抗生素重要片段側(cè)鏈酸的高效合成工藝

摘 要：單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素是抗生素新藥研發(fā)的重要熱點領域，在氨基噻唑的C5位引入甲基為重要技術方案之一。在原有合成路線基礎上，通過反應機理深度分析，以3-氧戊酸乙酯為起始原料，經(jīng)5步反應，高效合成了C5位引入甲基的氨基噻唑側(cè)鏈酸，為候選藥物目標化合物DPI-2016的臨床前期研究奠定了基礎。

關鍵詞：單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素； 氨基噻唑側(cè)鏈酸； 氨曲南

中圖分類號：TQ465" " " " 文獻標識碼：A" " " 文章編號：1002-204X（2024）02-0018-04

doi：10.3969/j.issn.1002-204x.2024.02.005

Efficient Synthesis of Antibiotic Side Chain Acid

Zhai Lijuan， He Lili， Ji Jingwen， Sun Jian

（Institute of Agricultural Resources and Environment， Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Yinchuan， Ningxia 750002）

Abstract Monocyclic β-lactam antibiotics are an important hotspot in the research and development of new antibiotics， and the introduction of methyl at C5 position of aminothiazole is an important solution. In this paper， based on the original synthesis route， through in-depth analysis of the reaction mechanism， the methylated aminothiazole side chain acid at C5 was efficiently synthesized from 3-oxoethylpentanoate as the starting material through five steps of reaction in high efficient way， which laid the foundation of the preclinical research for the candidate drug target compound DPI-2016.

Key words Monocyclic β-lactam antibiotics; Amino thiazole side chain acid; Aztreonam

抗生素是人類新藥研發(fā)歷史上最偉大的發(fā)明之一，然而由于長期使用導致細菌的耐藥性增強。因此，在科學合理使用抗生素、減緩超級細菌產(chǎn)生速度的同時，盡快研發(fā)新一代抗生素，以應對業(yè)已存在的超級細菌帶來的臨床用藥壓力已迫在眉睫。因為，對業(yè)已存在的耐藥細菌而言其自身不會自然消亡，抗生素的誤用和濫用只能加速耐藥的發(fā)生。在單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素（Monobactam antibiotic）中，迄今僅有氨曲南（Aztreonam）一個化合物用于臨床[1]，至1982年由FDA批準上市以來，尚無更新?lián)Q代。從新藥研發(fā)的角度講，尚有足夠的空間有待化學結(jié)構修飾、深度挖掘，研發(fā)新一代抗生素成功的可能性極大，成藥后的臨床期壽命也會更長，有望在較長一段時間內(nèi)緩解細菌耐藥性帶來的臨床壓力。因此，單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素的研究已是國際抗生素研發(fā)的最為前沿、最為重要的領域，其中：美國輝瑞國際藥業(yè)集團的MC-1[2]、諾華制藥的LYS228[3]、瑞士的Basilea制藥集團的BAL-30072[4]是目前這一賽道的佼佼者（圖1）。

寧夏農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所農(nóng)業(yè)有機合成團隊（以下簡稱農(nóng)業(yè)有機合成團隊）在研的寧夏科技廳重大專項“新型內(nèi)酰胺類抗生素研發(fā)”的階段性成果已獲得國際發(fā)明專利2項[5-6]，發(fā)表SCI論文多篇[7-10]，特別是2022年農(nóng)業(yè)有機合成團隊非常榮幸受邀為國際先行期刊《Molecules》撰寫了1.5萬字的抗生素新藥研究領域的綜述文章[10]，這標志著農(nóng)業(yè)有機合成團隊在抗生素新藥領域的研究獲得了國際同行認可，佐證了研究的國際水準，提高了寧夏新藥研發(fā)的國際影響力。DPI-2016[9]是該項目篩選的一個具有臨床前期研究價值的藥物候選化合物，該化合物是基于農(nóng)業(yè)有機合成團隊掌握的抗生素設計的核心技術，借助計算機模擬藥物仿真技術，通過計算機有效設計、合成和結(jié)構優(yōu)化取得的重要階段性成果（圖2）。

在氨基噻唑的C5位引入甲基進而合成最終目標化合物是單環(huán)內(nèi)酰胺抗生素研發(fā)的熱點領域。然而，由于其合成極具挑戰(zhàn)，全球多個團隊嘗試合成，迄今均未獲得突破?；衔?屬農(nóng)業(yè)有機合成團隊全球首次合成的在C5引入甲基合成的氨基噻唑片段[9]，并由此篩選出藥物候選化合物DPI-2016。為了對DPI-2016進行臨床前期研究，需要合成足夠量的這一片段以便有效合成目標化合物DPI-2016。本文探究了化合物6的最新合成工藝，旨在為抗生素新藥的臨床研究提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

化學合成試劑購自Ark公司，二氯甲烷、乙腈、甲醇和四氫呋喃（色譜純）購自伊諾凱科技有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Amberlite" "IR-120（H）離子交換樹脂購自Alfa試劑公司，柱層析用硅膠購自青島科技有限公司（CC Grade 230～400 Mesh）。

1.2 試驗儀器

核磁共振儀采用布魯克公司的Bruker AVANCE NEO 400 NMR （400 MHz），NMR所用氘代試劑為含有TMS內(nèi)標物的CDCl3、CD3OD或DMSO-d6，耦合常數(shù)（J）為赫茲 （Hz）。NMR數(shù)據(jù)中s表示單峰；br s表示單寬峰，d表示雙重峰，t表示三重峰，m表示多重峰。

液相質(zhì)譜聯(lián)用儀采用Agilent 1260 Infinity II System；層析采用Boitage自動純化系統(tǒng)（Flush Purification System，Isolera One）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀采用Buch R-300；冷凍干燥采用東京理化EYELA FDU-2110。

1.3 合成方法

新合成路線如圖3。

溶劑及反應條件：①苯基三甲基三溴化銨、二氯甲烷，0 ℃，3 h，產(chǎn)率100%；②硫脲、乙腈，85 ℃回流3 h，產(chǎn)率81%；③二碳酸二叔丁酯、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷，25 ℃，24 h，產(chǎn)率96%；④二氧化硒、1，4-二氧六環(huán)，105 ℃，24 h，2-碘?；郊姿?、乙腈，85 ℃，3 h，產(chǎn)率49.2%；⑤氫氧化鈉、四氫呋喃、乙醇、水，0 ℃，5 h，產(chǎn)率100%。

1.3.1 4-溴-3-氧戊酸乙酯（2）的合成

將化合物1（39 g，300 mmol）溶解于250 mL二氯甲烷中，于0 ℃下加入苯基三甲基三溴化銨（118.4 g，315 mmol），0 ℃下反應3 h。TLC監(jiān)測反應完成后，用二氯甲烷稀釋，有機相用水洗3次（30 mL×3），然后用飽和NaCl溶液水洗（20 mL），加入無水硫酸鈉干燥，過濾后濃縮有機相得到化合物2（62.7 g，quant.），為白色固體。1H NMR （400 MHz，DMSO-d6）δH 1.20（t，J=7.1 Hz，3 H），1.65（d，J=6.7 Hz，3 H），3.84（s，2 H），4.11（q，J=7.1 Hz，2 H），4.88（q，J=6.7 Hz，1 H）。

1.3.2 2-（2-氨基-5-甲基噻唑-4-基）乙酸乙酯（3）的合成

將化合物2（62.70 g，300 mmol）在室溫下溶解于乙腈（200 mL）中，加入硫脲（25 g，330 mmol）后升溫至85 ℃回流5 h。TLC監(jiān)測反應完成后，濃縮反應液后加入200 mL水，然后用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8～9；繼續(xù)攪拌5 min，過濾所得固體經(jīng)水洗后烘干得到化合物3（48 g，收率81%），為黃色固體。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH 1.17（t，J=7.2 Hz，3 H），2.12（s，3 H），3.39（s，2 H），4.05（q，J=7.2 Hz，3 H）， 6.62（s，2 H）。

1.3.3 2-（2-（（叔丁氧基羰基）氨基-5-甲基噻唑-4-基）-乙酸乙酯（4）的合成

將化合物3（18.62 g，100 mmol）溶解于100 mL二氯甲烷中，在室溫下加入二碳酸二叔丁酯（Boc2O）（22.70 g，104 mmol）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）（0.85 g，7 mmol）。反應混合物在室溫下反應24 h，并用TLC確認反應完后濃縮反應液，加入115 mL乙腈攪拌12 h，過濾后所得固體用35 mL冷乙腈洗滌得到白色固體化合物4（27.39 g，收率96%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH 1.17（t，J=7.2 Hz，3 H），1.46（s，9 H），2.24（s，3 H），3.57（s，2 H），4.05（q，J=7.2 Hz，2 H），11.23（s，1 H）。

1.3.4 2-（2-（（叔丁氧羰基）氨基）-5-甲基噻唑-4-基）-2-氧代乙酸乙酯（5）的合成

將化合物4（2.85 g，10 mmol）溶解于40 mL 1，4-二氧六環(huán)（Dioxane）中，于室溫下加入二氧化硒（SeO2）（2.44 g，22 mmol）。將反應混合物在105 ℃回流6 h，用薄層色譜（TLC）監(jiān)測反應，將反應體系冷卻至室溫后過濾，用10 mL乙酸乙酯洗滌2次，過濾所得有機相濃縮。將所得濃縮物溶于40 mL乙腈中，于室溫下加入2-碘?；郊姿幔↖BX，80%）（2.10 g，6 mmol），然后將反應混合物在85 ℃下反應3 h，將反應體系冷卻至室溫后過濾，濾餅用10 mL乙腈洗滌2次，濾液減壓濃縮后加入乙酸乙酯20 mL，用飽和碳酸氫鈉溶液將pH值調(diào)至8～9，分離有機相后濃縮進行柱色譜分離，得到白色固體化合物5（1.47 g，收率49.2%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH 1.30（t，J=7.2 Hz，3 H）， 1.48（s，9 H），2.66（s，3 H），4.32（q，J=7.2 Hz，2 H）， 11.72（s，1 H）。

1.3.5 2-（2-（（叔丁氧羰基）氨基）-5-甲基噻唑-4-基）-2-氧代乙酸（6）的合成

將化合物5（1.50 g，5 mmol）溶解于四氫呋喃（8 mL）和乙醇（8 mL）混合溶劑中，冷卻至0 ℃后滴加氫氧化鈉水溶液（1 N，7.5 mL），冰浴下反應5 h。用薄層色譜法（TLC）監(jiān)測反應完成后，反應液減壓濃縮除去溶劑后，冷卻至0 ℃，用1 N稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至4會析出沉淀，沉淀經(jīng)過濾、干燥得到白色固體化合物6（1.45 g，quant.）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δH 1.47（s，9 H），2.55（s，3 H），11.51（s，1 H），LC-MS [M-H]-m/z 285.0（calcd for C11H14N2O5S， 286.06）。

最終目標化合物6化學結(jié)構經(jīng)質(zhì)譜和核磁氫譜予以確認（圖4）。

2 結(jié)果與分析

鑒于已有化合物6的合成工藝（Old route，圖5）整體收率不高等缺陷，基于反應機理，在原有合成工藝基礎上，經(jīng)反應條件優(yōu)化（包括試劑和溶劑篩選），研發(fā)成功片段6的有效合成工藝（New route，圖5）。雖然新的工藝和原有工藝相比仍然為5步，但和原有工藝相比，新的工藝前3步的產(chǎn)率均有顯著提高，僅有第4步反應尚且不足，產(chǎn)率由33%提高到49%，尚需進一步優(yōu)化；5步反應中的4步只需簡單的后處理即可獲得純品；整個合成工藝僅有一步反應需柱層析純化；合成總收率由原有的7%提高到38%，合成效率提高5.5倍。具體而言，第一步反應仍然以化合物1為起始原料，將溴化試劑由Br2改為容易操控的苯基三甲基三溴化銨鹽，合成溴化產(chǎn)物2，產(chǎn)率由65%提高到100%，反應完成后，只需簡單地過濾即可獲得目標產(chǎn)物。第二步反應，將原有工藝的溶劑由甲苯換為乙腈（MeCN），合成的目標化合物3的產(chǎn)率由52%提高到81%，推測其原因可能是MeCN增加了體系的溶解度。第三步Boc保護反應，將原有工藝中的堿由TMEAD換為DMAP，同時將反應溶劑由MeCN換為二氯甲烷（DCM），其結(jié)果是目標產(chǎn)物4的產(chǎn)率由66%提高到96%。第四步反應，在原有工藝的氧化劑SeO2中添加IBX，其結(jié)果雖不完美，尚需優(yōu)化，但產(chǎn)率也由33%提高到49%。

3 結(jié)論與討論

氨基噻唑側(cè)鏈酸（6）新的合成工藝仍是以3-氧戊酸乙酯為起始原料，首先用溴化試劑苯基三甲基三溴化銨進行α-H的高選擇性取代得到化合物2，該溴化試劑避免了同分異構體的生成，進而提高了合成效率?；衔?的合成是以乙腈為反應溶劑，該溶劑對反應后處理起到至關重要的作用，后處理不需要柱層析只需要用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)到偏堿性，然后水洗就可以得到純度很高的固體化合物3。在Boc酸酐保護氨基反應中改用4-二甲氨基吡啶，這種堿極易溶于乙腈中，后處理中只需要用冷乙腈多洗幾遍就能得到化合物4。下一步氧化生成酮基，這步反應如果只用SeO2氧化產(chǎn)率很低，只有33%，利用核磁譜圖監(jiān)測反應，結(jié)果顯示還有一部分氧化產(chǎn)物是以中間體醇的形式存在，并沒有被氧化徹底，農(nóng)業(yè)有機合成團隊引入2-碘?；郊姿幔↖BX）這種高價碘試劑實現(xiàn)中間體醇全部轉(zhuǎn)化為酮進而提高產(chǎn)率。通過試驗研究，從分子層面，設計、研發(fā)成功了一個全新的合成工藝，規(guī)避了之前路線中的風險和缺陷，提高側(cè)鏈酸的合成效率，為候選藥物目標化合物DPI-2016的臨床前期研究奠定了基礎。

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責任編輯：達海莉