LC-MS/MS法同時測定血漿中氟馬替尼及其代謝產(chǎn)物濃度

徐月華,錢洲逸,趙楊,黃瓊?cè)~,孫魯寧,王永慶,孫志明,唐雯雯

(1.海安市人民醫(yī)院藥劑科,海安 226600;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,南京 210029;3.國家衛(wèi)生健康委計劃生育藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心/江蘇省衛(wèi)生健康發(fā)展研究中心,南京 210029)

慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogeneous leukemia,CML)主要發(fā)病機制為特定染色體易位(染色體9,22)形成費城染色體,導(dǎo)致BCR-ABL融合基因激活并表達(dá)BCR-ABL蛋白[1-2]。國內(nèi)目前大多數(shù)CML患者選擇伊馬替尼作為一線治療藥物,并取得較好療效[3]。氟馬替尼(HH-GV678)是伊馬替尼的結(jié)構(gòu)類似物且在伊馬替尼的基礎(chǔ)上優(yōu)化了結(jié)構(gòu),已被證明作為BCR-ABL抑制劑的效力略高于伊馬替尼[4-5],并且氟馬替尼能有效地克服某些KIT突變導(dǎo)致的耐藥性[6]。與此同時,相比于伊馬替尼組,腹瀉和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高等非血液學(xué)不良反應(yīng)在氟馬替尼組更常見[5,7]。

氟馬替尼在血漿中主要以原形藥物形式存在,此外存在的主要代謝物形式為 N-去甲基化代謝物M1和酰胺鍵水解代謝物M3,代謝物M1的穩(wěn)態(tài)血漿暴露量約為原形藥物的20%且氟馬替尼代謝物M1與氟馬替尼具有相似的藥理活性[8],代謝物M3的穩(wěn)態(tài)血漿暴露量約為原形藥物的10%。一項對甲磺酸氟馬替尼劑量相關(guān)性藥動學(xué)研究表明氟馬替尼的暴露量大約以劑量比例的方式增加[9]。其次氟馬替尼的血漿暴露受到飲食習(xí)慣的影響[10]。為了充分研究其藥代動力學(xué)藥效學(xué)以便于優(yōu)化治療藥物方案,同時測定、患者血漿中氟馬替尼、M1和M3的濃度是必要的。本研究建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)同時測定CML患者血漿中氟馬替尼、M1和M3的方法。

1 儀器與試劑

1.1主要儀器與設(shè)備 1290 Infinity高效液相色譜儀,包括:柱溫箱(G1316C)、多孔板自動進(jìn)樣器(G4226A)和二元高壓泵(G4220A)(安捷倫科技有限公司);API 4000(美國應(yīng)用生物公司);色譜工作站:Analyst?軟件:1.6.3版本(美國應(yīng)用生物公司);BP 211D型電子天平(德國賽多利斯公司,感量:0.01 mg);PCB-11型渦旋混合儀(德國艾本德公司);STRATOS高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技公司);Milli-Q Gradient純水儀(Millipore中國有限公司)。

1.2主要材料與試劑 氟馬替尼(批號:505489RS-210501,純度:95.3%,Toronto Research Chemicals公司),N-去甲基氟馬替尼(M1)(批號:20210417,純度:98%,豪森藥業(yè)),氟馬替尼酰胺水解產(chǎn)物(M3)(批號:20210330,純度:100%,豪森藥業(yè)),伊馬替尼-d8(批號:2-AJK-132-1,純度:98.7%,Toronto Research Chemicals公司),甲醇和乙腈(色譜純,默克化工技術(shù)有限公司),甲酸(色譜純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),甲酸銨(分析純,國藥化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm),柱溫設(shè)為38 ℃,流動相:10 mmol·L-1甲酸銨(含0.1%甲酸)(A)-乙腈(B),梯度洗脫,流速為0.5 mL·min-1,洗脫時間為6 min。洗脫程序為0 min:77% A;0～3.2 min:77%A;3.2～3.4 min:77%A→5%A;3.4～4.4 min:5%A;4.4～4.6 min:5%A→77%A;4.6～6 min:77%A。進(jìn)樣量為5 μL。

2.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI),在正離子模式條件下,應(yīng)用多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式對氟馬替尼及其代謝物進(jìn)行定量分析,氟馬替尼,M1,M3和伊馬替尼-d8的保留時間分別為:2.30,2.20,0.56,2.10 min。其離子對、去簇電壓、碰撞能量、碰撞室入口電壓、碰撞室出口電壓見表1。

表1 氟馬替尼及其代謝產(chǎn)物的定性離子對和碰撞電壓Tab.1 Qualitative ion pair and collision voltage of flumatinib and its metabolites

2.3溶液制備

2.3.1對照品儲備液 精密稱取10.49 mg(經(jīng)純度校正為10.00 mg)的氟馬替尼置于10 mL量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,充分混合均勻,得到氟馬替尼濃度為1.00 mg·mL-1的儲備液,精密稱取10.20 mg(經(jīng)純度校正為10.00 mg)的M1,置于10 mL量瓶中,用乙腈-二甲基亞砜(4：1,V/V)溶解并定容,充分混合均勻,得到M1濃度為1.00 mg·mL-1的儲備液。精密稱取10.00 mg(經(jīng)純度校正為10.00 mg)的M3置于10 mL容量瓶中,用乙腈-二甲亞砜(1：1,V/V)溶解并定容至刻度,充分混合均勻,得到M3濃度為1.00 mg·mL-1的儲備液。標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控用儲備液分別配制。用甲醇將對照物質(zhì)瓶中的0.5 mg伊馬替尼-d8(內(nèi)標(biāo))充分溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,用甲醇多次洗滌對照物質(zhì)瓶,將洗滌液轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中,并定容,搖勻,配制成濃度為50 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液。上述儲備液均置于-40 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控工作液的配制 精密吸取氟馬替尼、M1和M3對照品儲備液,以DMSO稀釋,配制氟馬替尼及其代謝物質(zhì)濃度均為0.008,0.016,0.040,0.160,0.400,1.60,4.00,7.20,8.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。按上述方法配制氟馬替尼及其代謝物濃度均為0.020,0.200,2.00,6.40 μg·mL-1的質(zhì)控工作液。上述工作液均置于-40 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密吸取20 μL質(zhì)量濃度為50.0 μg·mL-1的伊馬替尼-d8(內(nèi)標(biāo))溶液和100 μL氨水于100 mL容量瓶中,用乙腈稀釋并定容至刻度,即得10.0 ng·mL-1的含內(nèi)標(biāo)和0.1%氨水的乙腈溶液,置于4 ℃冰箱備用。

2.4血漿樣本預(yù)處理 精密吸取血漿樣本50 μL于1.5 mL EP管中,加入200 μL含內(nèi)標(biāo)和0.1%氨水的乙腈溶液,渦旋10 min,于4℃ 16 000 r·min-1離心15 min,離心半徑為7 cm,取盡上清旋干約1 h,用150 μL 23%ACN復(fù)溶,渦旋10 min,離心10 min,取上清120 μL于自動進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行LC-MS/MS分析,進(jìn)樣量為5 μL。

2.5方法學(xué)確證

2.5.1特異性 精密吸取6個來源的人空白血漿樣本50 μL,分別加入200 μL乙腈,按“2.4節(jié)”項下方法處理后進(jìn)樣,通過比較空白血漿樣本中干擾物質(zhì)的峰面積與定量下限樣本中的氟馬替尼及其代謝物和內(nèi)標(biāo)的峰面積來評價方法的特異性?？瞻籽獫{樣本及空白血漿加氟馬替尼及其代謝產(chǎn)物(濃度均為0.400 ng·mL-1)、內(nèi)標(biāo)樣本色譜圖以及人樣中待測物色譜圖如圖1所示。結(jié)果表明,血漿樣本中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾化合物和內(nèi)標(biāo)的測定。

①空白血漿樣本;②定量下限血漿樣本;③氟馬替尼血漿樣本圖1 氟馬替尼和氟馬替尼-M1及氟馬替尼-M3在血漿中的色譜圖 ①blank plasma samples;②plasma samples of lower limit of quantification;③flumatinib plasma samplesFig.1 Chromatograms of flumatinib,flumatinib-M1 and flumatinib-M3 in plasma

2.5.2線性關(guān)系考察 精密吸取空白血漿50 μL,加入含待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液2.5 μL,渦旋混勻后,配制成氟馬替尼及其代謝物濃度均為0.400、0.800、2.00、8.00、20.0、80.0、120、200、360、400 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣本。同法用配制得含氟馬替尼及其代謝物濃度均為1.00、10.0、100、320 ng·mL-1的質(zhì)控樣本。按“2.4節(jié)”下方法處理后進(jìn)樣。以待測化合物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo),待測化合物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性擬合,加權(quán)因子為(1/X2),各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。結(jié)果表明,各化合物的線性相關(guān)系數(shù)r均>0.99,血漿中3個化合物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍Tab.2 Linear equations,correlation coefficients and linear ranges

2.5.3準(zhǔn)確度與精密度 考察定量下限、低、中、次高和高5個濃度血漿質(zhì)控樣本精密度和準(zhǔn)確度。定量下限及各個濃度的質(zhì)控樣本平行制備5份,按“2.4節(jié)”下方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析。日內(nèi)精密度以不同濃度血漿樣本同日內(nèi)重復(fù)測定5次計算,日間精密度以不同濃度血漿樣品3 d內(nèi)重復(fù)測定3次計算,結(jié)果見表3。定量下限的批內(nèi)與批間精密度均<20%,低、中、次高、高濃度質(zhì)控樣本的批內(nèi)與批間精密度均小于15%,準(zhǔn)確度在87.0%～111.6%。結(jié)果表明方法精密度與準(zhǔn)確度良好。

表3 氟馬替尼及其代謝物化合物的準(zhǔn)確度與精密度Tab.3 Accuracy and precision of the flumatinib and its metabolites

2.5.4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 考察低、高質(zhì)控濃度的基質(zhì)效應(yīng)和低、中、次高、高濃度的提取回收率。取6個來自不同個體的空白血漿基質(zhì),加入低、中、次高、高濃度質(zhì)控工作液,按“2.4節(jié)”下處理后進(jìn)樣得到峰面積A1;另上述來源的空白血漿基質(zhì)加乙腈沉淀處理后加相應(yīng)質(zhì)控工作液及內(nèi)標(biāo)配制低、中、次高、高濃度的溶液,得到峰面積A2;用純水代替空白血漿基質(zhì),配制低、中、次高、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后進(jìn)樣,得峰面積A3。基質(zhì)因子=A2/A3×100%,提取回收率=A1/A2×100%。氟馬替尼及其代謝物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子為歸一化的基質(zhì)因子。氟馬替尼及其代謝的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果見表4。結(jié)果表明,該方法無基質(zhì)效應(yīng)且回收率較高。

表4 氟馬替尼及其代謝物基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率Tab.4 Matrix effect and recovery of flumatinib and its metabolites

2.5.5殘留效應(yīng) 本實驗進(jìn)一步考察了進(jìn)樣高濃度樣品后的殘留問題,計算進(jìn)樣高濃度點后的殘留峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點峰面積的比值。結(jié)果表明氟馬替尼及其代謝物的殘留均小于20%,殘留分析物不影響檢測的準(zhǔn)確性和精密度。

2.5.6穩(wěn)定性 分別制備低、高濃度的4組血漿樣品,室溫放置10 h、進(jìn)樣器72 h、長期凍存(-40 ℃和-80 ℃凍存166天)和反復(fù)凍融3次(-40 ℃和-80 ℃)條件下,按“2.4節(jié)”下方法進(jìn)行測定以考察穩(wěn)定性。穩(wěn)定性結(jié)果見表5。結(jié)果表明,氟馬替尼及其代謝物低、高濃度血漿質(zhì)控樣品在室溫放置20 h、進(jìn)樣器放置72 h、3次凍融循環(huán)和-40 ℃和-80 ℃凍存166 d具有良好的穩(wěn)定性。

表5 氟馬替尼及其代謝物穩(wěn)定性Tab.5 Stability of flumatinib and its metabolites

2.6方法應(yīng)用 用上述建立的方法檢測本院使用氟馬替尼的CML患者穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣本。本次研究收集了本院一位非首次空腹口服甲磺酸氟馬替尼片600 mg的患者服藥時和服藥后1.5、2、2.5、3、3.5 h的血漿樣本,血樣采集于含有乙二胺四醋酸抗凝管中并于-80 ℃中保存。測定的氟馬替尼及其兩種主要代謝物血藥濃度如圖2所示,根據(jù)所測結(jié)果表明 M1,M3在達(dá)峰時間2 h內(nèi)表現(xiàn)出不明顯的上升趨勢,氟馬替尼及其代謝物血藥濃度范圍內(nèi)與其他藥動學(xué)相關(guān)研究結(jié)果[9]一致。該患者在服藥期間并沒有出現(xiàn)非血液學(xué)不良反應(yīng)如腹瀉惡心等。如果需要去確定氟馬替尼的血藥濃度范圍,則需要更多的有效性和安全性數(shù)據(jù)。

圖2 1例CML患者氟馬替尼及其代謝物血藥濃度-時間曲線Fig.2 Blood concentration-time curves of flumatinib and its metabolites in a patient with chronic myelogeneous leukaemia

3 討論

與YANG等[11]報道的中測定血漿中氟馬替尼及其代謝物的方法相比,本方法采用梯度洗脫的方式在化合物出峰后用高有機相比例沖洗色譜柱1 min,使得基線更低,有利于減少基質(zhì)效應(yīng),增強方法的重復(fù)性。本研究從質(zhì)譜條件、色譜條件及血漿樣品處理方法對氟馬替尼及其代謝物的同時測定方法進(jìn)行優(yōu)化。采用ESI離子源,在正離子模式下,氟馬替尼以m/z563.2→m/z370.0、M1以m/z549.1→m/z463.1、M3以m/z303.1→m/z203.1為定量離子對時響應(yīng)值最高,伊馬替尼-d8與氟馬替尼及其代謝物在同一梯度出峰,。色譜條件以乙腈-10 mmol·L-1甲酸銨(含0.1%甲酸)為流動相,氟馬替尼及其代謝物響應(yīng)較好,峰型較優(yōu)。前處理采用簡單的蛋白沉淀法,方便,快捷,成本低,更適用于治療藥物監(jiān)測,因此,本研究選擇乙腈為蛋白沉淀劑?？疾焯崛』厥章蕰r,結(jié)果顯示,氟馬替尼代謝物M1的回收率約30%,在沉淀劑中加入0.1%氨水后,再次考察回收率,氟馬替尼及其代謝的回收率都接近100%。

本文所建立的血漿中氟馬替尼及其兩種主要代謝物的LC-MS/MS分析方法,操作便捷,檢測限低,準(zhǔn)確性好,能夠準(zhǔn)確定量血漿樣本中氟馬替尼及其兩種主要代謝物的濃度,適用于臨床治療藥物監(jiān)測。