西藏墨脫地區(qū)枇杷新擬盤多毛孢菌培養(yǎng)特征及致病力分析

摘要要：【目的】為探究來自西藏墨脫地區(qū)枇杷葉斑病新擬盤多毛孢菌的生物學(xué)特性，有效預(yù)防病害的發(fā)生?！痉椒ā坎捎闷桨迮囵B(yǎng)法和離體葉片接種法對病原菌進(jìn)行培養(yǎng)和致病力測定?！窘Y(jié)果】供試21個菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 d，依據(jù)培養(yǎng)基中著生的分生孢子盤數(shù)量的高、中和低，將菌落培養(yǎng)表型劃分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，菌株出現(xiàn)頻率分別為38.10%、33.33%和28.57%。培養(yǎng)5 d，菌落生長速率范圍值為12.68～15.60 mm/d，平均值為14.33 mm/d。培養(yǎng)12 d，菌落產(chǎn)孢量高于和低于1×105 個孢子/cm2的菌株出現(xiàn)頻率分別為71.43%和28.57%，有致病力和無致病力的菌株出現(xiàn)頻率分別為61.90%和38.10%。菌株致病力與菌落生長速率以及產(chǎn)孢量之間均無相關(guān)性?！窘Y(jié)論】西藏墨脫地區(qū)流行的新擬盤多毛孢菌培養(yǎng)特征及致病力出現(xiàn)明顯分化，大部分菌株產(chǎn)孢能力強，且對枇杷有致病力。

關(guān)鍵詞：枇杷；新擬盤多毛孢菌；培養(yǎng)特征；致病力

中圖分類號：S667.3" " " " " " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " nbsp; " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0396-07

Culture Characteristics and Pathogenicity of Neopestalotiopsis sp.

to Loquat in Medog Areas of Tibet

Gan Lin1，Jiang Fan2，Lan Chengzhong1，Dai Yuli1，He Yuxian1，Yang Xiujuan1*

（1 Institute of Plant Protection，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences / Fujian Key Laboratory

for Monitoring and Integrated Management of Crop Pests，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China；

2 Fruit Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350013，China）

Abstract：【Objective】In order to study the biological characteristics of the population of Neopestalotiopsis sp. isolated from Loquat leaf spot in Medog areas of Tibet，which prevent effectively the occurrence of the disease.【Method】The tests of culture characteristics and pathogenicity of pathogens were determined by plate culture and leaf inoculation in vitro. 【Result】According to the high，medium and low numbers of acervulus in the culture，the colony culture phenotypes of 21 strains which cultured on PDA medium for 12 days were divided into type I，type II and type III，with 38.10%，33.33% and 28.57% of the occurrence frequency，respectively. The range value of colony growth rate of 21 strains cultured for 5 days was 12.68～15.60 mm/d，and the average value was 14.33 mm/d. The frequency of strains cultured for 12 days，with the number of colony spores higher and lower than 1×105 spores/cm2 were 71.43% and 28.57%，which the frequency of pathogenic and non-pathogenic strains were 61.90% and 38.10%，respectively. There was no correlation between strain virulence and colony growth rate and spore number.【Conclusion】Neopestalotiopsis sp. in Medog areas of Tibet had obvious differentiation in culture characteristics and pathogenicity，and the most of the strains had strong sporulation ability and pathogenicity to loquat.

Key words：Loquat；Neopestalotiopsis sp.；Culture characteristics；Pathogenicity

由類擬盤多毛孢菌侵染引起的枇杷葉斑病是枇杷生產(chǎn)的一種主要病害，在浙江、安徽、江蘇、福建等地方廣泛發(fā)生［1-3］，病害多發(fā)生在葉片上，后期形成圓形至不規(guī)則形灰白色病斑，病斑干燥易破裂，嚴(yán)重時可導(dǎo)致葉片畸形、早衰脫落，此病害不僅為害葉片影響樹勢，還侵染花和果實造成產(chǎn)量嚴(yán)重下降，枇杷果實采后易發(fā)生腐爛，影響商品性［4-5］。

近年來，枇杷產(chǎn)業(yè)在我國西藏墨脫地區(qū)迅速發(fā)展，2023年我們在該地區(qū)不同枇杷園調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)罔凌巳~斑病發(fā)生普遍，部分果園發(fā)生較嚴(yán)重，急性型和慢性型病斑均有發(fā)生。通過病樣癥狀觀察、病原菌分離，并結(jié)合病原菌形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，確定該地區(qū)發(fā)生的枇杷葉斑病病原菌為新擬盤多毛孢菌Neopestalotiopsis sp.。

植物病原菌在侵染傳播過程中易發(fā)生變異分化，而病原菌的生物學(xué)特性是病原菌致病機(jī)理、病害流行及防治研究的基礎(chǔ)。據(jù)已有的研究報道，枇杷擬盤多毛孢菌菌絲生長適宜溫度為20～25℃，病原菌以對碳源的蔗糖、乳糖、葡萄糖利用為佳，蔗糖、葡萄糖適合病原菌產(chǎn)孢；以對氮源的蛋白胨、磷酸銨、硝酸銨和硝酸鉀利用為佳，硝酸鉀最適合病原菌產(chǎn)孢，尿素則可抑制病原菌生長［6］。分生孢子萌發(fā)的適宜溫度為20～30℃［7］，孢子在飽和濕度或水滴中萌發(fā)快，相對濕度低于90%時則不能萌發(fā)，麥芽糖、蔗糖對分生孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用，而硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨對孢子萌發(fā)有抑制作用，分生孢子和菌絲體在50℃溫水中經(jīng)15 min或55℃溫水中經(jīng)2 min處理完全失去活力［8］。然而，目前對西藏墨脫地區(qū)枇杷葉斑病發(fā)生流行規(guī)律不清楚，對該病害病原菌的培養(yǎng)特征及致病力尚無研究報道。

本試驗在前期的工作基礎(chǔ)上，從該地區(qū)枇杷葉斑病病組織中分離獲得新擬盤多毛孢菌，通過研究病原菌培養(yǎng)表型、生長速率、產(chǎn)孢能力和致病力，旨在了解當(dāng)?shù)罔凌巳~斑病田間發(fā)生和病原菌流行規(guī)律，為病害科學(xué)防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

從西藏墨脫縣枇杷種植區(qū)采集病樣，病菌分離純化鑒定后保存，供試的21株枇杷新擬盤多毛孢菌菌株編號及來源信息參見表1。

1.1.2 供試枇杷葉片

從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所枇杷園中選取‘早鐘6號’新鮮健康無病成熟葉片。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)性狀觀察及生長速率測定

各菌株活化后，打取直徑5 mm的菌碟移至直徑為9 cm的PDA平板上，于25 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，觀察和記載菌株培養(yǎng)5 d和12 d平板的菌落性狀，并測量培養(yǎng)5 d各菌株的菌落直徑，計算菌落生長速率，每個菌株重復(fù)4次。

1.2.2 菌株產(chǎn)孢量測定

取在平板上培養(yǎng)12 d的各菌株菌落，用打孔器從菌落中心點出發(fā)至邊緣連續(xù)打取直徑5 mm的菌餅6個，每皿共打取24個菌餅移至含5 mL無菌水的試管中，試管內(nèi)有直徑2 mm的鋼珠3個，置于180 r/min搖床上振蕩5 min以洗脫分生孢子，用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量，計算各菌株每平方厘米菌落的產(chǎn)孢量，每個菌株處理重復(fù)4次。

1.2.3 菌株致病力測定

采用離體葉片接種法，病原菌接種方式參考但雨柔等［9］方法，即用無菌水清洗葉片晾干后，在葉片正面沿葉脈兩側(cè)各選4點用滅菌接種針刺傷。在培養(yǎng)12 d的菌株平板中部，用打孔器打取直徑5 mm菌餅，在各針刺傷口處接種1個菌餅，菌絲面貼于葉片正面?zhèn)谔?，用大小相同的無菌PDA菌餅作為對照，每個菌株接種4個點，重復(fù)3次。接種后的葉片平放置于鋪有2層滅菌濕濾紙的保濕盒內(nèi)，在25℃光照/黑暗12 h交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后，測量各接種點病斑直徑。以在接種點能形成典型褐色病斑視為有致病力，以病斑直徑大小評價菌株的致病力大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”采用Duncan氏新復(fù)極差法分析不同處理間的差異顯著性，采用線性回歸分析法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株平板培養(yǎng)性狀

不同菌株在PDA培養(yǎng)基上生長良好，培養(yǎng)5 d，菌落近圓形，正面棉白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，叢生呈絮狀或絨毛狀，菌絲層較厚，表面層狀不平，邊緣整齊，菌落背面淡草黃色。培養(yǎng)12 d后，不同菌株菌落表型出現(xiàn)分化，主要劃分為三種類型（圖1），Ⅰ型（8株）：整個培養(yǎng)介質(zhì)著生黑色粒點（分生孢子盤）數(shù)量高而密，分別是X-2、YL2-2、B-4、DT-4、D2-2、DT-5、P-1、MA-6；Ⅱ型（7株）：培養(yǎng)介質(zhì)著生黑色粒點數(shù)量中等，分別是Y-4-2、X-7、DT-2、P-2、H-5、X-5、Y7-1-2，粒點著生部位和密度無規(guī)律性，有的在菌落中部，有的在菌落邊緣；Ⅲ型（6株）：培養(yǎng)介質(zhì)著生黑色粒點數(shù)量低，分別是Y1-1、X-6、YL3、YL4、MA-3、Y4-4。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型菌株出現(xiàn)頻率分別為38.10%、33.33%和28.57%。

2.2 菌株生長速率

從表2可見，供試的21個菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d，不同菌株生長速率存在很大差異，菌落生長速率范圍值在12.68～15.60 mm/d之間，平均值為14.33 mm/d，最大值是最小值的1.23倍，以MA-3、H-5菌株的菌落擴(kuò)展能力強，生長速率達(dá)15.00 mm/d以上，明顯高于其他菌株，而以Y4-2、P-1等6個菌株菌落擴(kuò)展能力較弱，生長速率低于14.00 mm/d。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型菌株平均生長速率無顯著性差別，菌株生長速率與其平板培養(yǎng)表型和地方來源無關(guān)。

2.3 菌株產(chǎn)孢量

從表2可見，不同菌株在PDA平板上培養(yǎng)12 d的產(chǎn)孢能力差異極大，21個菌株中菌落產(chǎn)孢量高于1×105個孢子/cm2的菌株有15個（占71.43%），其中高于100×105個孢子/cm2的菌株有4個（占19.05%），低于1×105個孢子/cm2的菌株有6個（占28.57%）。以YL2-2菌株產(chǎn)孢能力最強，DT-4菌株產(chǎn)孢能力次之，產(chǎn)孢量明顯高于其他菌株的產(chǎn)孢量。

三種類型群體菌株產(chǎn)孢量與菌株平板培養(yǎng)表型有一定關(guān)系，產(chǎn)孢量較高的菌株均屬于Ⅰ型，以Ⅰ型菌株群體平均產(chǎn)孢量顯著高于Ⅱ型、Ⅲ型。相關(guān)性分析結(jié)果表明，菌株產(chǎn)孢量與其菌落生長速率無相關(guān)性（r =0.0159，P =0.9456 gt; 0.05）。菌株產(chǎn)孢量與菌株地方來源無關(guān)。

2.4 菌株致病力

從表3可見，不同菌株致病力差異極大，有致病力的菌株13個，占61.90%（分屬Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型），無致病力的菌株8個，占38.10%（分屬Ⅱ型、Ⅲ型）；無菌PDA對照未見病斑（圖2）。在有致病力的菌株中，以P-1（Ⅰ型）和YL3（Ⅲ型）菌株致病力最強，接種點產(chǎn)生的病斑直徑分別為12.96 mm和12.50 mm，明顯高于其他菌株接種點的病斑直徑。在表型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型群體中，有致病力菌株分別占100%、42.86%和33.33%，病斑直徑平均值以Ⅰ型最高，但與Ⅱ型和Ⅲ型相比無顯著性差異。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，菌株致病力（接種病斑直徑）與其菌落生長速率以及產(chǎn)孢量之間無顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)值分別為r=0.2638（P=0.2480gt;0.05）和 r=0.2850（P=0.2105gt;0.05）。菌株致病力與菌株地方來源無關(guān)。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，來自西藏墨脫地區(qū)不同地方的21個枇杷新擬盤多毛孢菌在菌落生長速率、培養(yǎng)表型特征、產(chǎn)孢量和致病力上出現(xiàn)了明顯的分化。在PDA平板上培養(yǎng)5 d，菌株生長速率最大值和最小值相差1.23倍。培養(yǎng)12 d，培養(yǎng)基中黑色粒點（分生孢子盤）著生數(shù)量出現(xiàn)高（Ⅰ型）、中（Ⅱ型）和低（Ⅲ型）三種菌落表型。供試菌株群體中大多數(shù)菌株產(chǎn)孢能力較強，以Ⅰ型菌株產(chǎn)孢量最高、Ⅱ型次之，表明通過菌株在培養(yǎng)基上著生黑色分生孢子盤的密度可大致判別菌株的產(chǎn)孢能力，而后期研究發(fā)現(xiàn)各菌株在PDA平板上培養(yǎng)的菌落表型特征及其產(chǎn)孢能力，在繼代培養(yǎng)多代后仍可穩(wěn)定遺傳。

致病力測定發(fā)現(xiàn)，有致病力菌株占多數(shù)，在產(chǎn)孢量最高的Ⅰ型群體中，各菌株均有致病力，但其致病力存在較大差異。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，菌株致病力與其菌落生長速率、產(chǎn)孢量無顯著相關(guān)，如致病力較強的菌株P(guān)-1、YL3產(chǎn)孢量處于中等和低水平，而產(chǎn)孢量高的菌株YL2-2和DT-4則致病力中等，病菌致病過程中菌絲可能起著重要的侵染作用。病菌致病力與菌株來源的不同地方、果園新舊類型無關(guān)。綜上而言該病菌群體流行的生物學(xué)特性復(fù)雜多樣。

當(dāng)前生產(chǎn)上種植的枇杷品種對葉斑病抗性較差，隨著枇杷種植面積的擴(kuò)大和種植年限的延長，枇杷葉斑病的發(fā)生有加重的趨勢［10］。參照2014年以來類擬盤多毛孢菌新的國際統(tǒng)一鑒定分類標(biāo)準(zhǔn)［11］，我們發(fā)現(xiàn)西藏墨脫地區(qū)流行的枇杷葉斑病病原菌為新擬盤多毛孢菌Neopestalotiopsis sp.。目前由該病原菌引起的枇杷葉斑病在當(dāng)?shù)仉m尚未造成大面積嚴(yán)重危害，但在病菌群體中出現(xiàn)了致病力、產(chǎn)孢能力強的菌株，病害具有潛在暴發(fā)流行風(fēng)險性，生產(chǎn)上應(yīng)密切關(guān)注該地區(qū)枇杷葉斑病的發(fā)生情況，加強病害發(fā)生規(guī)律的研究，在適當(dāng)條件下采取必要措施（如農(nóng)業(yè)和生物防治等）以延緩病害的發(fā)生和為害。

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（責(zé)任編輯：黃雄峰）

收稿日期：2024-06-10

基金項目：福建省人民政府與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展超越“5511”協(xié)同創(chuàng)新工程項目（XTCXGC2021011）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新平臺專項（CXPT202105）

作者簡介：*為通訊作者，楊秀娟（1972-），女，研究員，碩士，主要從事植物病害防治工作，E-mail：yxjzb@126.com。

甘林（1981-），男，助理研究員，碩士，主要從事植物病害防治工作，E-mail：millergan@yeah.net