胃食管反流病及抗反流藥物靶基因與阻塞性睡眠呼吸暫停的關(guān)聯(lián)孟德爾隨機(jī)化研究*

嚴(yán)詔琦,徐義峰,李可可,劉良徛

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,南昌 330006)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是近年來受到廣泛關(guān)注的多學(xué)科疾病,其特征為睡眠期間上呼吸道部分或完全塌陷的反復(fù)發(fā)作,導(dǎo)致間歇性缺氧和過度嗜睡[1],這對生活質(zhì)量和預(yù)期壽命均產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。目前,臨床上對OSA多采取對癥治療,藥物選擇十分有限[2]。據(jù)估計(jì),OSA影響全球近10億成人,且年患病率還在持續(xù)增加[3],考慮到OSA的高患病率和危害,明確OSA的風(fēng)險(xiǎn)因素對促進(jìn)OSA預(yù)防及治療至關(guān)重要[4]。

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)被定義為每周至少一次的燒心和(或)反流。GERD和OSA常合并出現(xiàn),且兩者均有共同的危險(xiǎn)因素(similar pathogenetic features),例如年齡增長和肥胖等[5]。有文獻(xiàn)表明GERD是OSA的一個(gè)危險(xiǎn)因素,胃的反流內(nèi)容物可能導(dǎo)致上氣道炎癥甚至阻塞促進(jìn)OSA的發(fā)展[6]。此外,有系統(tǒng)評價(jià)指出GERD與OSA之間存在顯著關(guān)聯(lián)[7],相應(yīng)地,有許多研究表明了治療GERD的同時(shí),也對OSA表現(xiàn)出治療效果[8-10],這提示應(yīng)用抗反流藥物在OSA的治療上或許是一個(gè)新的方向。

然而,尚不清楚GERD是否與OSA具有因果關(guān)系,抗GERD藥物靶點(diǎn)對OSA的影響也需進(jìn)一步評估。孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization,MR)是一種分析方法,利用人類的遺傳變異來研究可改變的疾病暴露的因果效應(yīng)。由于單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的兩個(gè)等位基因在孟德爾定律下是隨機(jī)分離的,因此MR具有比其他研究方法更不容易受混雜因素影響的優(yōu)點(diǎn)。因此,本研究進(jìn)行了雙樣本孟德爾隨機(jī)化(two-sample MR,2SMR)分析以解決以下問題:①GERD是否與OSA的風(fēng)險(xiǎn)增加有因果關(guān)系;②抗反流病的藥物是否能作為OSA的候選治療藥物;③抗反流病的藥物對OSA潛在的作用途徑。

1 資料與方法

1.1資料 GERD的數(shù)據(jù)來自于歐洲人口研究中迄今公布的最新、最大的樣本集,總樣本量為602 604例,包括患病者129 080例和正常人群473 524例[11]。OSA的數(shù)據(jù)來自FinnGen集團(tuán)G8項(xiàng)目,包括33 423例和307 648例對照。數(shù)據(jù)詳情可在FinnGen網(wǎng)址下載(https://finngen.gitbook.io/documentation)。

1.2方法

1.2.1研究設(shè)計(jì) 用全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study,GWAS)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化(MR)分析,以研究GERD與OSA的因果關(guān)系。MR分析使用SNP作為工具變量(instrumental variable,IV),并基于3個(gè)假設(shè):①IV與暴露強(qiáng)烈相關(guān)(P<5×10-8);②IV與潛在混雜因素?zé)o關(guān);③IV只通過暴露因素影響結(jié)局。

1.2.2遺傳工具的構(gòu)建 將GERD和OSA兩種疾病的匯總數(shù)據(jù)限定于歐洲人群,以避免人口分層帶來的潛在偏差。本研究進(jìn)行了嚴(yán)格的SNPs過濾以此尋找代表GERD的遺傳工具。首先,提取了顯著的獨(dú)立SNPs(P<5×10-8),及進(jìn)行連鎖不平衡(r2<0.001,kb>10 000)。其次,鑒于高血壓、肥胖、吸煙是OSA的既定危險(xiǎn)因素[12],通過查詢PhenoscannerV2網(wǎng)站(http://www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/),以識(shí)別并排除與既定危險(xiǎn)因素相關(guān)的任何暴露SNP。隨后,計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量來評估遺傳工具變量的強(qiáng)度[13]。最后,從OSA結(jié)果數(shù)據(jù)中提取暴露SNP,將暴露SNP與結(jié)果SNP協(xié)調(diào),以排除回文SNP。經(jīng)上述過濾步驟后留下的SNP最終用于MR分析。

1.2.3協(xié)調(diào)混雜因素 由于肥胖是公認(rèn)的GERD和OSA的危險(xiǎn)因素[14-15],因此從人體測量特征遺傳調(diào)查(international consortium for anthropometric trait genetics,GIANT)聯(lián)盟中選擇了肥胖的匯總數(shù)據(jù)[16]作為進(jìn)行多變量孟德爾隨機(jī)化(multivariable mendelian randomization,MVMR)分析的工具變量,GIANT將肥胖表型分為3級(jí):一級(jí)肥胖包括患者55 229例和健康對照104 894例;二級(jí)肥胖包括患者15 334例和健康對照97 858例;三級(jí)肥胖包括患者2 986例和健康對照67 010例,通過構(gòu)建不同的肥胖分級(jí)模型以評估這一潛在危險(xiǎn)因素在GERD對OSA因果關(guān)聯(lián)中的影響。

1.2.4藥物靶點(diǎn)及通路分析 受抗反流藥物對OSA益處的啟發(fā),進(jìn)一步對抗反流藥靶點(diǎn)與OSA風(fēng)險(xiǎn)之間的因果關(guān)系進(jìn)行了2SMR分析。首先,以“Gastroesophageal reflux disease”為關(guān)鍵詞檢索了DrugBank(https://go.drugbank.com)數(shù)據(jù)庫中抗反流藥物及其靶基因。根據(jù)所得的靶基因,從dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbvar)數(shù)據(jù)庫中逐一尋找靶基因信息,摘錄基因組上下文(包括注釋的染色體位置和堿基位置信息區(qū)間段),使用R中‘TwoSampleMR'包來提取GERD中對應(yīng)靶基因的堿基位置信息區(qū)間段,位置±100 kb,以此作為治療GRED的抗反流藥物靶基因的eQTL(expression quantitative trait loci,eQTL)(表達(dá)定量性狀位點(diǎn))。由于每種藥物靶點(diǎn)基因中包含的SNP數(shù)量相對較小,因此選擇更自由的閾值(P<5×10-5,等位基因頻率>1%),并且不進(jìn)行連鎖不平衡。根據(jù)所得結(jié)果,提取了與OSA有顯著關(guān)聯(lián)的靶基因(P<0.05),最后通過DAVID數(shù)據(jù)庫對所得靶點(diǎn)基因進(jìn)行行京都基因(GO)和基因組百科全書(KEGG)途徑富集分析,保留P<0.05的結(jié)果。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析 使用‘TwoSampleMR'包0.5.2版進(jìn)行2SMR分析,以逆方差加權(quán)法(inverse-variance weighted,IVW)為主要的評估方法,并采用加權(quán)中位數(shù)(weighted median,WM)、加權(quán)模式(weighted method)和MR-Egger等多種方法來提高因果推理的可靠性。以P<0.05作為 2SMR 研究統(tǒng)計(jì)顯著性的判別標(biāo)準(zhǔn)。采用MR-PRESSO和Leave-one-out法進(jìn)行敏感度分析來檢驗(yàn)是否存在對MR估計(jì)值影響過大的SNP;同時(shí)利用Cochran Q統(tǒng)計(jì)量的P值以探索結(jié)果異質(zhì)性的大小;是否存在多效性由MR-Egger方法的截距項(xiàng)決定;對于不存在異質(zhì)性的結(jié)果選擇固定效應(yīng)分析,反之選擇隨機(jī)效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1總樣本量 為602,604例,包括患病者129 080例和正常人群473 524例(詳細(xì)匯總結(jié)果見表1)。

表1 全基因組關(guān)聯(lián)研究總結(jié)Tab.1 Summary of genome-wide association studies

2.2GERD可促進(jìn)OSA風(fēng)險(xiǎn) 本研究確定了GERD對增加OSA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在顯著因果關(guān)系,IVW分析顯示[P=5.29×10-22,(OR):1.43,95%置信區(qū)間(confidence interval,CI):1.33-1.54],其他分析方法如MR Egger、Weighted median、Weighted mode、Simple mode均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且與IVW分析結(jié)果具有相同方向和幅度(圖1)。此外,GERD和OSA的MR-Egger截距回歸表明本次研究所納入的SNP不存在水平多效性,同時(shí)Cochran的Q統(tǒng)計(jì)量顯示兩者之間幾乎沒有異質(zhì)性的證據(jù)(P<0.05)。MR-PRESSO為0.06>0.05,且進(jìn)一步的Leave-one-out分析提示沒有SNP對結(jié)果有過大的影響(所有行都在0的右側(cè)),漏斗圖顯示兩側(cè)散點(diǎn)大致均勻。見圖2,3。

圖1 GERD與OSA的MR分析結(jié)果森林圖-基于5種分析方法Fig.1 Forest plot of MR analysis results for GERD and OSA-based on five analysis methods

圖2 GERD與OSA因果關(guān)聯(lián)的Leave-one-out分析(左)和森林圖(右)Fig.2 Leave-one-out analysis(left) and forest map(right) of the causal association between GERD and OSA

圖3 GERD與OSA因果關(guān)聯(lián)的散點(diǎn)圖(左)和漏斗圖(右)Fig.3 Scatter plot(left) and funnel plot(right) of the causal association between GERD and OSA

補(bǔ)充說明:F=[R2(N-K-1)/K(1-R2)],N表示暴露因子的樣本量,k表示每種儀器中的SNP數(shù)量,R2表示工具解釋的方差。1級(jí)肥胖,30≤BMI<35 kg·(m2)-1;2級(jí)肥胖,35≤BMI<40 kg·(m2)-1;3級(jí)肥胖,BMI≥40 kg·(m2)-1。

2.3MVMR模型 通過協(xié)調(diào)肥胖分級(jí)的工具變量,共進(jìn)行了7次模型分析,在多次調(diào)整混雜暴露效應(yīng)后,GERD與OSA的因果關(guān)聯(lián)仍舊穩(wěn)定(P<0.05),GERD對OSA的風(fēng)險(xiǎn)OR值在1.28～1.38間波動(dòng)(圖4)。

圖4 多次協(xié)調(diào)肥胖因素后GERD對OSA因果影響的MR結(jié)果Fig.4 MR results of the causal effect of GERD on OSA after multiple coordinating of obesity factors

2.4抗反流藥物和OSA 截至2023年2月,通過DrugBank數(shù)據(jù)庫共獲得了29種治療GERD的抗反流藥,涵蓋了從相關(guān)藥物中提取的69個(gè)靶基因、酶基因、載體蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。使用與抗反流藥物靶基因相關(guān)的SNP(P<5×10-5)作為工具變量,對治療GERD藥物靶基因與OSA風(fēng)險(xiǎn)之間的因果關(guān)系進(jìn)行了2SMR分析。結(jié)果表明,BCHE[IVW,(OR):2.59,95%CI=(1.33,5.02)]、DRD2[IVW,(OR):1.50,95%CI=(1.20,1.89)]、GRM5[IVW,(OR):1.83,95%CI=(1.14,2.94)]、PTGER3[IVW,(OR):2.21,95%CI=(1.70,2.78)]與OSA風(fēng)險(xiǎn)增加有因果關(guān)系。見表2。涉及藥物包括尼扎替丁,溴必利,ADX10059,米索前列醇。

表2 抗反流藥物靶基因和OSA的MR分析結(jié)果Tab.2 MR analysis results for target genes of anti-reflux drugs and OSA

2.5富集結(jié)果 基于GO和KEGG的富集分析;KEGG通路顯示與Neuroactive ligand-receptor interaction和Gap junction等通路有關(guān);GO分析結(jié)果顯示,主要參與regulation of long-term neuronal synaptic plasticity、learning等生物過程(圖5)。

圖5 靶點(diǎn)基因的GO分析圖Fig.5 GO analysis of target genes

京都基因和基因組百科全書(KEGG)的氣泡圖富集和抗反流藥物靶點(diǎn)基因的基因本體論(GO)分析。BCHE、DRD2、GRM5和PTGER3共享差異基因的KEGG富集和GO分析。顏色表示P值(從上到下顏色越淺,P值越小),氣泡大小表示基因數(shù)量。豐富因子代表基因總數(shù)的比例。

3 討論

食管與呼吸系統(tǒng)的關(guān)系非常密切,從胚胎發(fā)育開始到生理功能上兩者都存在許多共通之處。解剖上食管和氣管、支氣管及肺都起源于前腸后部,共始于管腔-咽腔。生理上食管內(nèi)食團(tuán)的輸送及其蠕動(dòng)波也對肺功能造成影響,同樣地,胸膜腔內(nèi)的壓力改變可傳遞到食管內(nèi)[16-17]。目前主流學(xué)術(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為GERD導(dǎo)致OSA有以下方面:患GERD者食管下端括約肌功能不全,導(dǎo)致食管未能迅速清除反流物,繼而通過迷走神經(jīng)反射性引起氣管收縮,或者反流到咽部的胃酸等物質(zhì)直接刺激咽部和氣管,引起咽部炎癥滲出、水腫,導(dǎo)致上呼吸道阻力增加,從而加重氣道阻塞,最終發(fā)展為呼吸暫停和低通氣[6,8]。KIM等[18]也曾報(bào)道經(jīng)過胃鏡證實(shí)胃反流性食管炎的嚴(yán)重程度與OSA嚴(yán)重程度的相關(guān)性;此外,非常頻繁的反流事件可能通過中樞神經(jīng)系而加重或?qū)е潞粑鼤和19];最后,若食管內(nèi)的酸性反流物長期緩慢微量吸入到氣管導(dǎo)致氣管壁層厚、狹窄、彈性下降而加重OSA。VELA等[20]也報(bào)道過GERD最主要癥狀中的反酸和燒心是OSA發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。統(tǒng)覺醒、迷走神經(jīng)刺激的慢性下食管炎癥以及伴上氣道動(dòng)力學(xué)變化的喉部炎癥導(dǎo)致氣道收縮進(jìn)而發(fā)展為呼吸暫停[21];有學(xué)者認(rèn)為食團(tuán)反流入食管引起了迷走神經(jīng)反射,通過目前暫未明確的化學(xué)受體使聲門關(guān)閉,從本研究通過2SMR分析,發(fā)現(xiàn)了GERD對OSA風(fēng)險(xiǎn)增加有因果關(guān)系,各項(xiàng)敏感性分析也加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性,同時(shí),還通過MVMR方法建立了7個(gè)模型進(jìn)行分析對可能存在的混雜因素(肥胖)進(jìn)行矯正,結(jié)果顯示GERD對OSA的因果關(guān)系仍穩(wěn)健。至OSA概念提出的這些時(shí)間里,其治療的新藥理論和實(shí)驗(yàn)研究引起了人們的廣泛關(guān)注[22]。通過2SMR分析,本文確定了抗反流藥物中的4個(gè)靶基因(BCHE、DRD2、GRM5、PTGER3),其高表達(dá)對OSA風(fēng)險(xiǎn)增加有因果效應(yīng),即抑制這4個(gè)靶基因的表達(dá)那在一定程度上有利于OSA的治療。值得注意的是,基于DrugBank數(shù)據(jù)庫中獲得的藥理作用,與4個(gè)靶點(diǎn)治療相關(guān)的GERD藥物,包括尼扎替丁、溴必利、ADX10059和米索前列醇是上述靶點(diǎn)的相應(yīng)抑制劑,這表明確定的靶點(diǎn)可能為了解所選抗反流藥物治療OSA作用提供有用的遺傳線索。其中ADX10059[23]一種選擇性mGluR5負(fù)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑,是近年來治療GERD的新興藥物,通過改善食管下括約肌短暫松弛(TLOSR)起到抑酸和抗反流的效果;溴必利[24]通過拮抗多巴胺能的中央D2受體從而減緩胃腸道蠕動(dòng),而米索前列醇[25]的靶點(diǎn)PTGER3和尼扎替丁[26-27]的靶點(diǎn)BCHE基因都能調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)釋放從而減少反流風(fēng)險(xiǎn),這些證據(jù)都指向抗反流療法是改善OSA的一個(gè)潛在方向[9]。如ING等[9]就曾使用“尼扎替丁”改善了OSA的夜間覺醒癥狀,有研究也提示非神經(jīng)元膽堿能系統(tǒng)的抑制在緩解OSA的相關(guān)癥狀中起到一定作用[28]。KEGG富集分析獲得了2條信號(hào)通路,分別是Neuroactive ligand-receptor interaction和Gap junction,其中Neuroactive ligand-receptor interaction通絡(luò)與嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān),而有研究指出OSA和GERD患者確實(shí)有存在著嗅覺障礙現(xiàn)象[29-30],目前暫未發(fā)現(xiàn)另外1條通路與GERD和OSA的關(guān)聯(lián),但結(jié)合此次研究,為2條通路的未來研究奠定更廣的研究方向。

本次2SMR結(jié)果揭示了GERD和OSA之間的因果關(guān)聯(lián),還通過MVMR在一定程度上消除了混雜因素給我們結(jié)果帶來的影響。此外,用于治療GERD藥物的4個(gè)靶點(diǎn)被確定為與OSA有因果關(guān)系,KEGG富集分析獲得了2個(gè)信號(hào)通絡(luò),這些均可能為新藥的研發(fā)及相關(guān)作用機(jī)制提供啟示。當(dāng)然,本研究也存在若干局限性。在2SMR分析中,通過在所涉及的研究中篩選歐洲血統(tǒng),雖然避免人口分層帶來的潛在偏差,但我們的發(fā)現(xiàn)可能不適用于其他種族。此外,由于代理藥物靶基因的SNP較少,縮小了閾值,且沒有進(jìn)行連鎖不平衡是這些分析的局限性。這些因素可能會(huì)干擾結(jié)論的穩(wěn)定性。