基于斑馬魚模型的鹿膠益氣補(bǔ)血相關(guān)功效研究*

劉雨彤,黃勇,毛洪運(yùn),張童,崔杰,李夢(mèng)雨,候蓉,鄭云楓,華永慶,4

(1.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210023;3.貴州廣濟(jì)堂健康藥業(yè)有限公司,貴陽(yáng) 550000;4.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023)

鹿膠為鹿科動(dòng)物馬鹿C.elaphus及梅花鹿C.nippon的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。鹿膠作為補(bǔ)益藥使用已有千年歷史,早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就稱之為上品?！侗静菥V目》中記載鹿 皮“補(bǔ)氣;澀精;斂瘡”?！端拇ㄖ兴幹尽分杏涊d鹿皮“能補(bǔ)氣,澀虛滑。治婦女白帶,血崩不止,腎虛滑精;涂一切瘡”?！侗本┦兄兴幣谥埔?guī)范》中描述“鹿皮膠味咸,性溫,歸肝、腎經(jīng),補(bǔ)氣,澀虛精,強(qiáng)筋健骨”?！顿F州省中藥、民族藥飲片標(biāo)準(zhǔn)》中敘述“鹿皮膠性偏于溫,既能補(bǔ)陽(yáng),又可滋陰補(bǔ)血、止血,同樣適用于血虛證、出血證”。

鹿皮在歷史記載中皆為上等之品,其資源有限,使得其逐漸退出熬膠主流原料的舞臺(tái)[1]。近年來(lái)隨著鹿養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展[2],鹿皮、鹿角、鹿血等多種鹿制品重新走入大眾視野?；趥鹘y(tǒng)用法,鹿膠的應(yīng)用最為廣泛。研究表明,鹿膠可改善多種血虛動(dòng)物模型的血虛癥狀[3-4]。目前對(duì)于采用驢皮熬制的阿膠的研究較為豐富,提高免疫力、補(bǔ)血止血和抗疲勞[5]、抗衰老[6]等作用被普遍認(rèn)可。而傳統(tǒng)認(rèn)為更為名貴的膠類中藥鹿膠,其是否具有類似的補(bǔ)益作用,以及是否更具特點(diǎn)仍缺乏研究支撐。

斑馬魚自20世紀(jì)90年代引入我國(guó)實(shí)驗(yàn)室,現(xiàn)已成為研究中藥整體功效的新興模式生物之一。斑馬魚具有個(gè)體小、易飼養(yǎng)、生殖能力強(qiáng)等特點(diǎn),與人類基因的相似度可達(dá)70%[7],且斑馬魚的血液、骨骼等系統(tǒng)及生理功能方面與人體存在眾多共同特點(diǎn)。基于斑馬魚造模方便、易于觀察等特點(diǎn),本研究采用斑馬魚疾病模型對(duì)鹿皮膠的補(bǔ)血、抗骨質(zhì)疏松和抗衰老作用進(jìn)行探索,為鹿膠的應(yīng)用提供支撐。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3個(gè)月齡斑馬魚AB品系,購(gòu)自于南京堯順禹生物技術(shù)有限公司。斑馬魚飼養(yǎng)條件:晝夜節(jié)律為晝：夜=14 h：10 h;溫度(28±0.5)℃。飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格按照《江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)用斑馬魚飼育技術(shù)條件》。實(shí)驗(yàn)流程嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用指南》執(zhí)行。斑馬魚適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后可以交配產(chǎn)卵,產(chǎn)卵當(dāng)天收集斑馬魚受精卵。

1.1.2儀器與試劑 鹿膠,批號(hào):2018103,購(gòu)自貴州廣濟(jì)堂藥業(yè)有限公司;阿膠,批號(hào):1510012,購(gòu)自山東東阿阿膠股份有限公司;草甘膦(glyphosate,Gly),批號(hào):20200317B,購(gòu)自山東三農(nóng)生物科技有限公司;Bcl-2抗體,貨號(hào):ab32124,購(gòu)自Abcam公司;GAPDH,貨號(hào):10494-1-P,購(gòu)自美國(guó)proteiontech;動(dòng)物基因組DNA快速抽提試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,貨號(hào):D0065S、P0015L,購(gòu)自上海碧云天生物有限公司;中性樹脂,批號(hào):70120150,Biosharp;鏈霉蛋白酶E,批號(hào):721J041,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;二甲亞砜(dinethylsulfoxide,DMSO),批號(hào):C12804515,購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;潑尼松龍(prednisolone,Pred)、鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、吖啶橙、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、鈣黃綠素,批號(hào):T20J7H9291、S51140、R20290、A12D11H134386、K22A9C68341,均購(gòu)自上海源葉生物有限公司;RNA isolater Tolal RNA Extraction Reagent、HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、AceQ?qPCR SYBR Green Master Mix,貨號(hào):R401-01-AA、R223-01、Q111-02,均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

斑馬魚循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(型號(hào):ZF-104),南京一樹梨花生物科技有限公司;人工氣候培養(yǎng)箱(型號(hào):RGL-P160B),合肥達(dá)斯卡特生物科技有限公司;體視熒光顯微鏡(型號(hào):M205FA),德國(guó)Leica公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào):QuantStudio 6 Flex),Applied Biosystems;多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):Synergy2),Bio-Tek;臺(tái)式冷凍離心機(jī)(型號(hào):54178),eppendorf公司;電泳儀(型號(hào):mini-protean powerpack basic)、數(shù)字化凝膠成像工作站(型號(hào):ChemiDocTMXRS+),美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組及給藥 Gly誘導(dǎo)斑馬魚紅細(xì)胞異常實(shí)驗(yàn)使用3月齡成魚,分為6組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(100 μmol·L-1Gly)、阿膠組(0.1 mg·mL-1)和鹿膠小、中、大劑量組(0.05、0.1、0.2 mg·mL-1),每組10尾。實(shí)驗(yàn)前2 d停止喂食,模型對(duì)照組予以模擬海水配置的100 μmol·L-1Gly溶液,各藥物組在予以Gly造模的同時(shí)給與藥物,給藥48 h。

MTX誘導(dǎo)斑馬魚幼魚造血異常實(shí)驗(yàn)使用2 dpf斑馬魚,組別設(shè)置與Gly實(shí)驗(yàn)相同,模型對(duì)照組給予600 μg·mL-1MTX,每組20尾,給藥組在給予模型藥的同時(shí)給予對(duì)應(yīng)濃度的藥物,給藥24 h。

Pred誘導(dǎo)斑馬魚骨形成抑制實(shí)驗(yàn)使用健康的3 dpf斑馬魚,分為6組:空白對(duì)照組(0.2%DMSO)、模型對(duì)照組(25 μmol·L-1Pred)、阿膠組(0.04 mg·mL-1)、鹿膠小、中、大劑量組(0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),置于6孔板中,每孔給予3 mL培養(yǎng)基。從3 dpf開始,空白對(duì)照組換為含有0.2%DMSO的胚胎培養(yǎng)基,模型對(duì)照組及其他給藥組換為含0.2%DMSO的25 μmol·L-1Pred的胚胎培養(yǎng)基。從5 dpf開始給藥,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組繼續(xù)給予對(duì)應(yīng)的胚胎培養(yǎng)基不變,各給藥組在給予模型藥的同時(shí)給予對(duì)應(yīng)濃度的藥物。每天半數(shù)換液,連續(xù)給藥4 d。

DBP誘導(dǎo)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)選取健康的30 hpf斑馬魚胚胎,隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(10 μmol·L-1DBP)、阿膠組(0.5 mg·mL-1)、鹿膠小、中、大劑量組(0.02、0.1、0.5 mg·mL-1),每組20尾。模型對(duì)照組給予10 μmol·L-1DBP,各給藥組在給予DBP的基礎(chǔ)上分別給予對(duì)應(yīng)濃度的藥物,置于6孔板中,體系3 mL,培養(yǎng)18 h。

1.2.2姬姆薩染色實(shí)驗(yàn) 斑馬魚成魚經(jīng)給藥后,麻醉斷尾取血。斑馬魚尾鰭向前約1/6處剪斷,將血迅速在玻片上推開,甲醇固定5 min。固定結(jié)束后,傾去甲醇,姬姆薩染色15 min,三蒸水沖洗30 s。載玻片自然風(fēng)干后,中性樹脂封片,顯微鏡下觀察斑馬魚紅細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3鈣黃綠素染色實(shí)驗(yàn) 將9 dpf的斑馬魚置于培養(yǎng)基中靜置1 h,0.2%鈣黃綠素(pH值=7)溶液避光孵育1 h,培養(yǎng)基漂洗3次,再次靜置1 h。用0.04 g·L-1三卡因?qū)Π唏R魚進(jìn)行麻醉,于體視熒光顯微鏡下成像。

1.2.4吖啶橙染色實(shí)驗(yàn) 給藥18 h后,吸盡胚胎培養(yǎng)基,加入0.5 g·L-1鏈酶蛋白酶E溶液置于人工氣候箱中脫膜15 min。當(dāng)觀察到胚胎多數(shù)已脫去其卵膜時(shí),加入胚胎培養(yǎng)液終止脫膜。漂洗2次,吸盡胚胎培養(yǎng)液,給予5 mg·L-1的AO染色溶液避光染色1 h。染色結(jié)束后漂洗3次,用0.04 g·L-1MS-222麻醉胚胎5 min,吸取幼魚置于載玻片中央,于體視熒光顯微鏡下觀察凋亡眼部細(xì)胞并攝相。

1.2.5qRT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 使用Trizol提取RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。按照試劑盒說(shuō)明書,構(gòu)成20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH作為內(nèi)參,按照2-相對(duì)定量計(jì)算公式得到相對(duì)定量結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6Western blotging檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 給藥18 h后,脫膜并提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,加入SDS-PAGE上樣緩沖液變性。使用10%PAGE膠電泳分離蛋白,分離后的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5%BSA封閉1 h,加入Bcl-2和GAPDH抗體孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光法顯影成像。

1.2.7圖片采集及數(shù)據(jù)處理 Gly實(shí)驗(yàn)采用明美軟件進(jìn)行圖片采集,鈣黃綠素染色實(shí)驗(yàn)和吖啶橙染色實(shí)驗(yàn)采用徠卡顯微鏡成像軟件進(jìn)行采集圖像。利用Image Pro Plus軟件對(duì)圖片進(jìn)行處理并獲取數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1鹿膠對(duì)Gly誘導(dǎo)的斑馬魚紅細(xì)胞損傷模型的影響 姬姆薩染色實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)Gly處理后紅細(xì)胞出現(xiàn)微核、細(xì)胞核變寬和空泡現(xiàn)象(圖1)。與空白對(duì)照組相比,Gly組紅細(xì)胞核異常率顯著增加,細(xì)胞核面積顯著變小,細(xì)胞核長(zhǎng)度顯著變短(P<0.01)(圖2)。與Gly組相比,阿膠組和鹿膠小中大劑量組核異常率顯著降低(圖2),鹿膠中劑量可顯著改善細(xì)胞核面積,阿膠組和鹿膠中小劑量組細(xì)胞核長(zhǎng)度顯著改善(P<0.01)(圖2)。

A.正常形態(tài),形態(tài)橢圓,核位于細(xì)胞中央;B.微核;C.細(xì)胞核變寬;D.核內(nèi)空泡。圖1 Gly造模后斑馬魚紅細(xì)胞形態(tài)(×400) A.normal form,oval shape,nucleus in the centre of the cell;B.micronucleus;C.widening of the nucleus;D.vacuole in the nucles.Fig.1 Morphology of zebrafish erythrocytes after Gly moulding(×400)

A.斑馬魚紅細(xì)胞核異常率(n=10);B.斑馬魚紅細(xì)胞核面積與細(xì)胞核長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)(n>10 000)。①與空白對(duì)照組比較,t=-4.846～17.499,P<0.01;②與Gly組比較,t=-24.007～4.426,P<0.01。圖2 鹿膠對(duì)Gly誘導(dǎo)的斑馬魚紅細(xì)胞損傷的影響A.zebrafish erythrocyte nuclear abnormality rate (n=10);B.statistics of zebrafish erythrocyte nuclear area and nucleus length(n>10 000).①compared with blank control group,t=-4.846-17.499,P<0.01;②compared with Gly group,t=-24.007-4.426,P<0.01.Fig.2 Effect of Cervi Colla on Gly-induced erythrocyte damage in

2.2鹿膠對(duì)MTX誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚造血功能損傷的作用 與空白對(duì)照組相比,MTX組斑馬魚幼魚造血因子GATA1和SCL表達(dá)顯著降低,表明造模成功(P<0.05,P<0.01)。與MTX組相比,阿膠組,鹿膠小、中、大劑量組GATA1和SCL的表達(dá)升高,表明鹿膠可促進(jìn)斑馬魚幼魚造血功能(P<0.05)(圖3)。

A.鹿膠對(duì)斑馬魚幼魚GATA1表達(dá)的影響;B.鹿膠對(duì)斑馬魚幼魚SCL表達(dá)的影響;①與空白對(duì)照組比較,t=3.046,P<0.01;②與MTX組比較,t=-9.050～2.404,P<0.05;③與空白對(duì)照組比較,t=5.464,P<0.05。圖3 鹿膠對(duì)MTX誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚造血功能損傷的影響A.effect of Cervi Colla on GATA1 expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on SCL expression in juvenile zebrafish;①compared with blank control group,t=3.046,P<0.01;②compared with MTX group,t=-9.050～2.404,P<0.05;③Compared with blank control group,t=5.464,P<0.05.Fig.3 Effect of Cervi Colla on MTX-induced hematopoietic impairment in juvenile zebrafish

2.3鹿膠對(duì)Pred誘導(dǎo)的斑馬魚骨形成抑制的改善作用 鈣黃綠素染色結(jié)果如圖4所示,與空白對(duì)照組比較,Pred組斑馬魚幼魚第一椎骨面積顯著降低,表明Pred誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚骨形成抑制模型造模成功(P<0.05)。與Pred組相比,鹿膠小中大劑量組均可促進(jìn)斑馬魚幼魚第一椎骨形成,具有顯著差異,且第一椎骨面積呈現(xiàn)劑量依賴性,表明鹿膠可改善Pred誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚骨形成抑制,具有健骨功效(P<0.01)。

①與空白對(duì)照組比較,t=6.053,P<0.05;②與Pred組比較,t=-7.664～-4.614,P<0.01。圖4 鹿膠對(duì)Pred誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚骨形成抑制的影響①compared to blank control group,t=6.053,P<0.05;②compared to Pred group,t=-7.664--4.614,P<0.01.Fig.4 Effect of Cervi Colla on Pred-induced inhibition of bone formation in juvenile

PCR結(jié)果表明,與空白對(duì)照組相比,Pred組ALP和Runx2a表達(dá)顯著降低。與Pred組比較,鹿膠低中高劑量組均可使ALP、Runx2a表達(dá)增加,且中高劑量組促進(jìn)作用最為顯著(P<0.05,P<0.01)(圖5 AB)。結(jié)果表明鹿膠可促進(jìn)骨形成中關(guān)鍵基因表達(dá),發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。

A.鹿膠對(duì)斑馬魚幼魚ALP表達(dá)的影響;B.鹿膠對(duì)斑馬魚幼魚Runx2a表達(dá)的影響。①與空白對(duì)照組比較,t=6.330～8.728,P<0.05;②與Pred組比較,t=-17.634～-3.803,P<0.05;③與Pred組比較,t=-7.447,P<0.01。圖5 鹿膠對(duì)斑馬魚幼成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響A.effect of Cervi Colla on ALP expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on Runx2a expression in juvenile zebrafish.①compared with blank control group,t=6.330-8.728,P<0.05;②compared with Pred group,t=-17.634--3.803,P<0.05;③compared with the group,t=-7.447,P<0.01.Fig.5 Effect of Cervi Colla on the expression of osteogenesis-related genes in juvenile

2.4鹿膠對(duì)DBP誘導(dǎo)的眼部細(xì)胞凋亡模型斑馬魚的作用 吖啶橙染色結(jié)果如圖6所示,與空白對(duì)照組相比,DBP組斑馬魚幼魚眼部凋亡細(xì)胞數(shù)顯著增加,表明DBP誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚眼部凋亡模型造模成功(P<0.01)。與DBP組相比,阿膠組和鹿膠小中大劑量均可明顯改善斑馬魚幼魚眼部凋亡細(xì)胞數(shù),且鹿膠組眼部凋亡數(shù)呈現(xiàn)劑量依賴性,表明鹿膠具有抗斑馬魚幼魚眼部凋亡作用(P<0.01)。

①與空白對(duì)照組比較,t=-4.655,P<0.01;②與DBP組比較,t=3.986～5.456,P<0.01。圖6 鹿膠對(duì)DBP誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚眼部凋亡的影響①compared to blank control group,t=-4.655,P<0.01;②compared to DBP group,t=3.986-5.456,P<0.01.Fig.6 Effect of Cervi Colla on DBP-induced ocular apoptosis in juvenile

Western blotting結(jié)果如圖7所示,與空白對(duì)照組相比,DBP組Bcl-2的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。與DBP組相比,給予鹿膠后,Bcl-2的表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性上升,且大劑量組具有顯著差異(P<0.01)。PCR結(jié)果如圖8所示,與空白對(duì)照組相比,DBP組線粒體DNA拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)。給予不同濃度的鹿膠后,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,中高劑量組促進(jìn)作用具有顯著差異(P<0.01)。表明鹿膠可通過(guò)增加線粒體DNA拷貝數(shù)改善斑馬魚幼魚的細(xì)胞凋亡。

①與空白對(duì)照組比較,t=9.364,P<0.01;②與DBP組比較,t=-19.582～-3.864,P<0.01。圖7 鹿膠促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)①compared to blank control group,t=9.364,P<0.01;②compared to DBP group,t=-19.582--3.864,P<0.01.Fig.7 Cervi Colla promoted the expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2

①與空白對(duì)照組比較,t=23.059,P<0.01;②與DBP組比較,t=-13.506～-5.922,P<0.01。圖8 鹿膠對(duì)DBP誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚的線粒體拷貝數(shù)的影響①compared to blank control group,t=23.059,P<0.01;②compared to DBP group,t=-13.506--5.922,P<0.01.Fig.7 Effect of Cervi Colla on DBP-induced mitochondrial copy number in juvenile

3 討論

膠類中藥是以動(dòng)物的皮、角等原料制成的固體膠,味甘、性平,具有滋陰、補(bǔ)血、止血、潤(rùn)燥等功效,臨床用于血虛、陰虛和出血等證,在古方中大多與其他藥物配伍使用,多為補(bǔ)虛的要藥[8]。研究表明,膠類中藥對(duì)血液系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病有較好的補(bǔ)益作用。血虛證是血液虧虛、臟腑百脈失養(yǎng)而表現(xiàn)全身虛弱的證候,是臨床中的常見病癥,其發(fā)生多由生血乏源、失血過(guò)多等引起。阿膠等膠類中藥可通過(guò)促進(jìn)紅細(xì)胞生成的關(guān)鍵因子生成等方面促進(jìn)造血功能,改善血虛癥狀,發(fā)揮補(bǔ)益作用。本研究采用Gly誘導(dǎo)斑馬魚成魚紅細(xì)胞損傷模型,探究鹿膠對(duì)Gly造成的紅細(xì)胞損傷的緩解作用。研究表明,Gly會(huì)誘發(fā)斑馬魚外周血紅細(xì)胞的遺傳損傷[9]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鹿膠可改善Gly造成的斑馬魚紅細(xì)胞形態(tài)變化,其改善血虛作用可能與減少紅細(xì)胞損傷有關(guān)。MTX作為一種抗腫瘤藥物,可造成斑馬魚紅細(xì)胞造血功能損傷。斑馬魚與人類造血過(guò)程近似,其造血過(guò)程分為原始造血和定向造血[10]。SCL基因在原始造血中調(diào)控造血功能[11],GATA-1是調(diào)控紅細(xì)胞發(fā)育的主要因子[12]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鹿膠可提高造血因子SCL、GATA-1的表達(dá),通過(guò)調(diào)節(jié)造血中關(guān)鍵基因表達(dá)改善斑馬魚造血功能。血虛的形成可能與多種因素相關(guān),鹿膠改善紅細(xì)胞形態(tài)和促進(jìn)造血因子基因表達(dá)作用可能是其補(bǔ)血功效的現(xiàn)代藥理學(xué)基礎(chǔ),其作用的詳細(xì)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)中歸為“骨痿、骨痹”,其病機(jī)以腎虛為主、脾虛為輔[13]。其治法以補(bǔ)腎健脾為代表。

本研究采用Pred誘導(dǎo)斑馬魚幼魚骨形成抑制模型,探究鹿膠抗骨質(zhì)疏松的補(bǔ)益作用。糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期使用可引起骨質(zhì)疏松的發(fā)生,ALP和轉(zhuǎn)錄因子Runx2在骨形成中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,鹿膠可顯著改善Pred導(dǎo)致的斑馬魚骨形成抑制,促進(jìn)成骨相關(guān)基因ALP、Runx2a的表達(dá)。鹿膠可通過(guò)促進(jìn)骨形成中關(guān)鍵因子的基因表達(dá),發(fā)揮強(qiáng)筋健骨功效。

衰老是細(xì)胞和機(jī)體水平發(fā)生的功能退化的過(guò)程[14]?！端貑?wèn)·上古天真論》中認(rèn)為衰老與腎虛密切相關(guān)。腎為先天之本,腎精氣虧虛容易導(dǎo)致心、肝、脾、肺虛。本研究采用DBP誘導(dǎo)斑馬魚幼魚眼部凋亡模型,探究鹿膠抗細(xì)胞凋亡的補(bǔ)益作用。DBP可誘導(dǎo)斑馬魚眼部細(xì)胞凋亡[15-16]。Bcl-2是抗凋亡蛋白,可抑制發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡[17]。本研究表明,鹿膠可顯著降低DBP誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚眼部凋亡細(xì)胞數(shù),促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2和線粒體DNA的表達(dá)。本研究提示,鹿膠可能通過(guò)促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)發(fā)揮抗衰老作用。

本研究利用多種斑馬魚模型探究鹿膠補(bǔ)益作用,結(jié)果表明其具有較好的補(bǔ)血、健骨、抗衰老等補(bǔ)益作用,為其廣泛應(yīng)用和深入研究提供依據(jù)。