乙烯利對‘明淮3號’山藥炭疽病抗性及相關基因表達的影響

摘要要：【目的】旨在探究乙烯利在山藥炭疽病防治中的具體施用方式，以及山藥噴施乙烯利后ERF96和抗病基因表達量的變化，為山藥產業(yè)綠色防控炭疽病提供參考方案?！痉椒ā窟x取‘明淮3號’山藥作為試驗材料，通過施用不同乙烯利濃度、次數(shù)、間隔天數(shù)的單因素處理，以及施用不同乙烯利濃度、次數(shù)的雙因素處理，對山藥的抗病性、產量和商品薯率等指標和施用乙烯利前后ERF96和PR1基因表達量進行測定?！窘Y果】單因素處理結果顯示，乙烯利噴施3次，間隔30 d，采用0.5 mM和1 mM的濃度處理均能顯著降低山藥病情指數(shù)；噴施0.5 mM乙烯利，間隔30 d，2次和3次噴施均能顯著降低山藥病情指數(shù)，兩者間無顯著差異；噴施0.5 mM乙烯利3次，30 d的噴施間隔天數(shù)防治效果最佳。雙因素組合試驗中，綜合各項指標，篩選出最有效的乙烯利噴施方式為A1B1（2次噴施0.5 mM乙烯利）防治效果為65.18%，667 m2山藥產量達到3 226.43 kg，商品薯率為93.78%。山藥在噴施2次0.5 mM乙烯利后，ERF96和PR1基因表達量分別提高了7.6倍和1.6倍，比清水對照得到顯著提高?！窘Y論】合理使用乙烯利能提升山藥的抗病性，且有利于提升產量和薯塊品質，具有良好的生態(tài)效益。

關鍵詞：山藥；乙烯利；抗病性；ERF基因；產量；商品薯率

中圖分類號：S632.1" " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0378-08

The Impact of Ethephon on Anthracnose Resistance and Related Gene Expression in Yam‘Minghuai 3’

Huang Zhehong，Chen Shipeng，Li Qing，Zhan Menglin，Chen Shuzun，Deng Caisheng，Ye Rongdi，Hua Shumei*

（Sanming Academy of Agricultural Sciences / Fujian Mountain Key Laboratory of Crop Genetic Improvenment

and Innovation Utilization for Mountainous Areas，Sanming，F(xiàn)ujian 365509，China）

Abstract：【Objective】The aim is to explore the specific application methods of ethephon in the prevention and control of anthracnose in yams，as well as the changes in the expression levels of ERF96 and disease resistance genes after yams are sprayed with ethephon，providing a reference plan for the green control of anthracnose in the yam industry. 【Method】‘Minghuai 3’yam was selected as the experimental material. Single-factor treatments with different concentrations，frequencies，and intervals of ethephon，as well as multi-factor treatments with different concentrations and frequencies of ethephon，were applied to measure the indicators of yam disease resistance，yield，and marketable tuber rate，and to determine the expression levels of ERF96 and PR1 genes before and after ethephon application. 【Result】The results of the single-factor treatments showed that spraying ethephon twice，with an interval of 30 days，using concentrations of 0.5 mM and 1 mM，could significantly reduce the yam disease index；spraying with 0.5 mM ethephon，with an interval of 30 days，both two and three times，could significantly reduce the yam disease index，with no significant difference between the two；spraying 0.5 mM ethephon three times，with an interval of 30 days，had the best control effect. In the double-factor combination trial，considering all indicators，the most effective ethephon application method was identified as A1B1 （two applications of 0.5 mM ethephon） with a control effect of 65.18%，yam yield on 667 m2 reaching 3 226.43 kg，and commercial yam rate of 93.78%. After two applications of 0.5 mM ethephon，the expression levels of ERF96 and PR1 genes increased by 7.6 and 1.6 times，respectively，significantly higher than those of the control treated with clear water. 【Conclusion】The rational use of ethephon can enhance the disease resistance of yams，and is conducive to improving yield and quality，offering good ecological benefits.

Key words：Yam；Ethylene；Disease resistance；ERF gene；Yield；Commercial yam rate

山藥（Dioscorea alata L.）屬于薯蕷科薯蕷屬，廣泛分布于我國淮河、華南、東北等地區(qū)，福建是山藥的原產地之一，種植面積逐年增加，目前約有1萬 ha。隨著山藥種植規(guī)模不斷擴大，種植年限增加，山藥炭疽病的發(fā)生越來越嚴重，造成山藥大幅度減產甚至絕收［1］。傳統(tǒng)化學農藥防治方法因抗藥性和環(huán)境問題而受限，不僅降低山藥炭疽病防治效果，同時威脅食品質量安全，因此急需開發(fā)綠色防控新途徑。

乙烯利作為一種植物激素乙烯的釋放劑，通過釋放乙烯來調節(jié)植物免疫，提高植物抗病性，在植物抗病反應中起著重要作用。例如，郝秉中等［2］研究者發(fā)現(xiàn)乙烯利能增強橡膠樹對條潰瘍病的抗性。董天宇［3］發(fā)現(xiàn)在成熟期的‘巨峰’葡萄上用400 mg/L乙烯利可以促進葡萄果實抵抗灰霉病，降低病斑面積。華樹妹等［4］發(fā)現(xiàn)，抗病山藥品種的葉片中乙烯含量和乙烯合成基因表達量較高，外源施加乙烯利能提高感病品種的抗病性。乙烯利應用于山藥生產，可減少其對化學農藥的依賴，對環(huán)境和食品安全具有積極影響，有利于綠色高效地防控山藥炭疽病，對福建山藥產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

植物的抗病機制復雜，包括形態(tài)結構抗病性、生理生化反應和外界刺激誘發(fā)的防衛(wèi)反應［5- 6］，噴施乙烯利可刺激誘發(fā)植物的防衛(wèi)反應。乙烯信號通路在植物對生物和非生物脅迫中起重要作用，ERF（Ethylene Response Factor）基因為該通路中的關鍵轉錄因子，通過調節(jié)下游基因的表達，參與植物的抗病反應［7］，比如在擬南芥中ERF96通過上調PDF和PR與病理相關的基因增加植株抗病性［8］。胡宇等［9］報道了OsERF1能被乙烯上調并且在水稻的不同器官中持續(xù)表達，而施用乙烯利對山藥的抗病因子ERF的影響尚未見報道。

本研究通過探討不同乙烯利施用濃度和施用方式對山藥炭疽病的影響，以及乙烯信號轉導通路最下游的關鍵因子ERF家族基因的表達，為進一步從分子生物學層面探究乙烯利如何增加山藥抗病性提供新思路，也為實際生產中山藥炭疽病的防治方法提供綠色高效新策略，從而助力山藥產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的山藥品種是三明市農業(yè)科學研究院自主選育的‘明淮3號’，為易感炭疽病品種。

1.2 試驗方法

試驗地設在三明市沙縣區(qū)瑯口鎮(zhèn)柱源村三明市農業(yè)科學研究院基地（117°8’ E，26°3’ N）。地塊為沙壤土，前作為水稻。山藥采用單行種植，畦溝寬為1.2 m，株間距為0.2 m。單因素試驗于2022年5月15日開始，每個處理的小區(qū)面積為24 m2，3次重復。

1.2.1 不同乙烯利濃度試驗

試驗設置5個濃度（0 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、5 mM）的乙烯利水劑，噴施于45 d齡的山藥幼苗葉片上，噴施3次，間隔天數(shù)為30 d。0 mM濃度為清水對照（CK），各處理重復3次。第一次施藥時間為5月中旬，最后一次施藥后7 d進行病情調查及分析。參照表1對山藥炭疽病病情進行分級［10］。病情指數(shù)與防治效果計算公式為：病情指數(shù)=Σ（病葉數(shù)×相對級數(shù)）/（調查總葉數(shù)×最高級數(shù)），防治效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)%。

1.2.2 不同乙烯利噴施次數(shù)試驗

試驗設置3個噴施次數(shù)處理（2次、3次、4次），將濃度為0.5 mM的乙烯利水劑噴施于45 d齡的山藥幼苗葉片上，每次施藥間隔30 d。以清水處理為對照（CK），各處理重復3次。最后一次施藥后7 d進行病情調查及分析，方法同1.2.1。

1.2.3 不同噴施乙烯利間隔天數(shù)試驗

試驗設置3個噴施間隔天數(shù)處理（20 d、30 d、40 d），將濃度0.5 mM的乙烯利水劑噴施于45 d齡的山藥幼苗葉片上，各噴施3次。以清水處理為對照（CK），各處理重復3次。最后一次施藥后7 d進行病情調查及分析，方法同1.2.1。

1.2.4 雙因素乙烯利組合處理試驗

通過對噴施次數(shù)、噴施濃度進行雙因素試驗，測定不同的乙烯利噴施組合處理對山藥病情指數(shù)、產量以及商品薯率的影響。設置乙烯利噴施次數(shù)為（A），噴施2次為A1、3次為A2；乙烯利濃度為（B），乙烯利0 mM（清水）為B0，0.5 mM為B1，1 mM為B2；雙因素試驗組合分別為A1B0、A1B1、A1B2、A2B0、A2B1和A2B2，各組合處理重復3次。試驗于2023年5月10日進行，在最后一次施藥后7 d進行病情調查及分析，方法同1.2.1。另外，在各組合處理成熟后，于2023年11月23日測定山藥產量及商品薯率，計算公式如下：

667 m2產量（kg）=小區(qū)產量/小區(qū)面積×667 m2

商品薯率（%）=商品薯重量/總薯重量×100%

1.2.5 山藥Da-ERF96基因表達量測定

于2023年7月17日采集雙因素試驗噴施2次0.5 mM乙烯利的處理組（A1B1）山藥葉片樣品以及對照組（A1B0）的山藥葉片樣品，通過液氮將山藥葉片磨成粉末，并稱取0.1 g放入離心管中。通過CTAB法提取RNA［11］，并通過試劑盒（TaKaRa反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit）逆轉錄成cDNA，將cDNA稀釋為15，以山藥葉片的cDNA為模版通過SYBR Green使用特異性引物進行實時PCR擴增，用 Quant Studio 3系統(tǒng)進行實時定量分析。具體擴增程序：預變性95℃，30 sec； 變性95℃，5 sec；復性60℃，30 sec，40個循環(huán)；延伸：95℃ 1 sec，60℃ 20 sec，95℃ 1 sec。

參考張青等［12］方法，通過山藥轉錄組設計山藥內參基因Da-Actin和Da-ERF96，具體序列信息如表2所示。每個樣品3次重復，采用2-△△Ct的方法來計算相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用完全隨機設計（CRD）重復，數(shù)據(jù)結果使用SPSS 22.0進行ANOVA統(tǒng)計分析（LSD）（n≧3），圖形結果使用GraphPad Prism軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度乙烯利對明淮3號山藥炭疽病的防治效果

圖1表明，經0.5～5 mM乙烯利噴施處理的山藥炭疽病病情指數(shù)均得到顯著降低。其中0.5 mM和1 mM乙烯利處理的病情指數(shù)分別為12.53和13.33，二者間差異不顯著，但均顯著低于其他處理；5 mM乙烯利處理的病情指數(shù)較高，指數(shù)為21.43，但也顯著低于CK。4種濃度乙烯利處理對山藥炭疽病的防治效果為33.54%～61.21%，以0.5 mM處理的防效最好，其次是1 mM乙烯利處理，防治效果為58.31%，二者均顯著優(yōu)于其他處理。綜合來看，噴施乙烯利可以調節(jié)植物免疫反應，可以顯著降低明淮3號山藥炭疽病的發(fā)生情況，且以噴施0.5 mM和1 mM乙烯利的防治效果較好。

2.2 乙烯利不同噴施次數(shù)對明淮3號炭疽病的防治效果

圖2結果表明，噴施0.5 mM乙烯利可以降低明淮3號炭疽病病情指數(shù)，不同噴施次數(shù)之間存在顯著差異。噴施2次和噴施3次的病情指數(shù)分別為16.53和15.75，顯著低于噴施1次，噴施2次和噴施3次之間差異不顯著。噴施0.5 mM乙烯利可以有效防治明淮3號炭疽病。噴施2次和噴施3次的防治效果分別為48.73%和55.09%，顯著高于噴施1次，噴施2次和噴施3次之間差異不顯著。綜合來看，噴施2次和噴施3次0.5 mM乙烯利對明淮3號炭疽病具有較好防治效果。

2.3 乙烯利噴施間隔天數(shù)對山藥炭疽病的防治效果

圖3結果表明，噴施0.5 mM乙烯利3次可以降低明淮3號炭疽病病情指數(shù)，不同噴施間隔時間之間存在顯著差異。噴施間隔30 d的病情指數(shù)最低，為11.18，顯著低于間隔20 d和40 d。噴施0.5 mM乙烯利3次可以有效防治明淮3號炭疽病，不同噴施間隔時間之間存在顯著差異。噴施3次0.5 mM乙烯利、每次間隔30 d的防治效果最好，為65.50%，顯著高于間隔20 d和40 d，對山藥炭疽病具有較好防治效果。

2.4 雙因素組合處理對山藥炭疽病防效、山藥產量和商品薯率的影響

如表3所示，A1B1、A1B2、A2B1和A2B2四個處理明淮3號后病情指數(shù)顯著低于對照，667 m2產量和商品薯率高于對照。

A1B1防治效果為65.18%高于A1B2的59.17%，A1B1的667 m2產量為3 226.43 kg顯著大于A1B2的產量2 766.1 kg，均顯著大于對照2 491.68 kg，A1B1商品薯率為93.78%顯著大于A1B2商品薯率89.45%，A2B1防治效果為67%高于A2B2的52.99%，A2B1的667 m2產量和商品薯率分別為3 003.31 kg和85.69%，均顯著高于A2B2的667 m2產量2 550.19 kg和商品薯率82.49%。使用0.5 mM濃度乙烯利更有利于提高明淮3號的抗病性及產量。

A1B1的防治效果低于A2B1，667 m2產量和商品薯率均顯著高于A2B1，綜合三個指標，在山藥生長期中噴施3次乙烯利更適用于明淮3號。因此最適合明淮3號的乙烯利處理方式為在A1B1即在生長期內噴施2次0.5 mM乙烯利。

2.5 乙烯利處理后山藥ERF96及抗病基因表達量的變化

乙烯利處理對Actin的表達量無影響，說明該熒光定量實驗結果成立。由圖4可知，通過乙烯利處理過的ERF96表達量顯著高于對照處理，表達量是對照處理的7.6倍，ERF96的表達量明顯增長。乙烯利處理后的PR1基因顯著高于對照處理，表達量是對照處理的1.6倍，表達量顯著提升。PR5處理前后無顯著差異。0.5 mM乙烯利處理后，ERF96、PR1基因表達量均得到顯著提高。ERF96可能通過提高PR1基因的表達來提高明淮3號的抗病性。

3 結論與討論

乙烯利通過釋放乙烯來調節(jié)植物免疫，提高植物抗病性，這點與一般農藥廣譜性殺害所有生物的防治機理不同，不會對有益微生物產生傷害［13］，并且其用量少、價格低、半衰期短［14］，具有高效（畝用藥低）、安全（對人畜、食品、環(huán)境安全）、經濟（用藥成本低）的優(yōu)勢。

本研究通過探討乙烯利不同施用處理方式對山藥抗病性及基于乙烯利最佳施用組合處理下對ERF96、PR等基因表達量的影響，表明2次噴施0.5 mM乙烯利的處理方式可有效防止山藥炭疽病的發(fā)生，同時提升山藥的產量和商品薯率。鐘慶燕［15］通過施用0.2 mM的乙烯利使得水稻防治紋枯病的防治效果達到了86.17%，與本研究結果相近。相較于傳統(tǒng)的利用化學農藥防止山藥炭疽病的方法，施用乙烯利對減少農藥殘留，保護生態(tài)環(huán)境以及對山藥產量和品質的提升均具有積極作用。施藥間隔時間與作物抗病性具有顯著相關性，乙烯利作為植物生長調節(jié)劑，頻繁施用會導致山藥植株矮小，而施用時間間隔太長則會導致防治效果下降，研究結果表明，30 d的施藥間隔天數(shù)對明淮3號這個品種最為適宜。

對雙因素組合下乙烯利施用效果評價，其中A1B1方案（2次噴施0.5 mM乙烯利）在提高山藥抗病性、產量和商品薯率方面表現(xiàn)最佳，該處理可使明淮3號667 m2產量達到3 226.43 kg，商品薯率提高至93.78%。有研究報道，噴施乙烯利能夠提高懷山藥的產量，施用50 mg/mL的乙烯利使懷山藥產量顯著高于對照組［16］；在甘薯種后57 d噴施乙烯利增加了22.02%的甘薯產量，與本試驗結果相近［17］。甘薯和山藥食用部位均在地下部，噴施乙烯利對于產量的影響，可能通過降低山藥前期葉片生長速度，達到控蔓效果，減少徒長，使得生長后期養(yǎng)分往地下部輸送，有利于山藥薯塊膨大，增加商品薯率。

ERF轉錄因子是乙烯信號轉導通路最下游的關鍵因子，對乙烯信號轉導通路有重要的影響。本研究進一步證明在山藥生長期使用0.5 mM，乙烯利噴施2次后，明淮3號ERF96基因表達量顯著提高，是對照的7.6倍。任雪巖等［18］通過對菠蘿施加乙烯利后第12 d AheERF1的表達量開始增加并在16 d達到頂峰，該結果與本研究相近。ERF96基因是乙烯通路途徑的相關基因，對山藥葉片施用乙烯后得到顯著提高。

在以往的研究中乙烯利主要作為植物抗逆劑及采后催熟劑開展應用［19］，本研究開發(fā)了其作為誘導山藥抗性藥劑。探究乙烯利在山藥生產中最適施用濃度和施用方式，為山藥炭疽病的綠色防控提供了新思路，對減少農藥的使用、推動山藥產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義。

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（責任編輯：許" "玲）

收稿日期：2024-08-28

基金項目：三明市科技計劃項目（2021-N-13）

作者簡介：*為通訊作者，華樹妹（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事薯類作物遺傳育種研究，E-mail：hsm20082006@126.com。

黃哲鴻（1994-），男，助理研究員，碩士，主要從事薯類病蟲害防治研究，E-mail：86231329@qq.com