7種不同類型腫瘤組織內(nèi)胱抑素B表達(dá)的比較研究

敬昊東,馮莉,王朝莉,李麗,謝勇恩,胡為民,楊健,敬保遷

(川北醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與分子生物學(xué)研究室,四川 南充 637000)

人體內(nèi)許多重要功能分子通過調(diào)節(jié)表達(dá)方式來調(diào)控細(xì)胞增殖和分化,介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間,或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用等,維持機(jī)體不同組織正常發(fā)育分化,若表達(dá)失調(diào),可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移[1]。識(shí)別和深入研究不同種類癌癥組織間差異表達(dá)的功能分子或癌癥組織與相應(yīng)癌旁組織間差異表達(dá)的功能分子,不僅有利于闡釋相關(guān)癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,而且可尋找到相應(yīng)的干預(yù)或治療措施。

本課題組之前采用抑制性消減雜交技術(shù)從整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平比較食管鱗狀細(xì)胞癌組織與相應(yīng)癌旁粘膜組織間差異表達(dá)的基因,發(fā)現(xiàn)食管癌旁粘膜組織中組織蛋白酶抑制劑胱抑素B(cystatin B,CSTB)基因發(fā)生表達(dá),而食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CSTB基因則不發(fā)生表達(dá)[2]。由于CSTB在維持機(jī)體正常細(xì)胞的增殖、分化、及組織形成等中發(fā)揮重要作用,近年研究[3-4]表明:腫瘤內(nèi)CSTB表達(dá)失調(diào)嚴(yán)重影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,通過CSTB作用的添加或拮抗可發(fā)展腫瘤治療方法。但直至目前,仍未見同時(shí)觀察并比較人體內(nèi)不同類型腫瘤或體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)CSTB表達(dá)的實(shí)驗(yàn)報(bào)道,不能系統(tǒng)闡釋不同正常組織或腫瘤內(nèi)CSTB的表達(dá)特征,及評(píng)價(jià)人體內(nèi)各種不同類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展與CSTB表達(dá)變化間的關(guān)系。本研究擬觀察和比較不同癌癥組織、癌旁組織和癌細(xì)胞株內(nèi)CSTB的表達(dá)特征,為進(jìn)一步研究不同類型腫瘤治療和療效考核中CSTB的意義提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及組織

食管低分化鱗狀細(xì)胞癌、食管中分化鱗狀細(xì)胞癌、食管高分化鱗狀細(xì)胞癌、食管腺癌及相應(yīng)癌旁粘膜的手術(shù)切除組織系在患者及家屬知情同意下,由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科采集自食管癌患者。

實(shí)體癌及相應(yīng)癌旁組織石蠟樣本。其中15例食管鱗狀細(xì)胞癌與相應(yīng)癌旁組織,10例喉鱗狀細(xì)胞癌與相應(yīng)癌旁組織,22例胃腺癌與相應(yīng)癌旁組織,12例肺鱗狀細(xì)胞癌與相應(yīng)癌旁組織,20例肝細(xì)胞癌與相應(yīng)癌旁組織,12例結(jié)腸腺癌與相應(yīng)癌旁組織及17例膀胱移行細(xì)胞癌與相應(yīng)癌旁組織,均由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科提供。

食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株、胃腺癌SGC7901細(xì)胞株、肝癌Hep G2細(xì)胞株及肺鱗狀細(xì)胞癌YTLMC-90細(xì)胞株系本研究室保存。

1.2 試劑

抗CSTB單克隆抗體與抗β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司),羊抗鼠IgG抗體及NBT/BCIP(美國Promega公司),蛋白質(zhì)定量試劑盒(美國Bio Rad公司),SABC法免疫組化染色試劑盒(福建邁新公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株、胃腺癌SGC7901細(xì)胞株、肺鱗狀細(xì)胞癌YTLMC-90細(xì)胞株及肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株以含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL)及10%小牛血清的RPMI 1640復(fù)合培養(yǎng)液在37 ℃,5% CO2,飽和濕度下擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 Western blot

將收集的食管癌患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁粘膜組織,分別以蛋白質(zhì)裂解液[8 mol/L尿素、4% CHAPS、40 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、65 mmol/L二硫蘇糖醇和10 mmol/L苯甲磺酰氟(PMSF)]室溫下裂解,并用蛋白質(zhì)定量試劑盒,參照使用說明測(cè)定各樣品蛋白質(zhì)濃度。然后,取等量的不同類型食管癌病人癌組織與癌旁粘膜組織蛋白質(zhì),進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移方法將凝膠中蛋白質(zhì)原位轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上,3%脫脂奶粉封閉1 h后,分別以抗CSTB單克隆抗體、抗β-actin單克隆抗體為一抗(工作濃度為1∶1 000),堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗(工作濃度為1∶5 000)進(jìn)行識(shí)別,NBT/BCIP為底物進(jìn)行顯色。各免疫識(shí)別均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。免疫識(shí)別圖像用PDQuest1.0計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行編輯后,比較不同類型及分化程度的食管癌病人間、食管癌患者癌組織與相應(yīng)癌旁粘膜組織間CSTB表達(dá)的變化。

1.5 免疫組化法

參考免疫組化染色試劑盒的使用說明,取的各癌組織及相應(yīng)癌旁組織石蠟切片,在家用高壓鍋內(nèi)以Tris-EDTA 緩沖液(10 mM 三羥甲基氨基甲烷,1 mmol/L EDTA 溶液,0.05% Tween 20,pH 9.0)熱誘導(dǎo)抗原表位修復(fù)3 min;體外培養(yǎng)癌細(xì)胞株制成細(xì)胞爬片。將上述處理后的標(biāo)本片置于37 ℃的濕盒中,以10%小牛血清封閉30 min后,滴加抗CSTB單克隆抗體(工作濃度為1∶500),于4 ℃過夜,PBS洗洗滌(3 min×3),滴加生物素化羊抗鼠IgG,于37 ℃作用15 min,再用PBS洗滌(5 min×3)。各標(biāo)本片分別滴加SABC試劑與DAB顯色試劑,室溫顯色后,蒸餾水洗滌,再經(jīng)鐵蘇木素輕度復(fù)染后,脫水,透明,封片。各標(biāo)本的免疫識(shí)別均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果由專業(yè)臨床病理診斷醫(yī)師對(duì)各免疫識(shí)別標(biāo)本片進(jìn)行判讀,比較不同類型實(shí)體癌病人的癌組織與相應(yīng)癌旁粘膜組織間,及體內(nèi)癌組織與體外培養(yǎng)的相應(yīng)癌細(xì)胞株間CSTB表達(dá)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示,組間比較采用Fisher確切概率法檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織與癌旁粘膜組織內(nèi)CSTB的表達(dá)

與β-actin對(duì)照比較,食管低分化鱗狀細(xì)胞癌組織、中分化鱗狀細(xì)胞癌組織及高分化鱗狀細(xì)胞癌組織均不表達(dá)CSTB,但相應(yīng)癌旁粘膜組織則表達(dá)CSTB,而食管腺癌組織及其癌旁粘膜組織均不表達(dá)CSTB。見圖1。

2.2 不同類型實(shí)體癌組織及癌旁組織內(nèi)CSTB的表達(dá)與分布

所有食管鱗狀細(xì)胞癌、喉鱗狀細(xì)胞癌及胃腺癌患者的癌旁粘膜組織均高表達(dá)CSTB。在喉粘膜和食管粘膜中,僅表面角化層及緊鄰的多邊形細(xì)胞大量表達(dá)CSTB,而基底層細(xì)胞及鄰近的多邊形細(xì)胞則不表達(dá)(圖2A,圖2C)。胃腺癌的癌旁胃粘膜中,僅胃底腺細(xì)胞大量表達(dá)CSTB(圖2E),而表層單層柱狀上皮細(xì)胞不表達(dá)CSTB。另外,在95%肝細(xì)胞癌患者的癌旁組織中,CSTB呈灶性表達(dá)(圖2I),這些區(qū)域內(nèi)存在炎性細(xì)胞浸潤,在無炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域的肝組織則不表達(dá)CSTB。而肺鱗狀細(xì)胞癌旁肺組織、結(jié)腸腺癌旁結(jié)腸粘膜及膀胱移行細(xì)胞癌旁粘膜組織不表達(dá)或低表達(dá)CSTB(圖2G,圖2K,圖2M)。

比較不同類型實(shí)體癌患者癌旁組織組織與癌組織內(nèi)CSTB的表達(dá)率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同類型實(shí)體癌組織內(nèi)CSTB的表達(dá)率呈多樣性變化(表1)。(1)食管鱗狀細(xì)胞癌和喉鱗狀細(xì)胞癌組織表達(dá)CSTB發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.05)。僅40%食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織表達(dá)CSTB(圖2B)。同樣,僅40%喉鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織表達(dá)CSTB(圖2D)。(2)胃腺癌表達(dá)CSTB發(fā)生顯著下調(diào)(P<0.05)。僅50%胃腺癌患者的癌組織中有殘存胃底腺細(xì)胞表達(dá)CSTB(圖2F)。(3)肺鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸腺癌和膀胱移行細(xì)胞癌表達(dá)CSTB發(fā)生顯著上調(diào)(P<0.05)。有50%肺鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織表達(dá)CSTB,41.7%結(jié)腸腺癌患者的癌組織表達(dá)CSTB,及64.7%膀胱移行細(xì)胞癌患者的癌組織表達(dá)CSTB(圖2H,圖2L,圖2N)。(4)90%肝細(xì)胞癌患者的癌組織表達(dá)CSTB(圖2J),而相應(yīng)患者癌旁組織亦表達(dá)CSTB,兩者間的表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 Cystatin B在不同腫瘤組織內(nèi)的表達(dá)[n(%)]

2.3 不同類型體外培養(yǎng)癌細(xì)胞內(nèi)CSTB的表達(dá)

不同種類的體外培養(yǎng)癌細(xì)胞株經(jīng)抗CSTB單克隆抗體免疫組化染色和鐵蘇木素復(fù)染,結(jié)果顯示食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株、肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株YTLMC-90及肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株均大量表達(dá)CSTB(圖3A,圖3B,圖3D),而胃腺癌SGC7901細(xì)胞株則低表達(dá)CSTB(圖3C)。

3 討論

人體內(nèi)組織蛋白酶抑制劑通過對(duì)組織蛋白酶的抑制,密切影響機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)降解、免疫等系列生理過程,對(duì)維護(hù)機(jī)體健康和生命至關(guān)重要。若組織蛋白酶抑制劑表達(dá)失調(diào)不僅影響機(jī)體正常生長發(fā)育,而且參與風(fēng)濕病、腫瘤及壞死性炎癥等的發(fā)生發(fā)展[5]。組織蛋白酶抑制劑家族中的CSTB可抑制木瓜蛋白酶、組織蛋白酶B,H,L,S的生物活性。本研究發(fā)現(xiàn),在多種組織中,CSTB廣泛地分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞核,及分泌到細(xì)胞外,預(yù)示它的作用不僅發(fā)生在細(xì)胞內(nèi),也可發(fā)生在細(xì)胞外。在細(xì)胞漿中,CSTB通過增強(qiáng)線粒體膜穩(wěn)定性,避免蛋白酶泄漏[6],減少氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制凋亡、鐵死亡[7];減少炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[8],炎性小體形成,抑制焦亡發(fā)生[9-10];增強(qiáng)細(xì)胞自噬功能,清除錯(cuò)誤蛋白[11-12],維護(hù)細(xì)胞的正常生命代謝活性。在細(xì)胞核中,CSTB 通過抑制組織蛋白酶對(duì)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子CUX1等的降解,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞壽命[13-14]。在細(xì)胞外,CSTB可抑制相關(guān)組織蛋白酶對(duì)細(xì)胞間質(zhì)中彈力蛋白等的降解[3],有利于細(xì)胞增殖、組織形成。說明CSTB從多個(gè)方面影響人細(xì)胞的生物學(xué)行為[15]。

本研究證實(shí),在成人階段,CSTB的表達(dá)具有組織特異性。正常成人喉、食道中上段粘膜及胃底腺可表達(dá)CSTB,其它如結(jié)腸粘膜、膀胱粘膜、肝及肺組織中低表達(dá)或不表達(dá)。說明CSTB屬人體正常分化表達(dá)蛋白,在不同性質(zhì)的正常細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)存在差異。并且,先前R?s?nen等[16]發(fā)現(xiàn)在人胚胎粘膜組織發(fā)育過程中,第9周時(shí)鱗狀上皮細(xì)胞層內(nèi)基底細(xì)胞等開始表達(dá)CSTB,16周時(shí)達(dá)到最高水平,并一直存在于成熟的胎兒、嬰兒和成人鱗狀上皮組織內(nèi)。而在皮膚發(fā)育過程中,11周時(shí)開始表達(dá)CSTB,17周以上時(shí)表達(dá)減少,超過26周時(shí)皮膚內(nèi)完全消失。Lu等[17]證實(shí)在雌激素誘導(dǎo)的子宮蛻膜化過程中,當(dāng)成纖維細(xì)胞分化為成熟的蛻膜上皮細(xì)胞后開始表達(dá)CSTB,并刺激血管生成,Abdulkhalikova等[18]研究證實(shí)肥胖婦女減肥后可引起子宮內(nèi)膜退化,CSTB表達(dá)增高,本研究亦證實(shí)在成人食管和喉粘膜中僅分化中晚期細(xì)胞表達(dá)CSTB。說明在機(jī)體相關(guān)組織或細(xì)胞中CSTB的表達(dá)受分化發(fā)育壓力的調(diào)節(jié)。本研究證實(shí)癌旁肝組織中,存在炎癥促進(jìn)CSTB表達(dá)現(xiàn)象。同時(shí),發(fā)現(xiàn)人食管鱗狀細(xì)胞癌組織等不表達(dá)或低表達(dá)CSTB,但體外人工培養(yǎng)的食管鱗狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞株等則大量表達(dá)CSTB,預(yù)示特定腫瘤細(xì)胞內(nèi)CSTB的表達(dá)受炎癥或營養(yǎng)等因素影響會(huì)發(fā)生變化。致體外培養(yǎng)的相關(guān)癌細(xì)胞株與患者體內(nèi)癌細(xì)胞的生物學(xué)行為有可能不一致,相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以反映體內(nèi)真實(shí)情況。

本研究證實(shí)人體實(shí)體癌組織表達(dá)CSTB存在失調(diào)現(xiàn)象。癌喉鱗狀細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌及胃腺癌組織CSTB的表達(dá)顯著下調(diào),預(yù)示相關(guān)癌細(xì)胞發(fā)生在分化發(fā)育早期,腫瘤微環(huán)境中的相關(guān)組織蛋白酶缺乏CSTB抑制,相關(guān)細(xì)胞分裂速度較快[19],易向周邊侵襲,并經(jīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[20-21],部分癌組織表達(dá)CSTB,可能與局部炎癥,或細(xì)胞密度過大,營養(yǎng)匱乏致相關(guān)癌細(xì)胞衰退有關(guān);胃腺癌旁粘膜固有層中胃底腺細(xì)胞可大量表達(dá)CSTB,胃癌組織中隨胃底腺細(xì)胞減少,致胃癌組織表達(dá)CSTB下調(diào),體外培養(yǎng)的相關(guān)胃癌細(xì)胞株也僅表達(dá)的低水平的CSTB,說明胃腺癌主要發(fā)生在胃底腺細(xì)胞未成熟階段;肺鱗狀細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌及結(jié)腸腺癌組織CSTB的表達(dá)顯著上調(diào),可能與癌組織局部炎癥等有關(guān);肝癌旁炎性灶、肝癌組織及體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株均高表達(dá)CSTB,可能與炎癥相關(guān)。由于CSTB為多功能分子,既具有抗炎作用,但又可增強(qiáng)癌細(xì)胞活性和壽命[22],促進(jìn)組織血管生成[17],預(yù)示可增強(qiáng)相關(guān)癌細(xì)胞耐藥性[23]。若通過CSTB作用的添加或拮抗方式來研發(fā)相關(guān)腫瘤治療方法,必須依據(jù)特定腫瘤CSTB的表達(dá)特征、對(duì)相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體影響等進(jìn)行綜合考慮。