銀柴胡組培快繁研究進展※

●李天順 代曉華 （寧夏大學農(nóng)學院 寧夏 銀川 750000）

銀柴胡為石竹科植物銀柴胡（Stellaria dichotomaL? var? lanceolata Bge?）的干燥根，屬寧夏道地藥材，富含甾醇類﹑環(huán)肽類﹑黃酮類﹑生物堿類﹑酚酸類﹑揮發(fā)類等物質(zhì)。銀柴胡有清虛熱﹑除疳熱的功效。研究發(fā)現(xiàn)，銀柴胡不僅具有清熱涼血功能，還具有抗炎﹑治療過敏性疾病﹑擴張血管等作用[1-3]?，F(xiàn)國內(nèi)多地進行了銀柴胡的人工栽培，如寧夏﹑內(nèi)蒙古﹑陜西等，其中寧夏為銀柴胡種植大區(qū)。

現(xiàn)階段人工栽培銀柴胡產(chǎn)業(yè)主要存在種源混雜[4-6]﹑種子質(zhì)量參差不齊﹑種子繁殖受環(huán)境影響大﹑產(chǎn)量低﹑品質(zhì)差[7]等問題。為減少銀柴胡種子繁殖及種質(zhì)資源混雜對產(chǎn)量﹑質(zhì)量的影響，以改變繁殖方式來縮短栽培年限，加快育苗速度，規(guī)范種植標準，近年來已開始對銀柴胡的組織培養(yǎng)進行研究。植物組織培養(yǎng)可以使用從母體上采集的根﹑莖﹑葉等器官作為材料進行大規(guī)模快速繁殖，從而有效解決種子繁殖發(fā)芽率低﹑受外界環(huán)境影響大等問題。植物組織培養(yǎng)屬于無性繁殖，新生植株可保留母體的優(yōu)良性狀，從種源層面解決種質(zhì)退化﹑種子質(zhì)量參差不齊﹑不同品種性狀不一等問題。銀柴胡組織培養(yǎng)研究相較于其他組培研究起步較早的植物還處于初期階段。

1 銀柴胡的快繁途徑

藥用植物的快繁途徑一般分為三類：第一類，器官直接發(fā)生，即直接由離體的莖﹑葉﹑腋芽等組織器官上產(chǎn)生再生植株；第二類，器官間接發(fā)生，即先由離體的組織器官先誘導產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織間接誘導產(chǎn)生芽﹑根，最終產(chǎn)生再生植株；第三類，體細胞胚胎發(fā)生，即由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的與正常受精卵發(fā)育類似的胚胎結(jié)構(gòu)，經(jīng)過合適環(huán)境培養(yǎng)生成再生植株[8]。

姚寧等[9]通過器官直接發(fā)生型途徑成功建立了銀柴胡植株再生體系，該研究以銀柴胡莖節(jié)為材料，通過添加植物生長調(diào)節(jié)劑直接誘導其分化出不定芽與不定根，最終獲得再生植株。而吳曉玲等[10]和胡海英等[11]基于器官間接發(fā)生型途徑對銀柴胡組培快繁進行研究，結(jié)果暫時停滯于外植體誘導愈傷組織﹑愈傷組織誘導毛狀根這一階段，未見后續(xù)報道。此外，體細胞發(fā)生型途徑的研究仍處于懸浮細胞培養(yǎng)階段[12-13]，尚未有通過此途徑成功建立再生植株體系的研究結(jié)果?，F(xiàn)有研究中，只有器官直接發(fā)生型途徑能通過外植體產(chǎn)生再生植株，其他途徑仍處于探索階段，但該研究還處于初代培養(yǎng)階段，未進行繼代快繁與大田推廣實踐，所以當下銀柴胡主流繁殖方式仍為種子繁殖。

2 影響銀柴胡組織培養(yǎng)的因素

2.1 外植體的選擇

植物細胞在合適的條件下表現(xiàn)出細胞的全能性，即單個植物細胞具有能發(fā)育成為完整植株的潛力。外植體的選擇對于藥用植物的組培再生體系的建立十分關(guān)鍵，不同的取材部位﹑生理狀態(tài)﹑材料大小等因素，均會對培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生直接影響。在近年銀柴胡同科或同類藥材的組培快繁研究中，韋瑩等[14]在短瓣石竹莖段誘導及植株再生研究中選擇當年生1?0～1?5 cm的帶芽幼嫩莖段作為外植體；趙晶[15]在甘草組織快繁技術(shù)及次生代謝產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)，無菌苗的下胚軸是誘導甘草愈傷組織的最佳外植體；而葉片作為最容易獲得的外植體，其取材不受生長時間與季節(jié)的限制且采摘葉片對于母株的傷害較小，經(jīng)常被用于人參﹑花毛茛等植物的組織培養(yǎng)中[16-17]。

研究表明[18]，石竹科植物的組培外植體一般為莖尖﹑莖段﹑葉片﹑花瓣。莖尖可以通過器官直接發(fā)生﹑器官間接發(fā)生兩種途徑建立再生體系；莖段可通過器官間接發(fā)生﹑體細胞胚胎發(fā)生兩種途徑建立再生體系；葉片可通過器官直接發(fā)生﹑器官間接發(fā)生﹑體細胞胚胎發(fā)生三種途徑建立再生體系，花瓣僅可通過直接誘導不定芽獲得再生植株。從誘導能力﹑發(fā)生途徑﹑獲取難度等因素綜合考量，莖段﹑葉片是銀柴胡組培快繁的理想外植體，這也符合銀柴胡組培相關(guān)研究的結(jié)論，即可由莖節(jié)直接誘導生成不定芽與不定根，最終形成再生植株[9]，也可由幼葉誘導形成愈傷組織生成不定根與銀柴胡細胞[10-13]。

2.2 外植體消毒

微生物引起的污染問題是制約當前植物組培成功的重要因素，精準高效的消毒措施能確保外植體在組培過程中不被污染，提高成功率[19]。

銀柴胡等藥用植物的消毒方法一般為多種藥劑交替浸泡法，該方法可有效殺滅外植體表面的微生物，降低污染率。步驟為：將外植體用洗潔精洗凈后置于流動清水中沖洗1～2 h，再使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液在無菌環(huán)境下對其進行浸泡消毒。

姚寧等[9]研究表明，先將銀柴胡種子流水沖洗2 h，然后用75%酒精處理1 min，再用15%NaClO溶液處理10 min效果最好，污染率僅為 3?37%，萌發(fā)率為 97?15%。吳曉玲[10]則使用肥皂水清洗銀柴胡幼葉后，用蒸餾水沖洗干凈，然后用75%酒精浸泡10～15 s，無菌水沖洗4～5遍，最后用0?1%HgCl2溶液浸泡7～8 min，無菌水沖洗4～5遍完成消毒。

由于外植體的種類﹑抗性不同，因此，在使用NaClO﹑75%酒精﹑HgCl2等溶液進行消毒的過程中，應(yīng)有針對性地控制溶液濃度及消毒時間。時間過長﹑濃度過高均會導致外植體受損或積累過多的重金屬，降低組培成功率；時間過短﹑濃度過低則會導致外植體消毒不徹底，提高感染率。

2.3 培養(yǎng)基的作用

培養(yǎng)基可為外植體生長發(fā)育提供所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，由于不同的植物種類﹑外植體類型﹑誘導目標所需的營養(yǎng)成分有所差異，所以選用合適的培養(yǎng)基是植物組培成功的關(guān)鍵因素[20]。

培養(yǎng)基中氮源可以直接影響外植體的生長發(fā)育，Paek等[21]在MS培養(yǎng)基中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮比例對人參不定根的影響研究中發(fā)現(xiàn)，低銨態(tài)氮與高硝態(tài)氮比例對人參不定根的生長有促進作用。岳建華等[22]對蔗糖濃度對百子蓮體胚成熟效果的研究中發(fā)現(xiàn)：碳源（蔗糖）是顯著影響百子蓮體胚成熟誘導效果的因素之一。此外，其他元素的添加，也對組培結(jié)果有影響。田鵬瑋[23]在人參懸浮細胞為材料對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)，適當提高培養(yǎng)基中磷酸根與鈣離子的濃度可以提高其有效成分的積累。添加瓊脂也會對組培結(jié)果有一定的影響，因為瓊脂的雜質(zhì)﹑吸水率﹑凝固硬度等特性可能會促進或抑制外植體的生長發(fā)育。

目前，銀柴胡的組培快繁一般使用無機鹽和離子濃度較高﹑離子平衡較為穩(wěn)定的MS培養(yǎng)基﹑1/2MS培養(yǎng)基。姚寧等[9]在銀柴胡植株再生體系中，使用MS為基本培養(yǎng)基誘導莖節(jié)產(chǎn)生不定芽，誘導率為100%；以1/2MS為基本培養(yǎng)基誘導不定芽生根，生根率為90%；在對銀柴胡組培研究中，使用MS為基本培養(yǎng)基誘導葉片產(chǎn)生愈傷組織，并發(fā)現(xiàn)磷酸鹽（KH2PO4）含量為255 mg/L時，更有利于銀柴胡細胞的懸浮培養(yǎng)[10-11，13]，這一結(jié)論也與上文中結(jié)論相互印證。

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑的影響

不同的植物生長調(diào)節(jié)劑對植物發(fā)育方向起著重要的控制作用，在銀柴胡器官間接發(fā)生型途徑建立再生體系的過程中，誘導愈傷組織較為容易，但由愈傷組織分化為不定芽則暫無成功報道。而控制愈傷組織形成與分化的關(guān)鍵因素就是細胞分裂素與生長素的配比，吳曉玲等[10]在對銀柴胡愈傷組織誘導技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)：MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（1?0 mg/L）+2,4-D（1?0 mg/L）是誘導銀柴胡愈傷組織的最佳培養(yǎng)基配方。

而相較于間接誘導途徑，更為高效﹑簡便的器官直接發(fā)生途徑已建立起一套較為完整的再生體系。姚寧等[9]以莖節(jié)為外植體材料建立植株再生體系的研究表明，不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA（1?5 mg/L），誘導率為100%，誘導不定芽生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA（0?3 mg/L）+IBA（0?5 mg/L），生根率為90%。

同樣，在體細胞胚胎發(fā)生型途徑建立銀柴胡再生體系的過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑的作用十分顯著。吳曉玲等[12]在研究植物生長調(diào)節(jié)劑對銀柴胡細胞生長特性的影響中表明，培養(yǎng)基為MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（1?0 mg/L）+2,4-D（1?0 mg/L）時，培育細胞的鮮重﹑干重﹑細胞數(shù)目均較高，該培養(yǎng)液還可有效增強銀柴胡細胞的硝酸還原酶的活性，提高氮素的利用率。而培養(yǎng)基為 MS+6-BA（1?0 mg/L）+NAA（0?5 mg/L）時，有利于增強銀柴胡細胞中過氧化氫酶的活性。

2.5 培養(yǎng)環(huán)境的影響

在植物組織培養(yǎng)過程中，光照﹑溫度﹑濕度等環(huán)境因素也是成功建立植株再生體系的關(guān)鍵。合適的培養(yǎng)環(huán)境可以加快植物生長發(fā)育，提高幼苗質(zhì)量；而不當?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境則會導致植物生長緩慢﹑褐化﹑玻璃化甚至死亡。

劉榮等[24]在研究光照強度對葡萄愈傷組織形成的影響中發(fā)現(xiàn)，在外植體誘導愈傷組織階段，低光照或黑暗條件可有效提升愈傷組織的誘導率，降低褐化率，與高光照相比可提升愈傷組織的生長速率。同吳曉玲等[10]在暗條件下成功誘導銀柴胡愈傷組織，誘導率可達89?5%﹑褐化率僅為9?1%的結(jié)論。而通過外植體直接誘導銀柴胡再生苗的光照強度則為2200～2400 lx，光周期為14 h/10 h，不定芽的誘導率為100%﹑生根率為90%[9]。此外，Giovanni等[25]表明組培育苗時合適的光照可以提升銀柴胡種苗的質(zhì)量。

合適的溫﹑濕度也是組培成功不可或缺的因素。研究表明，在一定的范圍內(nèi)，溫度與香石竹玻璃化成正相關(guān)，溫度越低，玻璃化率越低[26]；環(huán)境濕度越高，組培苗玻璃化率越高[27]。銀柴胡組培快繁研究中多以溫度24～26℃，濕度70%～80%的環(huán)境條件進行，效果較為理想[9-11]。

3 存在問題及解決思路

3.1 組培途徑

現(xiàn)階段銀柴胡組培快繁技術(shù)仍處于初探階段，僅有姚寧等[9]采用器官直接發(fā)生途徑成功建立再生植株體系，獲得完整新個體，其他途徑尚未成功培育出新個體，器官間接發(fā)生途徑與體細胞胚胎發(fā)生途徑未成功建立再生植株體系中最關(guān)鍵問題就是愈傷組織分化困難。愈傷組織的分化與培養(yǎng)基的成分﹑培養(yǎng)環(huán)境﹑材料本身均有較大關(guān)聯(lián)[28]，其原因有可能是培養(yǎng)基成分配比失調(diào)，也有可能是培養(yǎng)環(huán)境不合適，或是銀柴胡本身不適合作為器官間接發(fā)生途徑的材料。下一步應(yīng)系統(tǒng)性研究銀柴胡愈傷組織分化所需的條件，成功分化出胚狀體﹑不定芽﹑不定根，并進一步獲得完整新植株，以拓寬銀柴胡組培快繁的途徑，增加其應(yīng)用場景。

3.2 藥材品質(zhì)

在銀柴胡組培快繁技術(shù)的現(xiàn)有研究中，更傾向于對其再生體系的建立與快繁增殖，而忽略了其組培苗田間栽培品的藥材品質(zhì)的對比研究。下階段應(yīng)探究銀柴胡組培苗田間栽培品與其自然栽培品﹑野生品藥材品質(zhì)在種苗質(zhì)量與有效成分的差異性，如根長﹑根徑﹑干重﹑黃酮含量﹑皂苷含量等，再根據(jù)上述關(guān)鍵品質(zhì)性狀的差異性反推指導組培快繁技術(shù)，提前淘汰品質(zhì)低下﹑無實際價值的組培苗，篩選優(yōu)良組培苗。進一步探索銀柴胡組培苗在移栽后對環(huán)境的適應(yīng)性與變異情況，以便于更好地改良組培模式，提高藥材品質(zhì)，適應(yīng)生產(chǎn)需要。

3.3 遺傳穩(wěn)定性

組培苗雖然繁殖系數(shù)高，但在長期的繼代培養(yǎng)過程中，其遺傳物質(zhì)存在變異的可能性，而大量的遺傳變異會影響種苗的質(zhì)量[29]。因此對銀柴胡組培苗遺傳穩(wěn)定性檢驗的意義十分重大。在現(xiàn)代生物技術(shù)中，常使用簡單序列間重復(fù)（Intersimple sequence repeat， ISSR）進 行 DNA 分 子 標記，研究植物遺傳的多樣性；而在組培快繁中常使用甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism， MSAP）來監(jiān)測DNA甲基化水平與基因表達的關(guān)系，甲基化狀態(tài)通常與基因的表達失活有關(guān)[30]。下一步對銀柴胡組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究可依托ISSR﹑MSAP等技術(shù)手段進行，更深層次地優(yōu)化改良組培過程中的選材﹑發(fā)生途徑﹑繼代次數(shù)等環(huán)節(jié)，減少銀柴胡組培苗在組培快繁過程中產(chǎn)生的遺傳變異，穩(wěn)定其優(yōu)良的遺傳性狀。