氧氣，由此使海參圈形成一個(gè)良好的微生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)[3～5]。

（4）植物乳桿菌繁殖過(guò)程中產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能降解重金屬，產(chǎn)生的乳酸桿菌素是一種生物型的防腐劑，也能很好地抑制底部糞便和殘餌料的腐爛，降低了氨氮和亞硝酸鹽的增加，減少了化學(xué)降氮增氧劑的用量，使其養(yǎng)殖成本降低，如果長(zhǎng)期使用丁酸梭菌能為植物乳酸菌等腸道益生菌的生長(zhǎng)繁殖提供能量，二者優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、相互促進(jìn)，共同構(gòu)建腸道優(yōu)勢(shì)菌群，護(hù)衛(wèi)腸道安全[1，6]。

（5）有益微生物菌群作為辛勤的“清道夫”和“腸道衛(wèi)士”，清理底泥中發(fā)黑發(fā)臭腐爛物、氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫，同時(shí)益生菌菌體蛋白為海刺參提供良好的養(yǎng)殖環(huán)境和優(yōu)質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源。藍(lán)子魚作為辛勤的“園丁”，啃食水草、大型藻類、苔蘚，將其轉(zhuǎn)化成糞便，通過(guò)微生物作用將糞便分解，化害為寶，既消除苔、藻、草的威脅又增加了微生物群體的數(shù)量，為海刺參的生長(zhǎng)提供優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白餌料。同時(shí)，增加腐植酸使用量，降低光照強(qiáng)度，可以控制苔蘚、大型藻類、雜草等植物的生長(zhǎng)，降低雇傭潛水員撈草的人工費(fèi)用和使用化學(xué)藥品殺草對(duì)池底的污染和對(duì)生態(tài)平衡的破壞[1，2，6]。

（6）本試驗(yàn)將腐植酸豆粕發(fā)酵活性肽、丁酸梭菌和植物乳桿菌應(yīng)用于海刺參、基圍蝦、藍(lán)子魚混套生態(tài)養(yǎng)殖模式，在遼寧、山東和河北等地海參養(yǎng)殖區(qū)域推廣應(yīng)用，將會(huì)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。