不同微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物制品領(lǐng)域的應(yīng)用

王曉勛綜述，張中洋審校

國藥中生生物技術(shù)研究院有限公司，北京 101111

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生產(chǎn)疫苗、抗體、干擾素和基因工程藥物等多種重要生物制品中發(fā)揮關(guān)鍵作用。早期傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝由于操作繁瑣、批間差異大、培養(yǎng)面積受限、產(chǎn)能低及傳質(zhì)和傳氧差，較難實(shí)現(xiàn)實(shí)時在線監(jiān)測，隱性污染高，在生產(chǎn)實(shí)踐中限制了工藝放大。微載體可為細(xì)胞生長提供極大的表面積，簡化培養(yǎng)工藝，實(shí)現(xiàn)實(shí)時在線監(jiān)測細(xì)胞生長，提高了疫苗等多種生物制品的生產(chǎn)力［1-2］。

微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可追溯至20世紀(jì)60年代，荷蘭學(xué)者Van Wezel首次用N，N-二乙基乙醇氨（N，Ndiethylethanolamine，DEAE）處理離子交換介質(zhì)DEAESephadex A50凝膠，使細(xì)胞可較好地黏附在其表面進(jìn)行生長增殖，DEAE-Sephadex A50凝膠具有較大的表面積／體積比率、優(yōu)良的光學(xué)屬性和合適的密度，為細(xì)胞提供了帶電荷的生長微環(huán)境［3］。單位面積細(xì)胞的生產(chǎn)力決定了細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大潛力，微載體系統(tǒng)的規(guī)?；瘧?yīng)用可為貼壁依賴型動物細(xì)胞的高產(chǎn)培養(yǎng)提供極大的表面積，適合高效的生產(chǎn)工藝開發(fā)和優(yōu)化放大。近60 年，基于微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷完善，從實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模到中試生產(chǎn)放大工藝，機(jī)械攪拌式反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器、籃式反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器等多種生物反應(yīng)器均得到應(yīng)用。研究人員主要關(guān)注的微載體特征包括：①微載體具有穩(wěn)定均一的特性，比表面積大，對細(xì)胞本身無損害；②細(xì)胞能高效黏附微載體，擴(kuò)增效率高，易放大培養(yǎng)；③微載體具有仿生微環(huán)境，細(xì)胞生長狀態(tài)和細(xì)胞活性優(yōu)良；

1 微載體簡介

1.1 微載體材料 微載體作為貼壁依賴型細(xì)胞生長的支撐介質(zhì)，高效的附著率和仿生的微環(huán)境均對其原材料特性要求較高。材料對微載體的密度、形狀、大小、厚度、膨脹度、機(jī)械穩(wěn)定性、毒性、親水性、疏水性、通透性均有影響，進(jìn)而影響細(xì)胞黏附在微載體表面的生長過程。微載體在使用前一般需要進(jìn)行預(yù)處理，包括孵育溶脹、高溫滅菌和營養(yǎng)液平衡。微載體溶液可用高壓滅菌而不影響其性能，預(yù)處理后即可添加營養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)。

目前已有多種材料應(yīng)用于微載體生產(chǎn)工藝，如葡聚糖、明膠、聚苯乙烯、聚乙烯、聚酯纖維、聚丙烯、玻璃、丙烯酰胺、硅、硅橡膠、纖維素、膠原蛋白和糖胺聚糖等，這些原材料可形成多種不同形狀，常見的有球狀、纖維狀、管狀、微孔狀等。在微載體生產(chǎn)制備中，需對這些材料進(jìn)行包被處理或引入、填充和替換一些功能基團(tuán)［3］。常見的有在載體表面引入DEAE等功能基團(tuán)、耦合一些蛋白和多肽及在載體表面包被膠原或明膠等生物大分子。研究顯示，每單位微載體比表面積越大對細(xì)胞的規(guī)?；弋a(chǎn)培養(yǎng)越有利，微載體的密度不宜過大或過小，微載體表面的電荷性質(zhì)和電荷密度決定了細(xì)胞貼壁效率和貼壁柔韌性強(qiáng)度［6-7］。

1.2 微載體分類 微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝在不斷優(yōu)化和完善，基于微載體的研究也呈現(xiàn)多元化發(fā)展的特點(diǎn)，國際市場上出售的商業(yè)化微載體類型已達(dá)十幾種，包括葡聚糖基質(zhì)微載體、纖維素基質(zhì)微載體、聚苯乙烯微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體、磁性微載體及其他微載體等多種類別［8-13］。目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)用微載體按不同材料分類見表1。

表1 常見微載體的分類Tab.1 Classification of common microcarriers

微載體在貼壁依賴型細(xì)胞的規(guī)模化培養(yǎng)中發(fā)揮著承載性基質(zhì)的特點(diǎn)，要保障細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝有效放大，一般需要對微載體的表面質(zhì)量特性進(jìn)行優(yōu)化，常見方法有在微載體表面包被蛋白及其他功能基團(tuán)等。微載體一般在干燥條件下儲存和開啟，室溫下可穩(wěn)定保存5 年以上。近年，有多種不同材料用于微載體的制備，為不同類型細(xì)胞培養(yǎng)提供了豐富的可選擇基質(zhì)。

2 不同微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究現(xiàn)狀

2.1 葡聚糖基質(zhì)微載體 以葡聚糖為基質(zhì)的微載體廣泛應(yīng)用于藥物遞送載體、細(xì)胞培養(yǎng)和組織修復(fù)等領(lǐng)域。此類微載體以交聯(lián)右旋糖苷為基礎(chǔ)架構(gòu)，具有極大比表面積（>4 000 cm2／g），外觀呈白色干粉實(shí)心顆粒狀，無臭無味，微載體表面經(jīng)特殊工藝處理覆蓋部分帶正電荷的DEAE 基團(tuán)，可滿足細(xì)胞高效生長，用來開發(fā)細(xì)胞產(chǎn)品，其中帶電基團(tuán)貫穿整個微載體基質(zhì)［14］。凡能在體外貼壁的動物細(xì)胞幾乎均能黏附至此類微載體上，如哺乳動物、禽類、魚和昆蟲細(xì)胞等，適用于大多數(shù)已確立的細(xì)胞系及從原代細(xì)胞和正常二倍體細(xì)胞株中培養(yǎng)病毒或細(xì)胞產(chǎn)物［15-16］。葡聚糖基質(zhì)微載體種類最經(jīng)典的商業(yè)化產(chǎn)品是美國GE 公司的Cytodex1（2019 年被丹納赫Cytiva 公司收購），國內(nèi)也有一些生物公司在研究開發(fā)以葡聚糖為基質(zhì)的微載體，如蘇州藍(lán)曉生物科技有限公司的微載體Seplife LX-MC-dex1，博格?。ㄉ虾＃┥锛夹g(shù)有限公司的微載體Bestdex Cell1等均為商業(yè)化產(chǎn)品。

據(jù)報道，1 mL 營養(yǎng)液使用5 mg Cytodex1 微載體相當(dāng)于增加30 cm2表面積，可大幅提高細(xì)胞擴(kuò)增空間［15］。周?。?7］采用Cytodex1 載體通過3 種不同方式培養(yǎng)Vero 細(xì)胞，6 h 后細(xì)胞均完全貼壁，培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞總數(shù)最高達(dá)（353.4 ± 5.9）× 107個，細(xì)胞進(jìn)入平臺期時接種甲型流感病毒，66 h 后細(xì)胞100%病變，最高病毒血凝效價為1∶891，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝。SA?LAM METINER 等［18］采用3 g／L的Cytodex1 在搖瓶中培養(yǎng)HeLa 細(xì)胞，初始細(xì)胞濃度為2×105個／mL，培養(yǎng)4 d，按1∶1的體積分?jǐn)?shù)接種弓形蟲，最高產(chǎn)量達(dá)17.1× 107個，是搖瓶培養(yǎng)工藝產(chǎn)量的10 倍。TRABELSI 等［19］用3 g／L 的Cytodex1 在7 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，總細(xì)胞數(shù)最高達(dá)2.87×1010個，按MOI=0.005接種AIK-C 麻疹毒株，病毒滴度達(dá)106.875TCID50／mL。目前，動物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝最大培養(yǎng)體積已達(dá)25 000 L 規(guī)模，貼壁依賴型細(xì)胞的微載體培養(yǎng)規(guī)模也達(dá)6 000 L 以上，且還在不斷擴(kuò)大和優(yōu)化。在普通的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中通過微載體基質(zhì)可實(shí)現(xiàn)每毫升數(shù)百萬個細(xì)胞的產(chǎn)量，以葡聚糖為基質(zhì)微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝已應(yīng)用于腸道病毒71型（enterovirus type 71 vaccine，EV71）疫苗、流感疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、乙型腦炎病毒疫苗、出血熱疫苗、狂犬病疫苗等多種病毒疫苗的生產(chǎn)［20-25］。

以葡聚糖為基質(zhì)的微載體溶脹后與生物反應(yīng)器內(nèi)壁具有較強(qiáng)的黏附性，進(jìn)行大規(guī)模微載體細(xì)胞培養(yǎng)后，不易將細(xì)胞從微載體上有效地消化分離，難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高效高產(chǎn)回收，目前生產(chǎn)一般采用傳統(tǒng)的胰酶消化進(jìn)行分離，在小規(guī)模培養(yǎng)階段也可使用葡聚糖酶降解微載體，同樣給細(xì)胞回收帶來較大浪費(fèi)，給工藝放大帶來一些技術(shù)障礙，增加了生產(chǎn)成本和工藝的復(fù)雜性，影響了微載體培養(yǎng)技術(shù)工藝的自動化水平，這些是亟待解決的工藝難題。

2.2 纖維素基質(zhì)微載體 纖維素基質(zhì)微載體由交聯(lián)纖維素構(gòu)成，呈多微孔結(jié)構(gòu)，硬度高，惰性生物基質(zhì)為細(xì)胞培養(yǎng)提供了堅(jiān)固的非剛性微環(huán)境［26］。Cytopore系列微載體由纖維素基質(zhì)構(gòu)成基本骨架，具有>90%孔隙的多微孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑約30 μm，溶脹體積相當(dāng)于40 mL／g。纖維素基質(zhì)多孔微載體培養(yǎng)細(xì)胞具有如下優(yōu)勢：①細(xì)胞可輕松、穩(wěn)定固定于微載體表面和孔內(nèi)，便于細(xì)胞黏附和伸展；②適合貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)；③多微孔結(jié)構(gòu)保護(hù)細(xì)胞免受高剪切力的影響；④細(xì)胞不僅可在其表面生長也可生長在載體內(nèi)部，為細(xì)胞提供更充分的生長空間；⑤細(xì)胞能在微載體間自動轉(zhuǎn)移，簡化了不同批間細(xì)胞的傳代培養(yǎng)工藝［27］。XIAO等［28］用2.5 g／L的Cytopore微載體在5 L 生物反應(yīng)器中高密度放大培養(yǎng)重組CHO 細(xì)胞系工程株CL-11G 和雜交瘤細(xì)胞，總細(xì)胞數(shù)可達(dá)10 × 1010個，由于細(xì)胞能自發(fā)地從多孔微載體中釋放并與之重新結(jié)合，較易擴(kuò)大至20 L 生物反應(yīng)器培養(yǎng)，用于生產(chǎn)重組人尿型纖溶酶原激活劑。THARMALINGAM 等［29］分別采用懸浮培養(yǎng)和Cytopore 微載體培養(yǎng)CHO 細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白，結(jié)果表明，與懸浮培養(yǎng)比較，微載體培養(yǎng)可提高β-IFN蛋白和t-PA的產(chǎn)量達(dá)2.5倍。F?LDES等［30］比較了Cytopore 微載體和組織培養(yǎng)板培養(yǎng)干細(xì)胞的差異，結(jié)果表明，在相同培養(yǎng)時間條件下，微載體培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量不僅高于組織培養(yǎng)，且干細(xì)胞具有良好的形態(tài)特征。

纖維素多孔微載體在增加細(xì)胞培養(yǎng)表面積的同時，大幅減少了剪切力對細(xì)胞的機(jī)械損傷，不僅適合貼壁依賴型細(xì)胞，也適合懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，但由于細(xì)胞大多生長在孔內(nèi)，不利于直接對細(xì)胞進(jìn)行在線監(jiān)測和分析。以纖維素為基質(zhì)的多孔微載體主要應(yīng)用于通過培養(yǎng)CHO、BHK、NSO 和雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)重組產(chǎn)品和單克隆抗體。

2.3 明膠基質(zhì)微載體 明膠基質(zhì)微載體以交聯(lián)明膠蛋白為基質(zhì)，主要成分為豬源性明膠或牛源性明膠，具有生物相容性、多微孔、非剛性、無毒性、活性好、易降解、可回收的特點(diǎn)。較大的比表面積能滿足哺乳動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，對于貼壁依賴型細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)細(xì)胞均有較好的承載效果［31-32］。目前，以明膠作為基質(zhì)的市售商品有Cultispher-S微載體、Cultispher-G微載體和可溶性3DTableTrix微載體等，可用于研究和生產(chǎn)實(shí)踐。LUO等［33］采用明膠基質(zhì)可溶性3DTableTrix微載體在1 L 搖瓶培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)11 d內(nèi)擴(kuò)增了近500倍，達(dá)（1.05±0.11）×109個，通過溶解微載體收獲細(xì)胞產(chǎn)物，最終回收率為（98.6±0.1）%，不僅體現(xiàn)了工藝放大潛力，還引入了可溶解微載體，便于細(xì)胞和載體分離，簡化了細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng)工藝，具有良好的應(yīng)用前景。有研究采用6 g／L的3DTable-Trix微載片在4 L 生物培養(yǎng)體系中連續(xù)培養(yǎng)Vero 細(xì)胞1周，即可獲得較高密度的細(xì)胞（1×107個／mL）［32］。常彬等［34］采用Cultispher-G 微載體擴(kuò)增兔軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞可在短時間內(nèi)黏附于微載體表面并大量擴(kuò)增，將負(fù)載軟骨細(xì)胞的Cultispher 微載體與纖維蛋白膠直接復(fù)合用于修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，使組織工程軟骨構(gòu)建物具有更高質(zhì)量。

基于明膠基質(zhì)的大孔球狀微載體具有多孔性特點(diǎn)，比實(shí)心球狀微載體增加了培養(yǎng)表面積，下游通過溫和降解微載體細(xì)胞基本可以完全回收。明膠基質(zhì)為動物源性，可較真實(shí)地還原細(xì)胞的黏附生長，但引入了外源成分，對檢定提出更嚴(yán)格的要求，盡管如此，以明膠為基質(zhì)的微載體仍有望擴(kuò)展細(xì)胞培養(yǎng)種類和應(yīng)用領(lǐng)域。

2.4 聚苯乙烯微載體 聚苯乙烯微載體制備方法一般可分為兩大類：一類是以苯乙烯單體經(jīng)自由基加聚反應(yīng)合成的聚合物，并輔助特殊處理工藝得到大小均一穩(wěn)定顆粒；另一類是以高聚物為原料，通過化學(xué)或物理方式得到聚合物微球，表面覆蓋一些蛋白涂層或功能基團(tuán)。聚苯乙烯微載體是一類高性能無動物來源成分的微載體，具有聚苯乙烯芯材，無需進(jìn)行溶解或預(yù)溶脹操作，只需進(jìn)行無菌處理即可使用［35-36］。目前，用于研究的有Hillex、Plastic、Plastic Plus、Star-Plus、Biosilon等聚苯乙烯微載體產(chǎn)品［37］。

LOUBIèRE 等［38］比較了Hillex、Plastic Plus、Star-Plus和Cytodex1 4種不同微載體對（mesenchymal stem cell，MSC）附著效率、細(xì)胞擴(kuò)增性能和細(xì)胞分離程度的影響，結(jié)果表明，這些載體對MSC具有類似的附著和擴(kuò)展性能，Hillex、Plastic Plus 和Star-Plus載體上的細(xì)胞較Cytodex1 載體更易分離。CETINKAYA 等［39］分別采用PHEMA-PNIPAAm、Biosilon 微載體和Cytodex1 微載體按初始細(xì)胞密度1×105個／mL 于24 孔板靜態(tài)培養(yǎng)FCs，比較3 種微載體培養(yǎng)細(xì)胞的黏附、增殖和分化特性，培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞密度分別為5×105、6.8 × 105、1.4 × 106個／mL，表明FCs 細(xì)胞在3 種微載體上均可擴(kuò)增，但FCs 細(xì)胞自身的分化特性效率較低。Star-Plus 微載體已確定可用于培養(yǎng)CEF、ST、BT、P4RSF、MRC-5、KB、HFF、CHO、MDCK細(xì)胞，Plastic／Plastic Plus 微載體可用于培養(yǎng)Vero、ST、BT、P4RSF、MRC-5、KB、HFF、UMSCC、MDBK、CHO、MDCK、hMSC，SoloHill?微載體系列產(chǎn)品可用于人類和動物生物制品的商業(yè)化生產(chǎn)［40］。在易于擴(kuò)展的基于生物反應(yīng)器的培養(yǎng)系統(tǒng)中，聚苯乙烯基質(zhì)微載體在不影響細(xì)胞收獲效率的情況下可提高細(xì)胞附著和吸附性能，顯著促進(jìn)貼壁依賴型細(xì)胞生長。

2.5 聚乙烯基質(zhì)微載體 聚乙烯是乙烯單體進(jìn)行聚合反應(yīng)所得到的產(chǎn)物，具有良好的理化性質(zhì)，應(yīng)用范圍廣泛。聚乙烯基質(zhì)微載體由高密度聚乙烯聚合而成，目前，用于細(xì)胞培養(yǎng)的商業(yè)化產(chǎn)品有Cytoline 系列大孔微載體，Cytoline 主要組成部分是硅土和高密度聚乙烯。硅土經(jīng)處理攜帶負(fù)電荷，于聚乙烯整合形成帶負(fù)電荷的扁形大孔微載體。這種微載體同時具備聚乙烯特有的疏水性和硅土的親水性特點(diǎn)，在使用前一般需要用0.1 mol／L NaOH 溶液進(jìn)行修飾和優(yōu)化表面特征［41-42］。

KONG等［43］采用Cytoline微載體于2 L流化床生物反應(yīng)器中培養(yǎng)CHO 細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增長效率提高了約5.5 倍，表明多孔微載體表面積增加和細(xì)胞密切接觸的優(yōu)點(diǎn)可大幅提高細(xì)胞數(shù)量和生產(chǎn)效率。AYYILDIZ-TAMIS等［44］對Biosilon、Microhex、Cytodex 3、Cytoline 4 種微載體培養(yǎng)CHO 和Ag8 細(xì)胞效果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，培養(yǎng)12 d，細(xì)胞在微載體上均可實(shí)現(xiàn)有效增殖，Cytodex 3 和Cytoline 2 微載體在CHO-K1和Ag8 細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)中顯示出良好的規(guī)?；囵B(yǎng)潛力，表明Cytoline 通過其大孔結(jié)構(gòu)可促進(jìn)細(xì)胞高效黏附和規(guī)?；囵B(yǎng)。以聚乙烯為基質(zhì)的微載體（如Cytoline）在流化床灌注培養(yǎng)CHO 細(xì)胞應(yīng)用較多，也可用于培養(yǎng)貼壁和半貼壁細(xì)胞，生產(chǎn)單克隆抗體和重組蛋白等生物制品。

2.6 聚半乳糖醛酸基質(zhì)微載體 聚半乳糖醛酸微載體屬于一類新型可溶性微載體，由聚半乳糖醛酸通過Ca2+交聯(lián)形成多聚半乳糖醛酸聚合物，即水凝膠微載體。目前，用于細(xì)胞培養(yǎng)的商業(yè)化產(chǎn)品是Corning?新型可溶性微載體，包括兩類產(chǎn)品，一類是在載體表面包被變性膠原，另一類是在載體表面包被Corning?Synthemax?。可溶性微載體的降解可通過添加乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（螯合鈣離子使聚合物交聯(lián)不穩(wěn)定）、果膠酶（降解聚半乳糖醛酸聚合物）和細(xì)胞消化蛋白酶（分解細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)）進(jìn)行，在0.5 h內(nèi)完全溶解。

WEBER等［45］采用2 g／L的Corning?微載體在5 L生物反應(yīng)器中放大培養(yǎng)hMSC，培養(yǎng)4 d后，進(jìn)行溶解微載體及細(xì)胞回收，結(jié)果顯示，細(xì)胞數(shù)較初始細(xì)胞密度擴(kuò)增了近7 倍，回收效率為96%，細(xì)胞活性和狀態(tài)均可與種子細(xì)胞相當(dāng)。SCIBEK等［46］采用Corning?SynthemaxTM微載體培養(yǎng)hMSC，共培養(yǎng)7 d，每2～3 d更新1／2營養(yǎng)液，培養(yǎng)至第5天，細(xì)胞數(shù)達(dá)25 000個／cm2，擴(kuò)增近4倍，培養(yǎng)至第7天，細(xì)胞數(shù)達(dá)40 000個／cm2以上，擴(kuò)增近7倍，回收效率>90%。

以Corning?可溶性微載體為代表的聚半乳糖醛酸基質(zhì)載體具有可溶解性，較易將細(xì)胞與微載體分離，高透明度，可清晰觀察細(xì)胞形態(tài)，無熱原預(yù)包被，可增強(qiáng)細(xì)胞貼壁能力，為多種細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)展和收獲提供了新的解決方案。與多數(shù)傳統(tǒng)微載體比較，聚半乳糖醛酸基質(zhì)的微載體簡化了細(xì)胞收獲、分離和濃縮過程，適用于細(xì)胞治療、疫苗生產(chǎn)、大規(guī)模貼壁細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)和儲存，是值得研究和開發(fā)的新型微載體培養(yǎng)工藝［47-48］。

2.7 聚丙烯基質(zhì)微載體 聚丙烯是通過丙烯單體聚合形成的聚合物，聚丙烯基質(zhì)微載體由帶聚丙烯支架的聚酯網(wǎng)構(gòu)成基本骨架，與聚酯無紡纖維素經(jīng)高溫強(qiáng)力壓縮制成，結(jié)構(gòu)牢固，外觀以片狀結(jié)構(gòu)為主，便于發(fā)揮固定和支撐作用，在固定床式生物反應(yīng)器中應(yīng)用較多。目前，用于細(xì)胞培養(yǎng)的商業(yè)化產(chǎn)品有Eppendorf 公司的Fibra-Cel 片狀載體。

MEUWLY 等［49］采用Fibra-Cel 片狀載體在填充床生物反應(yīng)器中通過灌注模式高密度培養(yǎng)CHO 細(xì)胞，經(jīng)優(yōu)化填充床的高度，將細(xì)胞接種密度由初始6.1×107個／mL提高至1.2×108個／mL，生產(chǎn)效率提高約2 倍。有研究在制備臨床級第3 代慢病毒實(shí)驗(yàn)中，成功地將Fibra-Cel 片狀載體作為HEK293T 細(xì)胞大規(guī)模黏附貼壁培養(yǎng)的基質(zhì)，使病毒抗原和滴度最優(yōu)化［50］。ZHANG 等［51］比較了Cytodex1與Fibra-Cel微載體在7.5 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)MDCK-G1 細(xì)胞的效果，最高細(xì)胞密度分別達(dá)（5.03±0.12）×106和（1.02±0.69）×107個／mL，F(xiàn)ibra-Cel微載體優(yōu)于Cytodex1的培養(yǎng)效果，但不易放大。

Fibra-Cel 能維持細(xì)胞長時期的高密度生長灌流培養(yǎng)，避免堵塞風(fēng)險，減少細(xì)胞從最終產(chǎn)物中過濾，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)雜交瘤（DA4-4、123A、127A、GAMMA、67-9-B等），還可用于大規(guī)模培養(yǎng)3T3、COS、人骨肉瘤細(xì)胞、MRC-5、BHK、VERO、CHO、rCHO-tPA、rCHO-乙型肝炎表面抗原、HEK293、rHEK293、rC127-乙型肝炎表面抗原、正常人成纖維細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞及一些昆蟲細(xì)胞（Tn-368、SF9、rSF9、Hi-5等）。聚丙烯作為一種固體微載體支持基質(zhì)，供哺乳動物及昆蟲細(xì)胞生長，主要用于分泌產(chǎn)物（如重組蛋白及病毒）等的研究。

2.8 聚酯纖維基質(zhì)微載體 聚酯纖維微載體一般呈菱形或片狀扇葉型結(jié)構(gòu)，由高純度聚酯纖維經(jīng)高溫壓制而成，電鏡下觀察類似于樹枝分叉構(gòu)象。片狀載體具有多層張力結(jié)構(gòu)，攪拌剪切力和通氣產(chǎn)生的氣泡對細(xì)胞生長不產(chǎn)生影響，細(xì)胞生長類似于轉(zhuǎn)瓶的靜止?fàn)顟B(tài)，可保證培養(yǎng)基和細(xì)胞充分接觸，培養(yǎng)過程簡單，易于控制，是專門用于哺乳動物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的載體，高效的比表面積可為細(xì)胞的生長提供充足的表面積，讓細(xì)胞在一個立體空間中溫和生長傳代，同時維持各種營養(yǎng)物質(zhì)的良好交換，降低有害代謝產(chǎn)物的積累，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)［52］。上海楚鯤生物科技有限公司的DISKS 片狀載體和天信和（蘇州）生物科技有限公司的Cellcomb片狀載體均是以聚酯纖維為基質(zhì)，已應(yīng)用于臨床研究中規(guī)?；?xì)胞培養(yǎng)上游工藝。DISKS和Cellcomb片狀載體可用于培養(yǎng)VERO、CHO、BHK、MDCK、ST、MARC-145、MRC-5、SF9、HEK293、123A、127A、GAMMA及原代細(xì)胞等。

3 新型和傳統(tǒng)微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的比較

近年，可溶性多孔微載體、水凝膠微載體、藻酸鹽微載體、大孔肝素微載體、透明微載體、片狀微載體、3D 大孔微載體等多種新型微載體產(chǎn)品呈現(xiàn)快速發(fā)展的特點(diǎn)，且研究方向廣闊［53-56］。

可溶性多孔微載體常用于工業(yè)化培養(yǎng)hMSC，不僅保持了其免疫表型特征、三系分化潛能和基因組穩(wěn)定性，還使細(xì)胞具有低衰老表型跡象?？扇苄远嗫孜⑤d體消除了傳統(tǒng)微載體所需的繁瑣準(zhǔn)備工作，其可溶解性使細(xì)胞回收率達(dá)到較高水平［約（98.6±0.1）%］，顯示了其在工業(yè)化生產(chǎn)MSC 方面的巨大潛力［53］。多孔藻酸鹽微載體（porous alginate sphere microcarriers，PABs）引入了含有細(xì)胞／葡聚糖混合物和藻酸鹽（alginate，Alg）／聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）混合物，并由甲氧基聚乙二醇-牛血清白蛋白（methoxy-polyethylene glycol bovine serum albumin，MPEG-BSA）顆粒穩(wěn)定的雙水相（aqueous two-phase system，ATPS）乳液構(gòu)成。通過改變ATPS 乳液與PEG-Alg 溶液的乳化頻率和體積分?jǐn)?shù)，可控制PABs的孔徑大小。由于ATPS具有良好的生物相容性，細(xì)胞可直接包裹在相互連接的孔隙中。與傳統(tǒng)的Alg包裹的細(xì)胞比較，PABs 包裹的HeLa 細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞活性和增殖功能。PABs 被認(rèn)為是一種較有應(yīng)用前景的體外3D 細(xì)胞培養(yǎng)微載體，其基于聚合物／環(huán)糊精（cyclodextrins，CD）超分子體系的納米微載體廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如疏水脂肪族聚酯，其具有生物降解性，以聚乳酸和聚己內(nèi)酯為代表［57-62］。由聚異丙基丙烯酰胺（polyisopropylacrylamide，PNIPAM）、聚乙二醇雙丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEGDA）和明膠甲基丙烯酰（gelatin methacryloyl，GelMA）組成的互穿水凝膠網(wǎng)絡(luò)制成的多功能溫度響應(yīng)微載體，通過采用流聚焦微流控芯片可制備粒徑在100～300 μm范圍內(nèi)、粒徑分布均勻（多分散度指數(shù)≈0.08）的微載體，可通過改變組合物-水凝膠組合物來調(diào)整多功能溫度響應(yīng)性微載體Cytogel的力學(xué)性能和細(xì)胞黏附性能，表明微載體具有將生長因子局部傳遞至細(xì)胞表面方面的潛在用途［63］。

傳統(tǒng)微載體一般以固相化介質(zhì)為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定支撐，僅用于滿足細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，但培養(yǎng)下游細(xì)胞與微載體不易分離，對細(xì)胞產(chǎn)品的回收存在浪費(fèi)，這是微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝普遍需要解決的問題，也是新型微載體開發(fā)的方向［64］。與傳統(tǒng)微載體比較，新型微載體既滿足細(xì)胞高效貼附生長，使細(xì)胞具有更強(qiáng)細(xì)胞活性，又能簡化細(xì)胞分離工藝，為下游細(xì)胞產(chǎn)品收獲提供極高的回收率，達(dá)到提質(zhì)增效，降低生產(chǎn)成本，減少細(xì)胞污染的效果［65］。

4 小結(jié)與展望

微載體細(xì)胞培養(yǎng)工藝是最具前景的動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝開發(fā)方向之一，已有多項(xiàng)研究探討改善微載體細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞附著和分離，增強(qiáng)細(xì)胞的附著性，識別影響微載體表面特性的因素，在微載體上引入各種表面涂層及優(yōu)化操作參數(shù)等問題［66-68］。

可溶性、大孔性、球形或片狀、易溶解或易降解的微載體研究開發(fā)可能是今后微載體發(fā)展的方向，需要解決的問題是如何創(chuàng)造一個仿生微環(huán)境以滿足細(xì)胞在微孔間高效黏附、優(yōu)良生長和下游細(xì)胞的分離回收。持續(xù)改進(jìn)基于微載體的細(xì)胞培養(yǎng)放大工藝仍是科研工作者普遍關(guān)心的課題。隨著生物新材料的興起和快速發(fā)展，微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)得到深入研究，有望進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。