蘭花根腐病病原菌分離鑒定及室內(nèi)藥劑篩選

摘要要：【目的】為探究引發(fā)蘭花根腐病的病原菌種類，及室內(nèi)不同化學藥劑與生物菌劑對蘭花根腐病的防治效果?！痉椒ā垦芯恳匀魇修r(nóng)業(yè)科學研究院蘭花種質(zhì)圃的3株墨蘭病株為樣本，采用組織分離技術、菌落形態(tài)觀察、分子生物學鑒定以及柯赫氏法則的病原菌致病性檢測分離鑒定病原菌。同時，測定平板抑制率分析7種化學藥劑和2種生物菌劑對分離菌株的抑制效果。【結果】從典型的蘭花根腐病病株分離純化后獲得3株培養(yǎng)性狀一致的菌株，其菌落形狀均為圓形，正面灰白色，邊緣整齊呈放射狀，氣生菌絲白色或灰白，稀薄棉絮狀，背面呈淡黃色或紫紅色；ITS、cal分子標記序列比對均與NCBI數(shù)據(jù)庫中尖孢鐮刀菌（登入號為：ON960618.1）的序列同源性為100%，系統(tǒng)進化表明二者在遺傳上緊密相關，致病性測定結果表明其發(fā)病癥狀與田間表現(xiàn)一致，符合柯赫氏法則，綜合形態(tài)學與遺傳學特征，鑒定出蘭花根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌。室內(nèi)藥劑篩選表明，3種化學藥劑多菌靈、代森錳鋅、喹啉酮和2種生物菌劑哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌對分離菌株的抑制效果較弱或者無效果；4種化學藥劑精甲·惡霉靈、精甲·嘧菌酯、克菌丹、咪鮮胺錳鹽對分離菌株的抑制效果較好，抑菌效果依次為咪鮮胺錳鹽gt;精甲·惡霉靈gt;精甲·嘧菌酯gt;克菌丹?！窘Y論】本研究分離鑒定出一種引發(fā)蘭花根腐病的病原菌尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，篩選出對蘭花根腐病室內(nèi)防治效果最佳的藥劑為咪鮮胺錳鹽，然后依次為精甲·惡霉靈、精甲·嘧菌酯、克菌丹，為蘭花根腐病的防治提供了技術參考。

關鍵詞：蘭花；根腐?。患怄哏牭毒?；防治藥劑

中圖分類號：S682.31" " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " 文章編號：2095-5774（2024）05-0350-08

Isolation and Identification of Pathogen of Orchid Root Rot and Screening of Laboratory Agents

Lin Huifeng，Xu Kezheng，Cao Yiyang，Zhou Huiming*，Lin Fazhuang，Gan Weixin

（Sanming Academy of Agricultural Scienses，Sanming，F(xiàn)ujian 365509，China）

Abstract：【Objective】To explore the species of pathogen causing orchid root rot and the control effect of different laboratory chemicals and bioagents on orchid root rot. 【Method】Three infected Cymbidium sinense strains from the orchid germplasm nursery of Sanming Academy of Agricultural Sciences were taken as samples in the study. The pathogen were isolated and identified by tissue separation，colony morphology observation，molecular biological identification，and pathogenicity detection by Koch's rule. At the same time，the inhibition rate of the plate was determined to analyze the inhibitory effect of seven chemical agents and two bioagents on the isolated strains. 【Result】The results showed that three strains with the same culture characteristics were obtained from the typical orchid root rot strains，which were gray and white with round colonies and neat and radial edges. The air mycelium was white or gray like thin cotton wool，the back of the colony was light yellow or purple red. The sequences of ITS and cal were 100% homology with those of Fusarium oxysporium （login number：ON960618.1）" in NCBI database. Phylogenetic evolution showed that the two pathogens were closely related genetically，and pathogenicity test results showed that three symptoms were consistent with field manifestations accordance fitting Koch’s rule. Combining morphological and genetic characteristics，the pathogen of orchid root rot was identified as Fusarium oxysporum. The results showed that three chemicals including carbendazim，mancozeb and oxine-copper，and two bioagents including Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis，had weak or no inhibitory effect on the isolated strains. Four chemicals including metalaxyl-M·hymexazol，metalaxyl-M·azoxystrobin，captan，and prochloraz-manganese chloride complex had strong inhibitory effect on the isolated strains. The sequence of inhibitory effect were prochloraz-manganese chloride complex gt; metalaxyl-M·hymexazol gt; metalaxyl-M·azoxystrobin gt; captan. 【Conclusion】A pathogen of orchid root rot was identified as Fusarium oxysporum.The best fungicide for controlling orchid root rot disease in laboratory was pokraman，and followed by propineb-hymexazol mixture，propineb-azoxystrobin mixture，captan，which provided a technical reference for the control of orchid root rot.

Key words：Orchid；Root Rot；Fusarium oxysporium；Laboratory Agents

蘭花，作為蘭科植物的統(tǒng)稱，涵蓋5個亞科、801屬、共計28 237種，是單子葉植物界中首屈一指的龐大科系［1］，其種類占比約達全球種子植物總數(shù)的十分之一。蘭花以其獨特奇異的花形、顯著的種間差異、以及多彩紛呈的花色著稱，部分品種更散發(fā)出令人陶醉的芳香，深獲全球愛花之人的青睞［2］。隨著社會經(jīng)濟水平的提升與民眾審美需求的增長，對高檔花卉尤其是蘭花的需求持續(xù)攀升，促使蘭花栽培面積不斷擴張。然而，在蘭花資源保育與產(chǎn)業(yè)化進程中，病害問題日益凸顯，特別是病害的發(fā)生與蔓延，已成為制約蘭花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的核心障礙［3］。根腐病作為一種常見的土壤傳播病害，在蘭花種植中廣泛存在，其病原主要包括惡疫霉（Phytophthora cactorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）及鐮刀菌屬（Fusarium）等多種真菌［4］；受該病害侵襲的蘭花，根部會出現(xiàn)褐色病斑，伴隨凹陷與壞死現(xiàn)象，隨著病情惡化病斑將環(huán)狀包圍莖基部與根部，最終導致整個根系腐爛，嚴重影響植株對水分與養(yǎng)分的吸收，引發(fā)生長遲緩、葉尖焦枯、葉片萎蔫乃至苞葉變黑枯死等一系列癥狀，對蘭花生長構成重大威脅，大幅削弱乃至剝奪其觀賞與經(jīng)濟價值［5-6］。目前，盡管蘭花根腐病的防治已經(jīng)有了系統(tǒng)的研究［7-8］，但鑒于種植地域、管理模式、氣候條件及土壤環(huán)境等因素的差異性，病害的具體表現(xiàn)與主導病原菌亦有所不同。為確定蘭花根腐病病菌的類型和特點，本研究對三明市農(nóng)業(yè)科學研究院蘭花種質(zhì)圃中的3株病株進行主要病原菌的組織分離、致病性檢測、形態(tài)學特征觀察及分子生物學鑒定，同時開展室內(nèi)9種不同的化學和生物藥劑對致病菌的抑制研究，以期為蘭花根腐病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料

2024年3-4月份在溫室大棚栽培條件下，蘭花根腐病零星發(fā)生，主要侵染幼苗的幼嫩葉片組織、莖和肉質(zhì)根，最后形成一圈褐腐區(qū)環(huán)繞植株，導致幼苗萎蔫、枯死。試驗材料為從三明市農(nóng)業(yè)科學研究院蘭花種質(zhì)圃收集的3株病害特征明顯的‘沙陽翠蝶’墨蘭病株。7種不同的化學藥劑分別為50%多菌靈可濕性粉劑（江陰福達農(nóng)化股份有限公司）、30%精甲·惡霉靈水劑（浙江禾本科技有限公司）、30%精甲·嘧菌酯懸浮劑（績溪農(nóng)華生物科技有限公司）、50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（臺灣富美實有限公司）、50%克菌丹可濕性粉劑（好速化學股份有限公司）、80%代森錳鋅可濕性粉劑（先正達（蘇州）作物保護有限公司）、33.5%喹啉酮水溶劑（安晨股份有限公司），2種不同的生物藥劑分別為50億有效活菌數(shù)/g哈茨木霉菌（山東海瑞斯海洋生物科技有限公司）、500億有效活菌數(shù)/g枯草芽孢桿菌（山東海瑞斯海洋生物科技有限公司）。

1.2病原菌的分離和純化

用組織分離法的方式從根腐病發(fā)病的蘭花病株中分離病原菌，先將蘭花病株用自來水沖洗干凈，再用75%的酒精漂洗15 s，然后用無菌水沖洗3～5次，用消毒過的濾紙吸干水分，再用0.1%的升汞漂洗15 s，無菌水沖洗3～5次，并用無菌濾紙吸干水分。將消毒后的外植體在病健交界處取直徑0.5 cm大小的葉片組織，接種于滅菌后的PDA平板上，放置在25℃的環(huán)境中遮光培養(yǎng)5～7 d。再將新長出的菌落從邊緣挑取菌絲塊接種到新的PDA平板上，多次純化直到形成單菌落并觀察拍照。

1.3分子生物學鑒定

將分離出的病原菌接種到PDA平板上，培養(yǎng)5～7 d后收集菌絲，用BIO～TEK公司的HP Plant DNA Mini Kit試劑盒提取菌株的DNA。病原菌分子鑒定采用ITS+cal的復合鑒定方式進行，真菌ITS的PCR擴增引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；cal的PCR擴增引物為CL1（GARTWCAAGGAGGCCTTCTC）和CL2A（TTTTTGCATCATGAGTTGGAC）。PCR反應體系（50 μL）：DNA模板2 μL，正反引物各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，用ddH2O補充至50 μL。PCR擴增程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物取10 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，之后再將PCR產(chǎn)物送至福州尚亞生物技術有限公司進行測序。用NCBI數(shù)據(jù)庫進行ITS、cal序列同源性對比；利用MEGA4.0軟件和鄰接法建立系統(tǒng)進化樹并進行ITS和cal序列的譜系分析。

1.4致病性檢測

葉片致病性檢測：將分離純化得到的病原菌取直徑0.5 cm的菌絲塊，菌絲面貼至蘭花預先用刀尖刺傷的葉片上，無傷接種作為對照（CK）。所有處理正常保濕處理，定期拍照觀察葉片發(fā)病情況。蘭花幼苗致病性檢測：選取一年生墨蘭盆栽幼苗，用無菌槍頭輕輕劃傷幼苗根頸部，迅速將菌株的孢子懸浮液（濃度為1×106孢子/mL）噴施在蘭花幼苗根頸部，對照組在劃傷處噴施清水，正常栽培管理，定期拍照觀察幼苗發(fā)病情況。最后再從處理后發(fā)病的病株上分離病原菌，并鑒定其是否與分離菌株為同一病原菌。

1.5不同藥劑的室內(nèi)抑制試驗

將9種藥劑設置成250、500、1 000、2 000和4 000倍等5種不同濃度分別加入PDA培養(yǎng)基中，加入無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對照組。取等大小的菌絲塊分別接種于不同濃度藥劑的培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)皿倒置放在25℃室溫培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑大小，每個處理重復3次。

2 結果與分析

2.1蘭花根腐病田間病害癥狀

試驗收集的蘭花病株的發(fā)病特征為從莖基部、根頸部向全根發(fā)展，造成根部皮質(zhì)壞死，表皮脫落，木質(zhì)部呈褐色，地上部由苗心開始褐化腐爛，最后整棵植株都會死亡，為典型的根腐病發(fā)病病株（圖1）。

2.2病原菌的形態(tài)學特征

對收集的3份蘭花病株進行分離純化，獲得編號為LH-31、LH-32、LH-33的3株菌株，其培養(yǎng)性狀基本一致，菌落均為圓形，正面灰白色，邊緣整齊呈放射狀，氣生菌絲白色或灰白，稀薄棉絮狀（圖2A）；圓形背面呈淡黃色或紫紅色（圖2B）；顯微形態(tài)觀察顯示其菌絲呈現(xiàn)為細長的絲狀結構，通常單細胞或多細胞排列成鏈狀（圖2C）；分生孢子為橢圓型或鐮刀形，兩端梭形，分離的3株病原菌初步鑒定為鐮刀菌（圖2D）。

2.3分子生物學鑒定結果

以各個菌株的DNA作為模板，采用ITS+cal的復合鑒定方式，成功獲得3個菌株的PCR片段，測序結果表明，3個菌株的ITS序列和cal序列完全相同，鑒定為同一病原菌，命名為LH-31。NCBI數(shù)據(jù)庫的序列對比結果顯示，LH-31的ITS序列和cal序列與數(shù)據(jù)庫中的尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，（登入號為ON960618.1）的ITS、cal序列同源性為100%。進一步的系統(tǒng)進化樹分析結果顯示，LH-31與Fusarium oxysporum的 ITS 、cal序列聚在同一個分枝（圖3），二者遺傳距離最近，同源性最高。結合形態(tài)學特征，本研究分離的蘭花根腐病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum。

2.4致病性檢測結果

接種菌株LH-31的蘭花葉片在7 d后明顯出現(xiàn)黑色病斑，而對照葉片無病斑出現(xiàn)（圖4A）。進一步驗證分離菌株在蘭花植株上的致病性，研究通過傷根接種法將LH-31的菌株孢子懸浮液（濃度為1×106孢子/mL）噴施在蘭花幼苗根頸部，以等量清水噴施的根頸部的蘭花幼苗作為空白對照（CK）。結果顯示，接種LH-31的蘭花幼苗在15 d后，植株根頸部開始發(fā)病，地上部分從苗心開始出現(xiàn)枯死癥狀，隨后整株葉片枯死，而CK處理下的蘭花幼苗僅劃傷部位出現(xiàn)愈合痕跡（圖4）。根據(jù)柯赫氏法則進行接種后病原菌再分離鑒定的結果表明，菌落、菌絲及孢子形態(tài)等與之前分離的菌株均一致，說明分離菌株為蘭花根腐病病原菌。

2.5不同藥劑的室內(nèi)抑制試驗

不同化學和生物藥劑對病原菌的抑制效果不同，與CK相比，化學藥劑只有精甲·惡霉靈、精甲·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽、克菌丹等4種藥劑對分離菌株有抑制作用，但抑制效果存在明顯差異。其中，咪鮮胺錳鹽、精甲·惡霉靈和精甲·嘧菌酯，在250～4 000倍液對分離菌株均有抑制效果，而克菌丹僅在1 000倍液范圍內(nèi)有抑制效果；生物藥劑僅哈茨木霉在250倍液對分離菌株有抑制效果，而枯草芽孢桿菌則呈現(xiàn)無差異。通過對比各藥劑產(chǎn)生的菌落直徑，發(fā)現(xiàn)對分離菌株有較好抑制效果的4種菌劑均為化學藥劑，抑菌效果依次為咪鮮胺錳鹽gt;精甲·惡霉靈gt;精甲·嘧菌酯gt;克菌丹（表1）。

3討論與結論

鐮刀屬的真菌的分布非常廣泛，能夠侵染眾多植物種類，導致根腐病或莖腐病的發(fā)生，嚴重影響植物的生長和產(chǎn)量［9-11］。ITS測序是目前應用最普遍的真菌分子水平鑒定方法［12］，王峰等［13］通過ITS測序發(fā)現(xiàn)貴州省臺江縣多花黃精根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌；蘇曉梅等［14］也用ITS測序研究發(fā)現(xiàn)番茄頸腐根腐病作為一種土壤傳播的病害，其病原同樣指向尖孢鐮刀菌的一個特定?；?，即番茄頸腐根腐病專化型；還有一些研究表明鈣調(diào)素（calmodulin，cal）參與了病原真菌菌絲生長、孢子萌發(fā)、附著胞形成或致病性的調(diào)控等［15］，可用于植物病原菌的鑒定。本研究通過ITS+cal測序的復合鑒定方式，結合形態(tài)學特征等，鑒定出蘭花根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，為蘭花根腐病的防治提供應用基礎。

研究表明，根腐病的防治主要采用化學藥劑和生物菌劑的方式［16］，多菌靈是廣譜殺菌劑，多用于植物真菌性病害的防治，但是在本實驗中抑菌效果不佳，可能是由于尖孢鐮刀菌對藥劑不敏感導致。薛昭霖等［17］研究發(fā)現(xiàn)大豆疫霉根腐病的防治可以選用苯甲·嘧菌酯（0.5%苯醚甲環(huán)唑、0.5%嘧菌酯）；苗圃等［18］研究表明30%霜霉·嘧菌酯對鳶尾絲囊霉引起的煙苗根腐病具有較好防效效果，這與本研究結果相似。本研究結果表明，嘧菌酯類藥劑可以有效防治蘭花根腐病。生物防治由于其綠色環(huán)保越來越受到關注和應用［16］，目前用于防治的菌株種類主要有芽孢桿菌和木霉菌［18-19］，陳文樂［20］研究表明1 000億cfu/g的芽孢桿菌和3億cfu/g的哈茨木霉菌對非洲菊根腐病的防治效果較好，防效均超過75%，這與本研究結果不同。本研究表明，50億有效活菌數(shù)/g哈茨木霉菌和500億有效活菌數(shù)/g枯草芽孢桿菌對蘭花根腐病的防治效果不佳，這可能是由于鐮刀菌致病力強、易變異、易形成抗藥性，且不同種類或者分離于不同寄主與地域的鐮刀菌，對藥劑敏感性也存在差異導致的［21］。本研究選取7種商用化學藥劑和2種生物菌劑應用于蘭花根腐病的尖孢鐮刀菌的抑制效果研究。綜合得出，針對尖孢鐮刀菌室內(nèi)防治效果較好的有咪鮮胺錳鹽、精甲·惡霉靈、精甲·嘧菌酯、克菌丹等4種化學藥劑。但在田間的防治效果尚不清楚，因此今后需要在田間開展蘭花根腐病防治藥劑的研究。

綜上，本研究從典型的墨蘭蘭花根腐病病株分離純化后獲得一株命名為LH-31的病原菌，經(jīng)形態(tài)學、ITS、cal分子標記分析和柯赫氏法則驗證，鑒定為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum，進一步篩選出4種化學藥劑適用于該病菌的室內(nèi)防治，抑菌效果依次為咪鮮胺錳鹽gt;精甲·惡霉靈gt;精甲·嘧菌酯gt;克菌丹，為蘭花根腐病的防治提供了技術參考。

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（責任編輯：黃" "鵬）

收稿日期：2024-06-20

基金項目：福建省科技計劃項目（2023S0026）；福建省級財政花卉產(chǎn)業(yè)發(fā)展項目（閩財資環(huán)指［2022］47號）

作者簡介：*為通訊作者，周輝明（1980-），男，研究員，碩士，主要從事花卉選育種、生物技術研究，E-mail：120914051@qq.com。

林輝鋒（1984-），男，副研究員，碩士，主要從事花卉生物技術研究，E-mail：289687622@qq.com