卡介苗的研究進(jìn)展

曹慧綜述，王珣審校

北京生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量保證部，北京 100176

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的一種較常見的慢性、消耗性傳染病，也是單一感染源導(dǎo)致死亡的首要原因。Mtb主要通過呼吸道經(jīng)飛沫傳播，臨床上以肺部感染最為常見［1］。大多數(shù)感染者無癥狀，稱為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）。若不進(jìn)行治療，10%的潛伏感染患者會進(jìn)展為活動性TB（active tuberculosis），若未經(jīng)有效治療，活動性TB的死亡率可達(dá)66%［2］。TB的典型癥狀包括慢性咳嗽、咳血、發(fā)燒、夜間潮熱以及體質(zhì)量減輕［3］。

世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）發(fā)布的《2022 年全球結(jié)核病報(bào)告》中顯示，2021 年全球新發(fā)TB 患者1 060 萬，發(fā)病率為134／10 萬［4］。我國2021 年估算TB 新發(fā)患者數(shù)為78.0 萬，發(fā)病率為55／10 萬；2020 年估算TB 新發(fā)患者數(shù)為84.2 萬，發(fā)病率為59／10萬［4］。在30個TB高負(fù)擔(dān)國家中，我國估算TB 發(fā)病數(shù)排第3 位，僅次于印度尼西亞（96.9萬）和印度（295 萬）［4］。SARS-CoV-2 大流行對TB 診療服務(wù)的可及性以及TB 負(fù)擔(dān)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響。全球在2019 年前所取得的防控進(jìn)展已放緩、停滯甚至逆轉(zhuǎn)，TB 死亡絕對人數(shù)較2019 年之前有所上升，2021年，我國HIV陰性TB患者死亡人數(shù)估算為3萬，TB死亡率為2.1／10萬［5］。2020年，在30個TB高負(fù)擔(dān)國家中，大多數(shù)國家的TB死亡人數(shù)均有所增加［5］。預(yù)計(jì)2020 年TB 將成為僅次于COVID-19 的第2 大單一感染源導(dǎo)致死亡的原因［5］。

據(jù)2016年WHO報(bào)告，全球新發(fā)TB病例1 040萬，兒童占10%，其中耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）48萬例，此外還有10萬例耐單藥利福平TB 患者［6］。WHO 預(yù)測，2018 — 2020 年，TB 高負(fù)擔(dān)國家的結(jié)核感染及發(fā)病特點(diǎn)將是MDR-TB和艾滋病合并TB（TB／HIV）［6］。面對MDR-TB 的嚴(yán)重威脅，研發(fā)新的預(yù)防及治療手段迫在眉睫。而新型抗生素的研發(fā)周期長，且細(xì)菌耐藥的發(fā)展速度遠(yuǎn)快于新藥的研發(fā)速度。因此，疫苗接種是減少抗生素消耗和減緩抗生素耐藥性發(fā)展的有效策略之一。

BCG 是目前唯一批準(zhǔn)使用的最廣泛的預(yù)防TB疫苗，已被納入WHO 推薦的兒童免疫計(jì)劃，主要由于其對兒童結(jié)核性腦膜炎和粟粒性肺結(jié)核的有效性、在世界貧困國家使用的成本效益以及在人類中使用的安全性［7］。目前，全球有超過40 家制造商生產(chǎn)BCG 疫苗［8］。本文從BCG 的發(fā)展史、改良措施和適應(yīng)證等方面對BCG最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 BCG的發(fā)展史

法國科學(xué)家Calmette 和Guerin 在1908 年將分離出的牛型Mtb 有毒株經(jīng)13 年231 次連續(xù)培養(yǎng)和傳代，在1921年獲得牛型Mtb減毒株，并證實(shí)其對人體無致病性［9］。為紀(jì)念兩位科學(xué)家，研究者將該疫苗命名為BCG。1921 年，法國批準(zhǔn)將BCG 用于預(yù)防新生兒TB，并獲得顯著效果，能夠降低越90%的TB 死亡率。1924 年，巴斯德研究所將BCG 的培養(yǎng)物運(yùn)送到世界各地不同實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行進(jìn)一步繁殖并用于疫苗生產(chǎn)。1928 年以后，BCG 在全球廣泛使用［10］。至20世紀(jì)40年代，多項(xiàng)臨床研究均證實(shí)了BCG 對兒童TB 的保護(hù)作用［11］。WHO 在20 世紀(jì)60 年代制定了BCG 接種策略［9］。1974 年，BCG 被WHO 納入擴(kuò)大免疫規(guī)劃［12］。

BCG 菌株經(jīng)全球不同實(shí)驗(yàn)室長期傳代后，出現(xiàn)了數(shù)十種不同的子菌株，這些菌株在基因組學(xué)、免疫原性和毒力特性等方面均表現(xiàn)出顯著差異。BCG 缺乏編碼多種毒力因子和重要T 淋巴細(xì)胞抗原的基因片段，如ESX1 分泌系統(tǒng)的早期分泌靶蛋白-6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾液蛋白-10（culture filtrate protein-10，CFP-10）［13］。以1927 年為分界點(diǎn)，研究者將BCG 菌株分為早期BCG 株和晚期BCG 株［9］。早期BCG 株包括：①經(jīng)13 年231 次連續(xù)傳代發(fā)生了RD1 區(qū)域缺失（1908— 1921 年）的牛型Mtb弱毒株；②由缺失了RD1區(qū)域的牛型Mtb弱毒株再次發(fā)生串聯(lián)重復(fù)序列DU2-Ⅰ和DU2-Ⅱ片段的插入等變異，形成Russia（1924 年）、Japan（1925 年）、Moreau（1925 年）和Birkhaug 株（1927 年）；③由缺失了RD1 區(qū)域的牛型Mtb 弱毒株發(fā)生串聯(lián)重復(fù)序列IS6110 的缺失形成Sweden 株（1926 年）。晚期BCG株是在發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)序列IS6110缺失的基礎(chǔ)上又發(fā)生了RD2 區(qū)域的缺失，包括：①發(fā)生了N-RD18 區(qū)域缺失和串聯(lián)重復(fù)序列DU2-Ⅳ插入的菌株，形成Tice（1934年）、Frappier（1937年）、Phipps（1938年）和Pasteur株（1961年，為代表株）等；②發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)序列DU2-Ⅲ片段插入的菌株，形成Prague（1946年）、China（1947 年）、Glaxo（1954 年，為代表株）和Danish株（1961年）等。目前國際上主要使用的BCG生產(chǎn)用菌株有BCG-Pasteur（1173P2）、BCG-Danish（Copenhagen1331）、BCG-Japan（Tokyo172）等［14］。

自1921 年問世以來，BCG 接種兒童已超過40億［15］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2020年，全球已有153個國家實(shí)施普遍接種BCG 的政策，其中115 個國家的接種覆蓋率超過80%，87個國家的接種覆蓋率超過90%［16］。對于以歐美等為主的發(fā)達(dá)國家，考慮到該疾病發(fā)病率低，具備充足的醫(yī)療資源可充分控制疾病，且接種疫苗可能干擾體檢結(jié)果等原因，這種疫苗的接種逐漸被邊緣化，未實(shí)施普遍接種，接種覆蓋率不高；而對于欠發(fā)達(dá)地區(qū)，由于營養(yǎng)欠佳、環(huán)境惡劣及防治知識匱乏等原因?qū)е耇B 高發(fā)，只能依賴于普遍接種BCG 來控制發(fā)病率。盡管BCG 可有效預(yù)防對嬰幼兒具有高致死性的結(jié)核性腦膜炎和粟粒性肺結(jié)核，但大量的流行病學(xué)調(diào)查研究表明，BCG 對于青少年和成人肺結(jié)核的保護(hù)效果并不理想，其免疫保護(hù)力介于0 ~ 80%之間，差異性極大［15］。且保護(hù)效果會隨著接種時間的延長逐步下降，保護(hù)時限僅5 ~ 10年［16］。此外，BCG 對降低暴露后感染風(fēng)險(xiǎn)及感染病例無效，且不能用于免疫低下人群如艾滋病患者等的接種。因此，對BCG 的改良和研發(fā)新的抗TB疫苗十分必要。

2 BCG的改良

2.1 改變免疫途徑 BCG 是目前唯一采用皮內(nèi)注射的疫苗（其他疫苗一般是肌肉或皮下注射）［17］。有研究表明，通過靜脈注射途徑接種BCG 的保護(hù)作用更強(qiáng)，研究發(fā)現(xiàn)，通過靜脈注射途徑給恒河猴接種BCG比皮內(nèi)注射BCG或皮內(nèi)注射并通過氣管內(nèi)加強(qiáng)接種可產(chǎn)生更好的保護(hù)作用［18］。一項(xiàng)針對恒河猴的更大規(guī)模研究通過18F-氟脫氧葡萄糖進(jìn)行正電子發(fā)射斷層掃描-計(jì)算機(jī)斷層掃描（PET-CT）成像證實(shí)了靜脈注射BCG 所提供的改善的保護(hù)作用，在血液、脾臟、支氣管肺泡灌洗液和肺淋巴結(jié)中誘導(dǎo)了更多的抗原特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，且靜脈注射的10只動物中有9只受到高度保護(hù)，其中6只未觀察到任何肺部病變［19］。另一項(xiàng)研究顯示，給小鼠靜脈注射BCG 還可改變造血干細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨髓生成，并增強(qiáng)骨髓源性巨噬細(xì)胞的活化［20］。此外，該研究還表明，與皮下注射相比，靜脈注射BCG 后7 個月內(nèi)仍可在骨髓中檢測到BCG 的存在，表明BCG 與免疫系統(tǒng)的相互作用時間較長。但給人類靜脈注射這種具有復(fù)制能力的細(xì)菌仍需進(jìn)行完善的安全性和有效性研究，因?yàn)锽CG作為減毒株，仍可能在免疫抑制個體中誘發(fā)包括播散性疾病在內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。

除靜脈注射外，將BCG 直接遞送至黏膜或肺部的其他遞送途徑也值得探索。與靜脈注射相比，氣霧接種BCG可減少細(xì)菌傳播及肺部細(xì)菌荷載量［21］。給小鼠鼻內(nèi)接種BCG比皮內(nèi)注射能誘導(dǎo)肺部更好的保護(hù)，誘導(dǎo)表達(dá)PD-1+KLRG1 細(xì)胞表面表型的抗原特異性組織駐留T 細(xì)胞表型比例增加［22］。有研究比較了恒河猴鼻內(nèi)和皮內(nèi)接種BCG之間的保護(hù)效力差異，發(fā)現(xiàn)通過支氣管內(nèi)灌注免疫的恒河猴感染Mtb 明顯延遲，甚至完全不感染，而所有未免疫和皮內(nèi)免疫BCG的動物均會受到感染并隨后發(fā)展為TB［23］。另外，通過舌下途徑接種BCG也可對小鼠產(chǎn)生較好的保護(hù)作用［22］。研究者仍需更好地了解如何最大限度地發(fā)揮肺部的有效免疫反應(yīng)，同時避免過度的免疫激活。

2.2 改變接種程序 應(yīng)用初免-加強(qiáng)策略最簡單和最方便的方法是復(fù)種BCG。但以往的大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，BCG復(fù)種對TB預(yù)防無效［24-25］。2018年，WHO也公布了同樣的結(jié)論，即不建議進(jìn)行BCG 復(fù)種［26］。但最近的一項(xiàng)QFT-G（QuantiFERON Gold，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測經(jīng)結(jié)核特異性抗原ESAT-6、CFP-10和TB7.7刺激后產(chǎn)生IFNγ 的濃度來診斷結(jié)核感染的一種免疫學(xué)方法）臨床試驗(yàn)表明，陰性青少年復(fù)種BCG是安全的，可顯著改善BCG特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)，而不是特異性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)［27］。值得注意的是，在TB 高發(fā)地區(qū)，BCG 復(fù)種雖不能阻止QFT 的初始轉(zhuǎn)換，但對持續(xù)QFT 轉(zhuǎn)換的效力達(dá)45.4%，而候選疫苗H4∶IC31的效力僅為30.5%。持續(xù)的QFT轉(zhuǎn)換可能反映了持續(xù)的Mtb 感染或由潛伏期進(jìn)展為活動期肺結(jié)核。此研究表明，BCG復(fù)種有助于預(yù)防Mtb持續(xù)感染，具有重要的公共衛(wèi)生意義。

BCG 的免疫效力會受到感染狀況的影響，這是導(dǎo)致BCG 免疫效力多變的原因之一［27］。因此，觀察BCG復(fù)種是否會受Mtb感染的影響非常重要，2021年，全球約有1／4 人口屬于LTBI。BCG 復(fù)種可短暫激活BCG 特異性CD4+、CD8+和γδ T 細(xì)胞反應(yīng)，且能持續(xù)至少1 年的增強(qiáng)高特異性自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和T 細(xì)胞應(yīng)答［28］，提示BCG 復(fù)種可能產(chǎn)生額外的免疫反應(yīng)。但BCG 復(fù)種對LTBI 患者的保護(hù)性仍需進(jìn)一步研究。

3 新型抗TB疫苗的研發(fā)

近年來，除了對免疫途徑和接種程序進(jìn)行改良外，研究者還致力于對BCG 自身的改良和TB新型候選疫苗的研發(fā)，迄今已研發(fā)出超過200 款候選疫苗，其中一些疫苗已成功進(jìn)入Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗(yàn)，主要有重組疫苗、病毒載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗和滅活疫苗。見表1。

表1 部分新型TB疫苗研究進(jìn)展Tab.1 Advances in some novel TB vaccines

成功的BCG 加強(qiáng)免疫疫苗應(yīng)該不僅可以預(yù)防原發(fā)結(jié)核感染，還可以延緩潛伏感染者的疾病進(jìn)展。在最近完成的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，M72／AS01E 可為49.7%的成年人LTBI 者提供持續(xù)至少3 年的預(yù)防活動性肺結(jié)核的免疫保護(hù)，而且未發(fā)現(xiàn)該疫苗療效在年齡或性別上存在差異，這對于開發(fā)新的TB 疫苗具有重要意義。值得注意的是，無論在TB 流行地區(qū)還是低危地區(qū)，以及接種對象的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療狀況如何，M72／AS01E 在HIV 感染者中均具有臨床可接受的安全性和免疫原性［29］。雖然HIV 陽性人群更容易患TB，但WHO 不建議HIV 陽性的嬰兒接種BCG，因此，亟需一種有效的TB 疫苗可以安全地為艾滋病患者接種，預(yù)計(jì)M72／AS01E 將填補(bǔ)該空白。

采用基因工程技術(shù)改造的BCG 稱為重組BCG（recombinant BCG，rBCG）［30］，根據(jù)疫苗設(shè)計(jì)的策略可分為：①過表達(dá)BCG中已有的免疫優(yōu)勢抗原；②插入BCG 中缺失的Mtb 優(yōu)勢抗原；③引入表達(dá)外源蛋白的基因以增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)［31-32］。由柏林馬克斯·普朗克感染生物學(xué)研究所研發(fā)的rBCG VPM1002 目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)。VPM1002 使用BCG Prague亞型菌株，過表達(dá)李斯特菌溶菌素O。李斯特菌溶菌素O 可穿透吞噬體膜，使BCG 的菌體和DNA暴露于細(xì)胞表面，從而潛在增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞的活化［33］。在BALB／c 小鼠氣溶膠感染模型中，與BCG相比，單次免疫106CFU VPM1002 可顯著降低小鼠肺部Mtb 載量。在一項(xiàng)隨機(jī)、開放標(biāo)簽的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中（NCT01479972），入組48 名新生兒，6 個月的隨訪結(jié)果表明，VPM1002 在新生兒中具有良好的安全性、耐受性和免疫原性［34-35］。AFRO-1 是一種過表達(dá)Mtb 抗原Ag85A、Ag85B、TB10.4 和產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)氣溶酶O的rBCG。氣溶酶O可幫助抗原逃逸至細(xì)胞質(zhì)中。與BCG 相比，接種AFRO-1 的C57BL／6小鼠對Mtb（HN878 株）感染表現(xiàn)出增強(qiáng)的免疫應(yīng)答和存活率［36］。AFRO-1 在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠中也表現(xiàn)出良好的安全性。MUSTAFA 等［37］研究表明，小鼠和豚鼠接種表達(dá)ESAT-6的rBCG后，能夠分泌ESAT-6，并保護(hù)其免受Mtb 感染。rBCG-CMX 系在BCG 中表達(dá)由Mtb Ag85C、MPT51 和HspX 免疫優(yōu)勢表位組成的融合蛋白（CMX），與未免疫組相比，皮下免疫106CFU rBCG-CMX 的BALB／c小鼠誘導(dǎo)出更高數(shù)量的Th1、Th17和多功能特異性T細(xì)胞；與BCG相比，接種rBCGCMX疫苗顯著降低了由Mtb攻擊引起的肺部病變的擴(kuò)展以及肺部細(xì)菌負(fù)荷［38］。

4 BCG的其他適應(yīng)證

BCG 接種會激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及NK細(xì)胞等固有免疫細(xì)胞，提升炎性因子的表達(dá)。如BCG靜脈接種可促進(jìn)造血干細(xì)胞向中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，并誘導(dǎo)表觀遺傳學(xué)修飾和代謝改變，進(jìn)而提高促炎因子IL-1β和TNF-α的基因轉(zhuǎn)錄，激發(fā)固有免疫，對其他病原體，如非Mtb、病毒等產(chǎn)生非特異性免疫保護(hù)。

4.1 BCG的抗腫瘤作用

1990年，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)BCG 膀胱灌注用于淺表膀胱癌（non-muscle-invasive bladder cancer，NMIBC）的治療。NMIBC主要分為3個階段：Ta、T1和CIS。Ta：腫瘤細(xì)胞局限于上皮組織；T1：腫瘤細(xì)胞侵襲至上皮下結(jié)締組織；CIS：原位癌。BCG 膀胱內(nèi)灌注一般是從活檢確診為CIS 或Ta 及T1 術(shù)后1 周內(nèi)開始，首期治療持續(xù)6 周，每周灌注1 次，并在之后的第3、6、12、18、24、30、36 月進(jìn)行維持治療，每次3 周［39］。盡管BCG 灌注治療對Ta 及T1 階段的膀胱癌有55% ~65%的完全緩解率，對CIS有70%~75%的完全緩解率，但仍有25%~45%的患者不會從治療中獲益，且有40%的患者會在初始響應(yīng)之后疾病復(fù)發(fā)，除此之外，BCG 膀胱內(nèi)灌注治療還存在一系列的毒副作用，常見的有膀胱炎、發(fā)熱及前列腺炎，盡管嚴(yán)重毒副作用發(fā)生的概率不高，但仍有20%的患者對BCG 灌注治療不耐受，導(dǎo)致治療周期縮短［40］。另外，至目前為止，F(xiàn)DA 僅批準(zhǔn)了BCG 用于NMIBC 的臨床治療，如何提升BCG 抗腫瘤的有效性與安全性，并推廣至其他腫瘤一直是業(yè)界的研究重點(diǎn)。

4.1.1 BCG組分疫苗及滅活疫苗的抗腫瘤作用 大量的活菌灌注易引發(fā)BCG 感染，造成安全性問題。有臨床前研究探究了BCG 組分疫苗的抗腫瘤效果，如BCG細(xì)胞壁骨架（BCG cell wall skeleton，BCG-CWS）、分枝菌酸（mycolic acid，MA）、海藻糖6，6’二元羧酸鹽（trehalose 6，6’dimycolate，TDM）等。NAKAMURA等［41-42］針對BCG-CWS 水溶性差、相對分子質(zhì)量大且易聚集等缺點(diǎn)，將BCG-CWS 包載在脂質(zhì)體中，制備出一種高度均一且易于分散的BCG-CWS 納米顆粒（CWS-NP）。研究證明，CWS-NP 極易被小鼠膀胱癌細(xì)胞MBT-2 攝取，并在大鼠原位膀胱癌模型中展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果。類似地，YOSHINO 等［43］將MA包載在陽離子脂質(zhì)體中制備了MA納米顆粒（LipkMA），體外試驗(yàn)中，Lip-kMA 易被小鼠膀胱癌細(xì)胞MB49 攝取，并在MB49 與MBT-2 移植瘤模型中展現(xiàn)出顯著的抑瘤效果，且這種抗腫瘤效應(yīng)是T 細(xì)胞依賴性的。

另有研究探究了滅活BCG的抗腫瘤效果。如熱滅活BCG（heat killed BCG）和γ射線輻照滅活BCG（γirradicated BCG，γ-BCG）。盡管有體外試驗(yàn)表明熱滅活BCG 能夠激活NK 的抗腫瘤作用［44］，但在另一項(xiàng)體內(nèi)研究中，與未給藥小鼠相比，熱滅活BCG并不能抑制腫瘤生長［45］。與熱滅活方式相比，γ 射線輻照對細(xì)胞的傷害更小，并能保持細(xì)胞的代謝活性。但有研究表明，在小鼠原位膀胱癌模型中，與未接受治療的小鼠相比，γ-BCG 展現(xiàn)出一定的腫瘤控制作用，但其抗腫瘤效果顯著弱于活菌［46］。

另外，有研究采用超聲的方式對BCG 進(jìn)行了裂解破碎，制備出一種BCG 裂解物（BCG lysate）。在小鼠黑色素瘤模型中，采用瘤內(nèi)注射的方式給藥，BCG裂解物展現(xiàn)出優(yōu)于BCG活菌的腫瘤控制效果。將BCG裂解物包載在PLGA-PEG-PLGA 熱敏凝膠中（BCG凝膠），注射至腫瘤旁，能夠?qū)h(yuǎn)端腫瘤起到治療作用，同時阻止黑色素瘤向肺部轉(zhuǎn)移。機(jī)制研究表明，與BCG相比，BCG凝膠能夠激活抗原呈遞細(xì)胞（antigenpresenting cells，APC）半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CTSS），并通過CTSS促進(jìn)APC對腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行加工與呈遞［47］。

4.1.2 重組BCG 的抗腫瘤作用 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展及基因工程技術(shù)的應(yīng)用，將BCG 作為載體運(yùn)輸其他治療分子，構(gòu)建增強(qiáng)型重組BCG 也成為增強(qiáng)BCG有效性的主要手段之一。

BCG 激發(fā)抗腫瘤免疫的第一步是黏連至尿路上皮細(xì)胞表面并被后者內(nèi)吞，因此，增強(qiáng)BCG對尿路上皮的黏附性，有助于增強(qiáng)BCG 的抗腫瘤效果。有研究構(gòu)建了過表達(dá)FimH 的重組BCG（rBCG-S.FimH），F(xiàn)imH 為一種甘露糖黏連蛋白（mannose binding protein），是非致病大腸埃希菌表達(dá)用于黏附在人類尿路上皮細(xì)胞的。體外與體內(nèi)試驗(yàn)均表明，與野生BCG相比，rBCG-S.FimH更易黏附至尿路上皮細(xì)胞表面且更快地被后者內(nèi)吞，并誘導(dǎo)更顯著的Th1 偏向型免疫應(yīng)答，在小鼠原位膀胱癌模型中展現(xiàn)出更好的抗腫瘤效果［48］。MtbVAC 為一株減毒分枝桿菌，表達(dá)BCG 缺失的ESAT6／CFP10 蛋白，上述蛋白對細(xì)菌在膀胱內(nèi)的定植起決定性作用。體內(nèi)試驗(yàn)表明，MtbVAC 能激發(fā)腫瘤抗原特異性CD4+和CD8+T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，在小鼠原位膀胱癌模型中，MtbVAC 展現(xiàn)出比BCG 更為顯著的腫瘤控制效果，特別是與免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-L1 單抗聯(lián)用，所有荷瘤小鼠在接受治療后腫瘤均消退［49］。

作為免疫治療，能否誘導(dǎo)強(qiáng)有力的適應(yīng)性免疫應(yīng)答對治療效果起決定作用，因此，也有研究聚焦于增強(qiáng)BCG 調(diào)節(jié)的訓(xùn)練免疫（trained immunity）。如有研究構(gòu)建了表達(dá)環(huán)二腺苷酸（cyclic-di-AMP，c-di-AMP）的重組BCG（BCG-disA-OE），c-di-AMP能激活干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）。在體外實(shí)驗(yàn)中，與野生型BCG 相比，BCG-disA-OE 更能促進(jìn)巨噬細(xì)胞向促炎狀態(tài)極化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能及胞內(nèi)自噬，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生與訓(xùn)練免疫有關(guān)的表觀遺傳學(xué)變化。在大鼠原位膀胱癌模型中，BCG-disA-OE 展現(xiàn)出比野生型BCG 更佳的抗腫瘤效果［50］。

此外，BCG 治療能夠提高血清中IFNγ、IL-1、IL-2、IL-8、TNF 等細(xì)胞因子水平。其中，IFNγ 不僅能直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管形成，還能調(diào)節(jié)固有免疫與適應(yīng)性免疫，如增強(qiáng)Th1 型免疫應(yīng)答，活化巨噬細(xì)胞。野生型BCG 灌注對IFNγ 水平的提高有限，作為水溶性生物制劑，外源性IFNγ 易隨尿液排出體外，半衰期較短。因此，構(gòu)建IFNγ 分泌性重組BCG（rBCG-IFNγ）有望進(jìn)一步提高內(nèi)源性IFNγ 的產(chǎn)生，增強(qiáng)BCG 的免疫原性。有研究證明，在小鼠原位膀胱癌模型中，rBCG-IFNγ 灌注治療增強(qiáng)了CD4+T 細(xì)胞在膀胱組織中的浸潤，與未接受治療小鼠相比，低劑量的rBCG-IFNγ 灌注能顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，但rBCG-IFNγ 治療小鼠的生存期與空載rBCG灌注小鼠差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［51］。也有研究構(gòu)建了表達(dá)人IFNα2b 的重組BCG（rhIFNα BCG），體外試驗(yàn)表明，與BCG相比，rhIFNα BCG能誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞（peripheral blood monocular cell，PBMC）產(chǎn)生更高水平的IFNγ 與IFNγ 誘導(dǎo)蛋白-10（IFN-inducible protein-10，IP-10），且速度更快［52］。

BCG 膀胱內(nèi)灌注治療是最成功的腫瘤免疫治療方法之一，但其能夠誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答的機(jī)制尚不完全清楚，仍缺乏準(zhǔn)確的生物標(biāo)記來篩選對治療無效的患者，會耽誤這部分患者尋求其他治療手段。因此，仍需探究BCG抗腫瘤免疫治療的新機(jī)制，開發(fā)療效與安全性更好的BCG抗腫瘤治療方法。

4.2 BCG對其他感染性疾病的保護(hù) 大量研究表明，BCG 接種對非Mtb 引發(fā)的疾病，如麻風(fēng)病和布魯里潰瘍病等均有一定的保護(hù)效果。一項(xiàng)針對7 項(xiàng)臨床研究和19 項(xiàng)觀察性研究的綜合分析表明，BCG 接種者的麻風(fēng)病患病率顯著低于未接種者。在7 項(xiàng)臨床研究中，BCG 的平均保護(hù)率為26%；在19 項(xiàng)觀察性研究中，BCG 的保護(hù)率為61%。各研究之間的保護(hù)率差異很大，這種差異是多因素的，如臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、結(jié)果評估、開展地區(qū)、納入人群與人數(shù)、接種的BCG 菌株等［53］。一項(xiàng)在烏干達(dá)進(jìn)行的大規(guī)模臨床研究表明，皮內(nèi)注射BCG 可為結(jié)核菌素皮試陰性或低中級反應(yīng)人群提供47%的12 個月布魯里潰瘍病保護(hù)率［54］。2004 年一項(xiàng)在喀麥隆進(jìn)行的隊(duì)列研究表明，與存在BCG接種疤痕的兒童相比，多病灶布魯里潰瘍病在不存在BCG 接種疤痕的兒童中發(fā)生率更高［55］。但在2015 年發(fā)表的一篇在剛果、加納、多哥等多地區(qū)的回顧性研究表明，是否有BCG 接種疤痕與布魯里潰瘍病的重癥發(fā)生率、患病時間等無關(guān)［56］?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，WHO 建議給麻風(fēng)病高發(fā)地區(qū)的新生兒或未接種BCG的青少年和成人以及麻風(fēng)病史家庭出生的新生兒接種BCG，并建議布魯里潰瘍病發(fā)地區(qū)的人群考慮接種BCG［57］。

201 9 年末，COVID-19 肆虐全球，鑒于BCG 接種能對其他病原體產(chǎn)生非特異性免疫，大量研究探索了BCG接種對COVID-19的影響。2020年，有研究指出，BCG接種有助于減少COVID-19患者的入院率、降低COVID-19 引發(fā)的死亡率［58-59］。2022 年一項(xiàng)在波蘭進(jìn)行的多中心、隨機(jī)雙盲臨床試驗(yàn)表明，COVID-19發(fā)生率與BCG接種無關(guān)聯(lián)性，且BCG再接種與SARSCoV-2抗體水平無關(guān)［60-61］。但地區(qū)差異、SARS-CoV-2毒株差異、疫情所處的流行階段、防疫政策差異（如強(qiáng)制隔離）等均會對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，還需更多的研究來證實(shí)BCG對COVID-19的保護(hù)作用。

另外，BCG 接種對其他病毒引發(fā)的感染也有保護(hù)作用，這通常與BCG 接種可誘導(dǎo)天然免疫細(xì)胞表現(xiàn)出類似于適應(yīng)性免疫細(xì)胞的免疫記憶特征，即引發(fā)的訓(xùn)練有素的免疫力（trained immunity）有關(guān)。一項(xiàng)在幾內(nèi)亞幼兒中進(jìn)行的病例對照試驗(yàn)表明，BCG免疫可降低由呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）引發(fā)的下呼吸道感染發(fā)生率［62］。一項(xiàng)在40 名志愿者中進(jìn)行的隨機(jī)對照試驗(yàn)表明，在接種流感疫苗前接種BCG 可提高2009 甲型H1N1 流感疫苗株的抗體滴度［63］。另外，一項(xiàng)針對109 名患者的臨床研究表明，BCG 接種有助于降低復(fù)發(fā)性單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）的發(fā)生率與持續(xù)時間［64］。

5 小結(jié)與展望

BCG 的研究始于20 世紀(jì)初，目前，疫苗接種已成為全球范圍內(nèi)防治TB 的重要措施之一。但BCG預(yù)防TB 的有效性因地區(qū)和年齡而有所差異。在TB高流行地區(qū)，BCG 的預(yù)防效果明顯，能夠降低TB 感染和死亡的風(fēng)險(xiǎn)；在TB 低流行地區(qū)，尤其是成年人群體中，BCG 的保護(hù)作用較弱。因此，在不同地區(qū)進(jìn)行的研究中，研究者對BCG接種時機(jī)、劑量和方法進(jìn)行了探索和優(yōu)化，以提高BCG的預(yù)防效果。

盡管BCG 在TB 預(yù)防方面起到了積極作用，但其保護(hù)效果仍不理想。研究者正努力改進(jìn)BCG，以提高其免疫原性和保護(hù)效果。未來BCG的研究可關(guān)注以下幾方面：首先，繼續(xù)改良BCG，通過基因工程技術(shù)和免疫學(xué)研究，提高BCG的免疫原性和保護(hù)效果，尤其需重點(diǎn)觀察其對LTBI 的預(yù)防效果；其次，探索BCG 與其他疫苗的聯(lián)合使用，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，擴(kuò)大BCG 的應(yīng)用范圍，預(yù)防其他感染病和疾病；第三，加強(qiáng)對BCG 在非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）感染和MDR-TB 預(yù)防方面的研究，尋找更有效的預(yù)防和治療方法；最后，加強(qiáng)全球合作，推廣BCG 的應(yīng)用，特別是在結(jié)核高流行地區(qū)和高風(fēng)險(xiǎn)人群中，以降低TB的發(fā)病率和死亡率。

綜上所述，BCG 在預(yù)防TB 方面具有重要作用，已在全球范圍內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。但BCG的保護(hù)效果仍有待提高，新型BCG 的研發(fā)及其與其他疫苗聯(lián)合使用將是未來研究的重點(diǎn)。通過改良BCG免疫途徑和接種程序、與其他疫苗聯(lián)合使用以及加強(qiáng)研究合作，相信能夠進(jìn)一步提高BCG 的預(yù)防效果，減少TB的發(fā)病率和死亡率。