囊狀幼蟲病病毒衣殼蛋白肝素結(jié)合基序鑒定及其抗感染作用分析

沈克飛，曹蘭，徐登峰，許國洋，楊金龍，羅文華

重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460

囊狀幼蟲病病毒（sacbrood virus，SBV）是危害蜜蜂健康的昆蟲小RNA 樣病毒（picorna-like virus），在全球普遍流行［1-4］。SBV最早發(fā)現(xiàn)并流行于西方蜜蜂（Apis mellifera）中，1972年首先在我國廣東引發(fā)中華蜜蜂（A.c.cerana）暴發(fā)囊狀幼蟲病，并迅速傳播至全國其他地區(qū)［5］。SBV主要危害蜜蜂幼蟲，導(dǎo)致幼蟲代謝紊亂和組織損傷，甚至不能發(fā)育成蛹而死亡［6］，富含SBV顆粒的脫皮液集聚在未脫落的幼蟲皮膚下，形成囊狀。

SBV 整個(gè)基因組只有1 個(gè)開放閱讀框架（open reading frame，ORF），編碼1條多聚蛋白（polyprotein）。多聚蛋白在病毒編碼的蛋白酶作用下，氨基端剪切、加工產(chǎn)生成熟的衣殼蛋白，組裝成病毒顆粒［5］。SBV無囊膜，衣殼蛋白暴露于病毒表面，是與宿主發(fā)生相互作用的主要病毒成分［7］。SBV衣殼蛋白含有小RNA病毒衣殼蛋白藥物結(jié)合口袋（drug-binding pocket）結(jié)構(gòu)域（domain）［8］。

氨基葡聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是病原體的主要靶點(diǎn)，病原體幾乎在所有感染和發(fā)病過程中均使用GAG 來促進(jìn)黏附和侵入宿主細(xì)胞［9-12］。GAG是包含肝素在內(nèi)的一類陰離子線性多糖，普遍存在于動(dòng)物細(xì)胞表面［11］。病原體與GAG結(jié)合主要涉及病原體表面蛋白柔性環(huán)上的R 和K 及與其臨近的疏水性氨基酸，柔性環(huán)上帶正電荷的堿性氨基酸簇與帶負(fù)電荷的GAG 通過形成離子鍵而結(jié)合，柔性環(huán)上與堿性氨基酸臨近的疏水性氨基酸側(cè)鏈和糖鏈上非極性基團(tuán)間的相互作用有助于維持結(jié)合的穩(wěn)定性［13-15］。阻斷病原體結(jié)合GAG 可能阻斷感染發(fā)生。目前對SBV-GAG 相互作用的認(rèn)識(shí)有限，防治囊狀幼蟲病的有效手段也很有限。闡明SBV-GAG 相互作用，對于基于此作用開發(fā)治療藥物具有重要意義。

本研究旨在鑒定SBV 藥物結(jié)合口袋蛋白2（drugbinding pocket protein 2，Dbpp2）的肝素結(jié)合基序（heparin-binding motif），并測定該基序肽及其衍生肽的抗SBV 感染活性，以期為闡明SBV-GAG 相互作用奠定基礎(chǔ)及基于此相互作用開發(fā)治療SBV 感染的多肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、菌株及質(zhì)粒 SBV樣品［8］和大腸埃希菌K88菌株由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所提供；表達(dá)載體pGEX-4T-1 和大腸埃希菌BL21（DE3）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 肝素瓊脂糖珠購自北京索萊寶科技有限公司；肝素和弗氏佐劑購自美國Sigma-Aldrich 公司；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體購自美國EarthOx 公司；硝酸纖維素膜購自德國Merck Milli-pore 公司；Gluthathione-Sepharose 4B 和還原性谷胱甘肽購自美國GE Healthcare公司；Quick Start Bradford 購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；BCIP／NBT 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；由L 型氨基酸組成的肝素結(jié)合基序及其衍生肽由無錫邁默拓普生物科技有限公司采用化學(xué)法合成（純度大于95%）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級昆明小鼠，雌性，6 ~ 8 周齡，體質(zhì)量約為25 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2019-0008；健康伊普呂兔，雌性，60 日齡，體質(zhì)量約2 kg，購自重慶某規(guī)模化兔場；中蜂蜂群為重慶市畜牧科學(xué)院自養(yǎng)蜂群。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照重慶市畜牧科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行（cqaa2022063）。

1.4 序列分析 以SBV-CQ（GenBank登錄號：KJ716806）為參考毒株［7］，藥物結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)域及其兩翼（398~702 位氨基酸）序列作為研究靶標(biāo)，命名為Dbpp2。使用在線軟件對序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（http：／／www.detaibio.com／tools／chou-fasman-forecast.html）和同源建模（https：／／www.expasy.org／resources／swissmodel），搜索位于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象表面的柔性環(huán)，查找堿性氨基酸及與其臨近的疏水性氨基酸，以搜索肝素結(jié)合基序。

1.5 重組蛋白及其抗血清的制備 將肝素結(jié)合基序KPANRPRR 中的氨基酸進(jìn)行替換，設(shè)計(jì)Dbpp2 的突變體Dbpp21（R290G）、Dbpp22（R290G + R292G）、Dbpp23（R290G+R292G+R293G）和Dbpp24（N289R）。根據(jù)大腸埃希菌密碼子偏好性優(yōu)化Dbpp2 及其突變體的編碼基因。在基因的5'和3'端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。采用化學(xué)合成法合成基因，通過BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)將基因克隆至pGEX-4T-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21（DE3），構(gòu)建重組菌株?；蚝铣伞⒅亟M質(zhì)粒和重組菌株的構(gòu)建均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將重組菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)至菌體濃度（A600）約為1時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol／L的IPTG，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)3h；培養(yǎng)物4 ℃，5 000×g離心10 min，收集菌體沉淀，每100 mL 培養(yǎng)液加入20 mL PBS（0.1 mol／L，pH 7.2），懸浮菌體，冰水浴中超聲（超聲功率為300 W，工作4 s，間歇5 s）破碎15 min；加入終濃度1% Trition X-100，4℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育30 min；5 000 ×g離心30 min，收集上清，每20 mL加入300 μL Gluthathione-Sepharose 4B，4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育1h；PBS洗滌3次后，用10 mmol／L 還原型谷胱甘肽洗脫。將純化的重組蛋白Dbpp2免疫小鼠制備抗血清，按文獻(xiàn)［16］方法操作。使用Tris-HCl（0.02 mol／L，pH 8.0）對純化的重組蛋白進(jìn)行透析，采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.6 SBV 提取 取出-80 ℃保存的SBV 感染的病死幼蟲樣品，加入5 倍體積的Tris-HCl（0.02 mol／L，pH 8.0）或PBS（0.01 mol／L，pH 7.2~7.4），充分研磨；加入1／2 體積氯仿，充分振蕩；4 ℃，12 000 ×g離心10 min，取上清，用1／2 體積氯仿重復(fù)處理，直至上清澄清。

1.7 SBV 與肝素的結(jié)合能力檢測 取肝素瓊脂糖珠混懸液，用預(yù)冷的Tris-HCl溶液洗滌3次，用Tris-HCl溶液溶解肝素。將不同濃度肝素（152 μL）分別與肝素瓊脂糖珠（10 μL）、Tris-HCl-氯仿抽提的病毒（18 μL）一起加入1.5 mL離心管中，混勻，肝素濃度依次為0、10、30、90 mg／mL，4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)孵育1 h；4 ℃，3 000×g離心5 min，肝素瓊脂糖珠沉淀用200 μL 預(yù)冷Tris-HCl 溶液洗滌3 次，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min。樣品經(jīng)12%SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST洗滌3 次，加入小鼠抗Dbpp2 抗血清（1∶500 稀釋），室溫孵育1 h；TBST 洗滌3 次，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶4 000 稀釋），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，在BCIP／NBT溶液中顯色。

1.8 Dbpp2與肝素的結(jié)合能力檢測 將肝素瓊脂糖珠（30 μL）、Dbpp2（0.3 mg／mL，30 μL）及不同濃度的肝素溶液（150 μL）一起加入1.5 mL離心管中，充分混勻，肝素濃度依次為0、10、20、30、40、50、60、70 mg／mL，4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)孵育1 h；4 ℃，3 000×g離心5 min，肝素瓊脂糖珠沉淀用200 μL 預(yù)冷Tris-HCl 溶液洗滌3次，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，12%SDS-PAGE分析Dbpp2與肝素的結(jié)合能力。

1.9 肝素結(jié)合基序鑒定 將30 μL 肝素瓊脂糖珠與1 mg／mL Dbpp2 或Dbpp2 突變體混合，4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)孵育1 h；4 ℃，3 000×g離心5 min，肝素瓊脂糖珠沉淀用200 μL預(yù)冷Tris-HCl溶液洗滌3次，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，12%SDS-PAGE分析Dbpp2突變體與肝素結(jié)合能力。

1.10 肝素結(jié)合基序?qū)bpp2結(jié)合肝素能力的抑制作用檢測 將肝素瓊脂糖珠（30 μL）、Dbpp2（0.3 mg／mL，30 μL）及不同濃度的肝素結(jié)合基序溶液（30 μL）一起加入1.5 mL離心管中，充分混勻，肝素結(jié)合基序多肽濃度依次為1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100mmol／L，4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)孵育1 h；4 ℃，3 000×g離心5 min，肝素瓊脂糖珠沉淀用200 μL 預(yù)冷Tris-HCl 溶液洗滌3次，加入上樣緩沖液，沸水浴10 min，12%SDS-PAGE分析多肽抑制Dbpp2結(jié)合肝素的能力。

1.11 多肽溶血活性測定 采用EDTA真空采血管通過心臟穿刺法采集伊普呂兔血液3 mL，1 000×g離心15 min，棄去上層血漿和白細(xì)胞，下層紅細(xì)胞加入PBS充分混勻，1 000×g離心15 min，棄上清。如此重復(fù)3 次后，用PBS 配制成體積分?jǐn)?shù)為2%的兔紅細(xì)胞混懸液，置于4 ℃?zhèn)溆?。用PBS溶解肝素結(jié)合基序及其衍生肽，配制成1 mmol／L溶液，倍比稀釋（20~2-10）。將50 μL不同濃度的多肽溶液與50 μL兔紅細(xì)胞懸液在微量凝集板孔中混勻，37 ℃靜置30 min，觀察多肽的溶血活性。

1.12 多肽抑菌活性測定 用PBS 溶解肝素結(jié)合基序KPANRPRR及其衍生肽KPAARPRR、KPRNRPRR、KPRARPRR、KPRWRPRR、KPRWRPRRW，配制成1 mmol／L溶液。將滅菌的營養(yǎng)瓊脂倒入平皿，待凝固后將牛津杯（直徑為8 mm）立于其上，再向平皿倒入含1 × 106CFU／mL 大腸埃希菌K88 菌株的營養(yǎng)瓊脂，待凝固后取出牛津杯，將多肽溶液分別加入孔中，200 μL／孔，4 ℃擴(kuò)散1 h；再37 ℃培養(yǎng)16~18 h，觀察抑菌圈直徑大小。

1.13 多肽抗感染作用測定 攻毒前測定蜂群幼蟲死亡率［17］：攻毒前18 d 用透明薄膜（30 cm × 50 cm）對仔脾上有幼蟲或卵的巢房進(jìn)行定位、標(biāo)記和計(jì)數(shù)，數(shù)量記為A；9 d 后將標(biāo)記的薄膜對準(zhǔn)位置貼在原來的巢脾上，查看標(biāo)記的巢房是否封蓋、封蓋是否有穿孔，將未封蓋或封蓋有穿孔的巢房用另一種顏色標(biāo)記和計(jì)數(shù)，數(shù)量記為B；計(jì)算蜂群幼蟲死亡率（B／A×100%）。選擇群勢相當(dāng)、幼蟲死亡率小于5%的蜂群用作攻毒蜂群和健康對照蜂群。取5 mL經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾的PBS-氯仿抽提的SBV 溶液，加入1 000 mL 糖水（按白砂糖與水質(zhì)量比1∶1.2配制）中，充分混勻，即為病毒液。將病毒液在傍晚時(shí)分噴灑于攻毒蜂群巢脾雙面，每巢脾50 mL，連續(xù)噴灑病毒液3 d。于攻毒后第9 天計(jì)算幼蟲死亡率，發(fā)病蜂群用于肝素結(jié)合基序及其衍生肽的抗感染檢測。每個(gè)多肽隨機(jī)分配3群蜂，每群蜂五足框。于檢查當(dāng)日傍晚給蜂群飼喂含1 mg／L 多肽的糖水，健康對照組和不給藥對照組飼喂糖水，每群每次飼喂200 mL，隔日飼喂1次，連續(xù)9 次。第1 次給藥后第18 天計(jì)算蜂群幼蟲死亡率及蜂群幼蟲死亡降低率。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件中單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 序列分析 Dbpp2 共有22R 和13K，R 和K 堿性氨基酸含量為11.5%（35／305）（圖1A）。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源建模結(jié)果，Dbpp2的C-端存在1個(gè)暴露在表面的富含堿性氨基酸的柔性環(huán)，環(huán)內(nèi)分布著與堿性氨基酸臨近的疏水性氨基酸，可能是肝素結(jié)合基序（圖1B）。其他SBV毒株也存在該基序。

圖1 Dbpp2 GAG結(jié)合基序預(yù)測Fig.1 Prediction of GAG-binding motifs in Dbpp2

2.2 SBV與肝素的結(jié)合能力 在90 mg／mL范圍內(nèi)，隨著肝素濃度的增加，SBV 與肝素瓊脂糖珠的結(jié)合量呈下降趨勢，呈良好的劑量依賴關(guān)系，見圖2。

圖2 肝素對SBV結(jié)合肝素瓊脂糖珠的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of heparin on SBV binding to heparin agarose beads

2.3 Dbpp2與肝素的結(jié)合能力 隨著肝素濃度從0提高至70 mg／mL，肝素瓊脂糖珠結(jié)合的Dbpp2 量逐漸下降，見圖3。

圖3 Dbpp2結(jié)合肝素分析Fig.3 Analysis of Dbpp2 binding to heparin

2.4 肝素結(jié)合基序鑒定 相對于Dbpp2，突變體與肝素的結(jié)合能力發(fā)生了變化。影響Dbpp2 與肝素結(jié)合能力的氨基酸殘基有R290、R292、R293，將其替換成G 會(huì)導(dǎo)致Dbpp2 與肝素的結(jié)合能力降低；將N289 替換成R提高了Dbpp2與肝素的結(jié)合能力。見圖4。表明KPANRPRR 是Dbpp2 結(jié)合肝素的關(guān)鍵基序，基序中的R在Dbpp2結(jié)合肝素上發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

圖4 Dbpp2及其突變體與肝素的結(jié)合能力分析Fig.4 Analysis of binding ability of Dbpp2 and its mutants to heparin

2.5 肝素結(jié)合基序?qū)bpp2結(jié)合肝素能力的抑制作用 隨著KPANRPRR 濃度從1 × 10-3mmol／L 提高至1 × 100mmol／L，肝素瓊脂糖珠結(jié)合的Dbpp2 量逐漸下降，見圖5。表明KPANRPRR 能抑制Dbpp2結(jié)合肝素。

圖5 肝素結(jié)合基序抑制Dbpp2結(jié)合肝素的能力Fig.5 Heparin-binding motif inhibiting ability of Dbpp2 binding to heparin

2.6 肝素結(jié)合基序及其衍生肽的溶血活性 肝素結(jié)合基序KPANRPRR 及其衍生肽KPAARPRR、KPRNRPRR、KPRARPRR、KPRWRPRR、KPRWRPRRW 均有溶血活性，見圖6。

圖6 多肽溶血活性測定Fig.6 Determination of peptide hemolytic activity

2.7 肝素結(jié)合基序及其衍生肽的抑菌活性 除KPANRPRR 無明顯抑菌活性外，其他多肽均有抑菌活性，抑菌活性由小到大依次為KPAARPRR、KPRNRPRR、KPRARPRR、KPRWRPRR、KPRWRPRRW，見圖7。

圖7 多肽抑菌活性測定Fig.7 Determination of antibacterial activity of peptides

2.8 肝素結(jié)合基序及其衍生肽的抗感染作用 攻毒后第9 天，健康蜂群的病情指數(shù)等級無改變，攻毒蜂群發(fā)病。在18 d 給藥過程中，健康蜂群和不給藥蜂群的病情指數(shù)等級無改變。經(jīng)18 d 的治療處理，多肽給藥組蜂群幼蟲死亡率較不給藥組顯著降低（P均< 0.01），KPRARPRR 給藥組幼蟲死亡降低率為65.40%。見表1。表明KPRARPRR 對中蜂囊狀幼蟲治療效果最好。

表1 多肽對SBV感染中蜂幼蟲死亡率的影響（%）Tab.1 Effect of peptides on mortality of A.c.cerana larvae infected with SBV（%）

3 討論

SBV衣殼由主要衣殼蛋白VP1、VP2和VP3組成，衣殼蛋白可根據(jù)相對分子質(zhì)量大小從最大亞基VP1到最小亞基VP4 進(jìn)行命名，也可根據(jù)衣殼蛋白與小RNA 病毒蛋白的同源性進(jìn)行命名，但各衣殼蛋白在多聚蛋白中的精確氨基酸剪切位點(diǎn)目前仍存在爭議［5，18］。SBV 病毒粒子的晶體學(xué)研究指出，SBV 衣殼蛋白N-端位于衣殼內(nèi)部，C-端暴露在病毒表面；病毒粒子表面還附著包含60個(gè)拷貝的小衣殼蛋白（minor capsid protein，MiCP）［18］。MiCP通過引入病毒蛋白酶的剪切位點(diǎn)而從相對分子質(zhì)量最大的衣殼蛋白VP3的C-端外側(cè)剪切而來，多聚蛋白的Q428~S708區(qū)域?yàn)橐職さ鞍譜P3，S708 ~ Q756 區(qū)域?yàn)镸iCP［18］，這兩個(gè)區(qū)域?qū)?yīng)于SBV-CQ 部分多聚蛋白的408~688 和689 ~ 719 位氨基酸區(qū)域。VP3 的C-端和MiCP 位于病毒表面，可能參與SBV 受體識(shí)別。對應(yīng)于SBV-CQ部分多聚蛋白的429 ~ 739 位氨基酸區(qū)域被證實(shí)與宿主細(xì)胞熱休克蛋白70 同源物5（heat shock protein 70 cognate 5，Hsp70-c5）存在相互作用［7］。本研究以Dbpp2（即SBV-CQ 部分多聚蛋白的398~702位氨基酸區(qū)域）為研究對象，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及同源建模結(jié)果，Dbpp2的C-端存在1個(gè)暴露在表面的富含堿性氨基酸的柔性環(huán)（KPANRPRR），環(huán)內(nèi)分布著與堿性氨基酸臨近的疏水性氨基酸，提示該環(huán)可能是GAG黏附基序。

GAG 包含多種分子，在動(dòng)物組織內(nèi)的分布存在差異［19］，病原體可能利用一種GAG 分子作為黏附受體而實(shí)現(xiàn)感染［10］。肝素瓊脂糖珠是一種可方便購買的商品化試劑，其最常用的上樣緩沖液和平衡緩沖液為Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液。為利用肝素瓊脂糖珠檢測SBV、Dbpp2與肝素結(jié)合的能力，先用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液浸取病死幼蟲樣品中的SBV，或用Tris-HCl（pH 8.0）緩沖液對純化的重組蛋白進(jìn)行透析處理，以避免樣品中的離子對肝素結(jié)合產(chǎn)生干擾。SBV為無囊膜病毒，氯仿對其活性無影響［20］。本研究結(jié)果顯示，SBV、Dbpp2可結(jié)合肝素，Dbpp2柔性環(huán)（KPANRPRR）上的R290、R292、R293 對Dbpp2 結(jié)合肝素具有重要作用，KPANRPRR是Dbpp2的肝素結(jié)合基序。

在過去的10 多年間，SBV 在重慶等地流行導(dǎo)致中蜂發(fā)?。?7，21］，給蜂業(yè)健康發(fā)展和蜂農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益造成損失。盡管已通過更換蜂王、RNAi、藥用植物提取物等防治SBV 感染，但這些方法仍有局限性，制劑未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化［22］。具有生物活性和安全特性的多肽能有效治療SBV 感染，為保障蜜蜂健康提供了可供選擇的治療措施［17］。病原體通過結(jié)合GAG 而促進(jìn)黏附宿主細(xì)胞已被證明，針對病原體GAG 的相互作用開發(fā)阻斷病原體侵入細(xì)胞的預(yù)防和治療藥物是一個(gè)新的研究領(lǐng)域，抗菌肽（antibacterial peptide）和抗病毒肽（antiviral peptides）是其中的重要方向［23-26］。本研究結(jié)果表明，肝素結(jié)合基序KPANRPRR 能劑量依賴性地抑制Dbpp2 結(jié)合肝素，KPANRPRR 與抗菌肽、抗病毒肽類似，具有膜干擾活性。陽離子抗菌肽或抗病毒肽富含疏水氨基酸和堿性氨基酸，對抗微生物活性特別重要的是K、R，這些氨基酸也普遍存在于有膜干擾活性的蛋白質(zhì)或肽中，這類分子可自發(fā)穿過脂質(zhì)膜［27-28］。據(jù)此，本研究對KPANRPRR 進(jìn)行氨基酸殘基替換或添加，觀察到KPANRPRR 及其衍生肽的體外抑菌活性與溶血活性呈正相關(guān)，可見多肽抑菌活性與膜干擾活性呈正相關(guān)。肽的膜干擾活性與肽-脂質(zhì)膜的相互作用有關(guān)。肽通過多種機(jī)制吸附在脂質(zhì)膜上或插入脂質(zhì)膜，或促進(jìn)膜溶解、滲透，或附著在較大的膜蛋白上，或自聚集而形成孔［27］。多肽抗病毒感染機(jī)制與多肽抗菌機(jī)制不同，多肽抗病毒感染主要通過與宿主細(xì)胞受體相互作用以阻止病毒黏附或侵入宿主細(xì)胞［25，29］。因此，在抗病毒感染多肽研究中尤其需要考慮多肽對宿主細(xì)胞膜的損傷作用。將KPANRPRR 中的A3 替換成R，N4 替換成A、W，可見衍生肽的溶血活性提高。表明多肽膜干擾活性與多肽堿性氨基酸、含大側(cè)鏈基團(tuán)的疏水性氨基酸的組成有關(guān)。在治療SBV 感染的中蜂幼蟲試驗(yàn)中，溶血活性居中的KPRARPRR 相對于其他多肽治療效果最佳。提示抗病毒多肽研究需特別關(guān)注多肽的氨基酸組成設(shè)計(jì)及其膜損傷能力。本研究基于SBV 肝素結(jié)合基序設(shè)計(jì)衍生肽，篩選出有更高抗感染效果的多肽，為利用SBV-GAG 相互作用設(shè)計(jì)篩選有潛在防治價(jià)值的多肽提供了參考。