基于不同病原真菌單孢分離方法研究

摘 要：在植物病理學(xué)研究中，通常需要分離和純化病原真菌，掌握一套簡捷又高效的單孢分離技術(shù)，有助于研究工作的順利開展。以葡萄灰霉病菌為試驗材料，比較稀釋純化法、挑針轉(zhuǎn)移法、平板稀釋畫線法和實體鏡下轉(zhuǎn)移法4種單孢分離方法。試驗發(fā)現(xiàn)，實體鏡下轉(zhuǎn)移法分離成功率最高，高達93.62%。但各方法各有其優(yōu)缺點，需結(jié)合自身優(yōu)勢和實驗條件，總結(jié)出一套適宜的、簡便可靠的單孢分離方法。

關(guān)鍵詞：真菌； 單孢分離； 純化

中圖分類號：S432.44" " " " 文獻標識碼：A" " "文章編號：1002-204X（2024）02-0037-04

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2024.02.008

Research on Different Single Spore Isolation Methods Based on Pathogenic Fungi

Jiang Caige， Li Jianjian， Song Zhijuan， Ma Haijuan

（Institute of Plant Protection， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，

Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract In the research of plant pathology， it is often necessary to isolate and purify the single spores of pathogenic fungi， and mastering an efficient single spore separation technique is undoubtedly very beneficial for research work. This study used Botrytis cinerea as the experimental material， compared and analyzed four single spore isolation methods， including dilution purification method， needle transfer method， plate dilution line drawing method and solid microscope transfer method. The experiment found that the transfer method under the solid microscope had the highest success rate of separation， reaching 93.62%. But each method has its own advantages and disadvantages， and it is necessary to combine your own advantages and experimental conditions to summarize a set of convenient and reliable single spore separation method that is suitable for yourself.

Key words Fungi; Single spore isolation; Purification

真菌病害研究中常會涉及病原菌的純培養(yǎng)問題，尤其在病原菌群體遺傳特征、致病力分化等研究中總會用到單孢分離技術(shù)[1-2]。因在需要進行病原菌分離的病樣上常有各種腐生菌混雜其中，而腐生菌對生長環(huán)境要求低，在人工培養(yǎng)基上生長較目標菌株快，用常規(guī)病原菌分離方法直接挑取菌株培養(yǎng)易被雜菌污染，成功率低，而使用單孢分離方法純化則可大大提高純化成功率。目前，已有多種單孢分離方法可供研究者借鑒使用，一般根據(jù)操作難度、單孢分離成功率和應(yīng)用范圍等評估其優(yōu)缺點。選擇某一種單孢分離方法，主要基于其實驗室設(shè)備、操作習(xí)慣和技術(shù)掌握的熟練度。但由于各實驗室條件不同，某些單孢分離方法中涉及的特殊工具無法在短時間內(nèi)得到，研究者的操作能力和許多其他問題限制了這些單孢分離方法的應(yīng)用范圍[3-4]。比如挑針轉(zhuǎn)移法[1]雖然目標孢子明確、準確度高，但無法用于一些不易在標樣上產(chǎn)孢的病原真菌；平板稀釋畫線法[5]雖然操作簡便，但必須嚴格控制孢子培養(yǎng)時間；實體鏡下轉(zhuǎn)移孢子[6]和眉毛挑針法[7]的顯微操作要求試驗操作精準、熟練度較高；切取器分離法[4]分離步驟繁瑣、速度慢；稀釋純化法[8]雖然操作簡單，但要求制備孢子懸浮液的濃度要精準；日本的“后騰氏法”[9]挑取孢子使用的玻璃針易折斷；柴榮耀等[10]直接挑取單孢使用的昆蟲針較粗，不適宜較小孢子及較密集孢子堆。此研究是在葡萄灰霉病菌單孢分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上，比較了常用的4種單孢分離方法優(yōu)劣，以供操作者依自身工作條件、試驗材料及個人喜好選擇或總結(jié)出一套適合自己、簡便實用、效率高的單孢分離方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料是已經(jīng)感染灰霉病病菌的葡萄果穗或葡萄葉片，采自賀蘭山東麓各葡萄基地。

試驗需要提前滅菌的物品有顯微鏡、超凈工作臺、挑針（解剖針）、解剖刀、涂布器、載玻片、蓋玻片、酒精燈、移液槍、移液管、離心管、培養(yǎng)皿、試管、錐形瓶、高壓滅菌鍋等試驗常規(guī)用品；制備無菌水、水瓊脂及PDA培養(yǎng)基（添加孟加拉紅或鏈霉素以抑制細菌），并做好水瓊脂、PDA平板與PDA斜面。

簡易挑孢針的制作參考高金欣等[11]的方法。挑針的制作參考龔國淑等[1]的方法。

1.2 試驗操作步驟

以下單孢分離操作均需在超凈工作臺上進行，以防污染。

1.2.1 稀釋純化法

1.2.1.1 孢子懸浮液的配制[8]：先移取1 mL無菌水至2 mL離心管中，再挑取少量菌絲（孢子粉生長較多部位）到離心管中，充分振蕩使孢子充分散開，再從中取20 μL孢子懸浮液置入第2個含有1 mL無菌水的離心管中，振蕩均勻，按照此方法連續(xù)稀釋數(shù)次，直至低倍顯微鏡下的孢子懸浮液大多數(shù)液滴里只含1個孢子為止。

1.2.1.2 孢子懸浮液液滴上覆培養(yǎng)基：取1.2.1.1中稀釋好的孢子懸浮液20 μL，滴在PDA平板上，每個平板可滴入3～5個液滴，再用滅菌滴管吸取40～50 ℃的培養(yǎng)基，滴在每個液滴上面，使其覆蓋并凝固，再移到真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.3 培養(yǎng)：將做好的培養(yǎng)基液滴放入真菌培養(yǎng)箱中，在25 ℃溫度條件下，12 h光暗交替培養(yǎng)2 d，用放大鏡不時檢查液滴內(nèi)孢子萌發(fā)所形成霉點的情況，若只出現(xiàn)1～2個霉點的培養(yǎng)基即用記號筆標記，以便直接移菌，最后再培養(yǎng)3～5 d，直到長出灰色孢子霉層。

1.2.1.4 移菌、保存：將長勢好且純凈的菌落移入PDA斜面試管內(nèi)進行培養(yǎng)，同時完整標記采樣時間、品種、地點、單孢分離保存時間等，在25 ℃溫度條件下，12 h光暗交替培養(yǎng)3～5 d后轉(zhuǎn)入菌種冷藏柜4 ℃保存。

1.2.1.5 計算單孢分離成功率：將試驗重復(fù)3次，每次分別制作10個單孢分離培養(yǎng)基，計算單孢分離成功率。

1.2.2 挑針轉(zhuǎn)移法

孢子載體的制備、孢子選取、蘸取單孢、轉(zhuǎn)移單孢：參考高金欣等[11]的方法。

移菌、保存及計算單孢分離成功率：同1.2.1.4、1.2.1.5。

1.2.3 平板稀釋畫線法

1.2.3.1 制備適宜濃度的孢子懸浮液：同1.2.1.1。

1.2.3.2 畫線、培養(yǎng)：參考張昊等[5，12]的方法。

1.2.3.3 單菌落的轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)、保存：選擇較分散的單個菌落，在其底部畫圈作標記，將標記處培養(yǎng)基切下，轉(zhuǎn)移至新的PDA平板中，在25 ℃溫度條件下，12 h光暗交替培養(yǎng)3～5 d后，觀察菌落形態(tài)，進行鑒定，將長勢好且純凈的葡萄灰霉病菌菌落移入PDA斜面試管內(nèi)進行培養(yǎng)，同時完整標記采樣時間、品種、地點、單孢分離保存時間等，轉(zhuǎn)入菌種冷藏柜，于4 ℃條件下保存。

1.2.3.4 計算單孢分離成功率：同1.2.1.5。

1.2.4 實體鏡下轉(zhuǎn)移法[6，13]

1.2.4.1 制備適宜濃度的孢子懸浮液：同1.2.1.1，不過最后一級孢子懸浮液只需稀釋到鏡檢下的液滴里大多數(shù)含1～3個孢子即可。

1.2.4.2 孢子載體的制備：將制備的稍硬一點的水瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，其厚度以1～2 mm為宜，以便在顯微鏡下清楚地觀察孢子。

1.2.4.3 單孢培養(yǎng)基的分離、轉(zhuǎn)移：用移液槍移取20 μL的孢子懸浮液按五點法滴在水瓊脂平板上，然后用移液槍依次移取無菌水滴在孢子懸浮液上，放在顯微鏡下觀察孢子的分布變化，對于分散度大的孢子，需要在平板底部做記號，再均勻涂布一個范圍，用解剖刀將涂布范圍劃成小的培養(yǎng)基塊，用消毒的挑針挑取10小塊培養(yǎng)基置于載玻片上，通過目鏡觀察，將載玻片上只有1個孢子的單孢瓊脂塊用挑針挑到新PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，試驗重復(fù)3次，每組試驗確保10個單孢瓊脂塊。

1.2.4.4 移菌、保存及計算單孢分離成功率：同1.2.1.4、1.2.1.5。

2 結(jié)果與分析

本研究以單孢分離葡萄灰霉病菌為例，4種單孢分離方法結(jié)果見表1。

2.1 稀釋純化法

從表1可看出，稀釋純化法單孢分離成功率相對較高，達91.86%，且試驗操作簡單快速，但制備合適的孢子懸浮液要求較高，需要重復(fù)稀釋的次數(shù)較多，直到孢子密度合適時單孢分離效果才好。孢子密度是影響單孢分離成功率的關(guān)鍵因素，孢子密度越低，越可以輕松鎖定目標孢子，且不易使非目標孢子污染目標孢子。此方法筆者使用較多。

2.2 挑針轉(zhuǎn)移法

此方法進行真菌的純化分離成功率最低，僅為79.22%，與其他方法差異顯著。主要是因為在顯微鏡下挑取時，分生孢子無色透明，不易觀察清楚。雖然獲得的單孢子是可靠的，但操作復(fù)雜、困難、耗時、費力，不適合大批量病樣的分離。要熟練進行孢子分離操作，需注意：①要依孢子大小選擇挑針的細度，針尖細而光滑；②挑取孢子前將針尖在新鮮培養(yǎng)基上攆動一圈，以保持針尖表面濕潤，便于蘸取孢子；③顯微鏡視野下操作時可將掌根輕輕靠在載物臺邊緣，以保持挑針的平穩(wěn)；④在進行顯微操作時可暫時關(guān)閉或調(diào)低超凈工作臺通風(fēng)設(shè)備，避免孢子飄移、掉落及培養(yǎng)基表面快速失水。

2.3 平板稀釋畫線法

此方法單孢分離成功率也較高，達91.58%，關(guān)鍵是操作步驟簡單快捷，不需要在鏡下觀察，且保留了稀釋純化法的優(yōu)點。但在試驗操作過程中，因病樣本身?；祀s有各種腐生菌，若畫線平板上孢子分布過于密集，極易交叉生長，導(dǎo)致純化失敗。因此，在單孢轉(zhuǎn)移時一要選擇較分散且純凈的菌落，二要在霉點出現(xiàn)時及時轉(zhuǎn)移，三要盡可能多地轉(zhuǎn)移單菌落，以提高目標孢子分離成功率。此方法筆者也使用較多。

2.4 實體鏡下轉(zhuǎn)移法

實體鏡下轉(zhuǎn)移法分離成功率最高，高達93.62%，主要是結(jié)合了前面3種方法的優(yōu)點，克服了挑針轉(zhuǎn)移法操作難度高的缺點。但此方法需在對顯微鏡熟練操作情況下才能高效運用，因把培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察孢子懸浮液中的孢子數(shù)量時，需要不斷移動培養(yǎng)皿，從而需不斷調(diào)整焦距準確記錄單孢數(shù)量。

3 結(jié)論與討論

3.1 稀釋純化法

此方法稀釋過程較繁瑣，孢子懸浮液的濃度難以合適配比，但若制備出適宜濃度的孢子懸浮液，單孢分離的成功率較高。但是由于這種方法實質(zhì)上是分離菌落，孢子懸浮液濃度高時不能確定1個菌落是從單個孢子繁殖而來，純化的可靠性較差，而濃度過低可能長不出菌落[4]。張昊等[5]預(yù)試驗確定了在孢子濃度為1個·μL-1時，每2 μL孢子懸浮液中出現(xiàn)1個孢子的幾率達到50%，而無孢子的幾率為35%，這樣單菌落由單孢子繁殖而來的可靠性就達到85%，只需繼續(xù)改良試驗方法，最大限度地排除出現(xiàn)2～5個孢子的15%情況即可得到可靠的單孢子分離物。

3.2 挑針轉(zhuǎn)移法

該方法更適合于具有大型、深色孢子的真菌分離純化，如鐮刀菌、銹菌、蠕形菌、彎孢霉、鏈格孢等；尤其適合不新鮮或不單一、其病原菌在培養(yǎng)基上生長緩慢的病樣，從培養(yǎng)基上直接挑取單孢，分離純化成功率較其他單孢分離方法高。此法所用工具簡單，一般實驗室條件即可操作，不需特殊設(shè)備和嚴格的無菌環(huán)境[1，11]。挑針轉(zhuǎn)移法進行單孢分離試驗時最關(guān)鍵的是要熟練操作轉(zhuǎn)移的要點，經(jīng)過多次試驗，從而掌握挑取轉(zhuǎn)移的規(guī)律。怎樣轉(zhuǎn)移成功率較高，只有在試驗中摸索，才能真正熟練掌握此方法。

3.3 平板稀釋畫線法

經(jīng)過多次試驗，此方法是獲得單個真菌孢子既準確又迅速的單孢分離方法，適用于分離不同類型真菌的孢子，特別是大量病樣的分離純化。張昊等[12]僅用2 μL孢子懸浮液畫成1條直線，且每個平板5條直線，不僅利于多個孢子分散，也可保證每個平板均有菌落生長，只需挑取較分散、單一、純凈的菌落進行轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)。3～5 d菌落生長完成，通過鑒定得到目標純化菌落即可，保證了純化結(jié)果的可靠性。

3.4 實體鏡下轉(zhuǎn)移法

該方法是在比較分析改良了前人單孢分離方法基礎(chǔ)上總結(jié)出的一套技術(shù)[4，6，13]，即在顯微鏡下直接挑取單個孢子的培養(yǎng)基塊，分離到的單孢幾乎無雜菌污染，保證了單孢的正常生長發(fā)育熟練掌握該方法操作成功率可達90%以上，同時免去了分離培養(yǎng)中消毒、重復(fù)純化等一系列過程。然而，對該方法若掌握不熟練、技巧性不強則有一定的缺陷：①將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察，因不便固定，培養(yǎng)皿不能準確移動，不利于尋找孢子的范圍；②由于是隨機劃取，取得的單孢培養(yǎng)基幾率不宜掌握。

通過4種單孢分離比較試驗可以看出，每種方法都有其優(yōu)缺點，稀釋純化法和平板稀釋畫線法操作簡單但孢子懸浮液濃度不易稀釋精確，挑針轉(zhuǎn)移法步驟簡單但技巧性強不易掌握，實體鏡下轉(zhuǎn)移法純化度較高但顯微鏡使用技巧性要求較高。單孢分離純培養(yǎng)方法很多，具體選擇哪種試驗方法，不僅要參考前人經(jīng)驗，也要結(jié)合自身優(yōu)勢和試驗條件，經(jīng)過反復(fù)試驗驗證，不斷從細節(jié)中發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，從而整合出一套適宜的、簡便可行的單孢分離方法。

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責(zé)任編輯：達海莉