天子藍盤麗魚皮膚組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序

摘要：【目的】通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序比較天子藍盤麗魚和野生阿蓮卡盤麗魚皮膚組織中與體色形成相關(guān)的基因 表達模式，為深入研究魚類體色及良種選育提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為盤麗魚或其他水產(chǎn)魚類進行單細胞轉(zhuǎn)錄組研究提供 技術(shù)借鑒?！痉椒ā坷脝渭毎D(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對天子藍（人工選育）和阿蓮卡（野生型）2種盤麗魚的皮膚組織進行轉(zhuǎn) 錄組測序，經(jīng)fastp質(zhì)控過濾后，通過Cell Ranger比對參考基因組生成單細胞表達矩陣文件，使用Seurat進行降維聚類 后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組圖譜，篩選出細胞類型識別與鑒定的標(biāo)記基因；同時以阿蓮卡盤麗魚為對照，通過DEGseq篩選出2個樣本間的差異表達基因（DEGs），并進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析。【結(jié)果】經(jīng)單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，從天子藍、阿蓮卡盤麗魚樣本中獲得的原始序列（Raw reads）分別為815237286和728886552條；將2個樣本整合后共捕獲17035個細胞，經(jīng)過濾及降維聚類后得到18個細胞簇（C0～C17），參考已知和潛在的標(biāo)記基因，被注釋為13種細胞類型及其亞型，基本涵蓋了魚類皮膚組織中的大部分細胞類型?；趥闻浚≒seudo-bulk）處理，從2個樣本間篩選出20個DEGs（8個在天子藍盤麗魚皮膚組織中高表達，12個在阿蓮卡盤麗魚皮膚組織中高表達），主要注釋到與氣體傳遞、氧化代謝相關(guān)的GO功能條目。在單細胞維度，選擇黑色素細胞和虹彩細胞2個細胞集群進行樣本間差異分析，結(jié)果顯示：在黑色素細胞中存在8個DEGs，主要富集于熱應(yīng)答、未折疊蛋白結(jié)合、生長因子活性、金屬離子結(jié)合等信號通路。在虹彩細胞中存在25個DEGs，KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)主要富集于凋亡、沙門氏菌感染和MAPK等信號通 路，涉及細胞生存、應(yīng)激響應(yīng)和信號傳導(dǎo)等功能。【結(jié)論】TSPAN3A、PTGES、ATF3、JUNK、GADD45GA、HSP70L、FOSAB 等基因在調(diào)節(jié)天子藍盤麗魚皮膚體色、色素合成與沉著等方面發(fā)揮重要作用，而黑色素合成不活躍可能是導(dǎo)致天子 藍盤麗魚體色較阿蓮卡盤麗色更加鮮艷和絢麗的主要原因之一。

關(guān)鍵詞：盤麗魚；單細胞轉(zhuǎn)錄組測序；標(biāo)記基因；色素細胞；體色

文章編號：2095-1191（2024）03-0601-10

中圖分類號：S965.819

文獻標(biāo)志碼：A

Single–cell transcriptome sequencing of skin tissue in bluediscus fish （Symphysodon spp.）

YANG Ping1， LIU Jie1， CHEN Zai-zhong*， LU Ying1*

（1Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural

Affairs（Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China）

Abstract：[Objective】 To profile and compare the expression patterns of the genes involved in formation of body color between the skin tissues of blue discus fish and wild Alenquer discus fish through a single-cell transcriptome se- quencing， which provided the data basis for further study of body color and breeding， as well as the technical reference for the single-cell transcriptome studies in discus fish and other fishes. 【Method】Using the single-cell transcriptome se- quencing technology， transcriptome sequencing was performed on the skin tissues of blue discus fish （bred strain） and Alenquer discus fish （wild type）. The expression matrix of single-cell data was generated by Cell Ranger alignment against reference genomes after fastp quality control filtration， which was used for dimensionality reduction clustering to construct transcriptome atlas by Seurat and indentification of cell types referencing the marker genes. The differentially expressed genes （DEGs） between the two samples were identified by DEGseq， which was annotated through the GO functional analysis and KEGG pathway enrichment. 【Result]Through single-cell transcriptome sequencing， up to 815237286 and 728886552 raw reads were generated in blue discus and Alenquer discus， respectively. A total of 17035 cells were cap- tured after the integration of the two samples' data， which built 18 clusters （C0-C17） after filtering and dimensionality re- duction. Referred to known and potential marker genes， these clusters were divided into 13 cell types and their subtypes， which encompassed most of the cell types in fish skin. Based on pseudo-bulk treatment， 20 DEGs were detected from the 2 samples （8 were highly expressed in blue discus and 12 were highly expressed in Alenquer discus）， mainly annotated to GO functional terms of gas transport and oxidative metabolism. In the single-cell dimension， two cell clusters of mela- nocytes and iridophore were selected for inter-sample difference analysis， which detected eight DEGs in melanocytes， in- volving in response to heat， cytoplasm， unfolded protein binding， growth factor activity and metal ion binding. Twenty- five DEGs were found in iridophore， which were mainly employed in the signaling pathwasy， such as apoptosis， Salmo- nella infection and MAPK， cell survival， stress response and signaling. 【Conclusion】TSPAN3A， PTGES， ATF3， JUNK， GADD45GA， HSP70L and FOSAB genes play an important role in regulation of pigment biosynthesis and pigmentation of blue discus fish skin. The inactive synthesis of melanin probably results in more vivid and gorgeous body color in blue dis- cus than Alenquer discus.

Key words： discus fish; single-cell transcriptome sequencing; marker gene; pigment cell; body color

Foundation items： Blue Granary Science and Technology Innovation Project of National Key Research and Development Program of China （2022YFD2400804）

0 引言

【研究意義]盤麗魚（Symphysodon spp.）俗稱七彩神仙魚，隸屬于慈鯛科（Cichlidae），因其鮮艷多彩 的體色和獨特的體型而備受養(yǎng)魚愛好者青睞（劉怡 南等，2020）。體色作為盤麗魚的重要屬性，不僅能 反映其生理健康，還決定了觀賞價值和市場價格。 魚類體色的形成涉及復(fù)雜分子機制，包括色素細胞 發(fā)育、色素合成與沉積等多個環(huán)節(jié)（程云生等，2015）， 因此，挖掘分析與盤麗魚體色相關(guān)的基因，了解其關(guān) 鍵基因及信號通路，對揭示盤麗魚體色調(diào)控機制具 有重要意義，同時可為選育體色穩(wěn)定遺傳的盤麗魚 品系提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】魚類體色之所 以豐富多彩，是由于其皮膚組織含有不同類型的色 素細胞，包括黑色素細胞、紅色素細胞、黃色素細胞、 白色素細胞及虹彩細胞（鳥糞素細胞）（Fadeev et al.， 2016；韋玲靜等，2020）。皮膚組織中的呈色物質(zhì)分 別是黑色素細胞的黑色素及紅、黃色素細胞的嘧啶 和類胡蘿卜素，但只有黑色素和嘧啶都能在魚體內(nèi) 自我合成，而類胡蘿卜素必須通過食物、環(huán)境等方式 從外界攝入補充（劉曉東和陳再忠，2008）。虹彩細胞本身不含色素，但含有鳥嘌呤晶體所構(gòu)成的反射小板，通過反射特定波長的光來顯色（田浚杉等， 2024）。這些色素細胞的數(shù)量組成及其在皮膚組織 中的分布情況，形成了魚類絢麗的體色和斑紋。如 斑馬魚具有交替的深色和淺色水平條紋，是由三類 色素細胞（黑色素細胞、黃色素細胞和虹彩細胞）的精確排列而產(chǎn)生（Patterson and Parichy，2019）。馮 彩等（2020）通過對不同體色草金魚的背部鱗片色素 細胞進行觀察，確定4種色素細胞形狀、組成和密度的不同形成了草金魚多彩的體色；周康奇等（2020） 研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)血鸚鵡魚體內(nèi)的黑色素細胞和黃色 素細胞少，而皮膚和鱗片上大量分布有紅色素細胞。 至今，針對盤麗魚體色的相關(guān)研究主要集中在影響 因素和調(diào)控機制2個方面。在影響因素方面，有研 究發(fā)現(xiàn)添加適量的蝦青素不僅能增強盤麗魚顯色 （黃璞等，2011），還能改善其形體（Song et al.， 2017）；王磊等（2016）研究證實，在飼料中加入葉黃 素可有效改善盤麗魚體表黃色，提高肝臟總抗氧化 能力。在調(diào)控機制方面，Yang等（2021）通過比較代 謝組學(xué)分析藍色、黃色、白色盤麗魚的代謝物含量， 發(fā)現(xiàn)黃色個體蝦青素含量更高，與脂質(zhì)代謝、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白途徑及不飽和脂肪酸生物合成更豐富有 關(guān)，而藍色個體富含腺嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤；李 中軍等（2022）通過研究全藍、白化全藍、全白盤麗魚 皮膚組織轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)其差異表達基因（Differen- tially expressed genes，DEGs）主要富集在氧化磷酸 化、檸檬酸循環(huán)、嘌呤合成及肌動蛋白組織等信號通 路上；吉鈺等（2023）對盤麗魚的全藍型群體和白化 藍型群體進行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP43、FGFR2、DENND4、MLL1基因可能與其體色形成密切相關(guān)；Ng等（2023）通過對野生型盤麗魚皮膚不同 顏色進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)條紋形成區(qū)域皮膚 組織的關(guān)鍵調(diào)控基因包括ERBB4、ADCY9、WNT2、14-3-3和TSPAN?！颈狙芯壳腥朦c】盤麗魚不同品系 間的體色、斑紋差異明顯，但其種內(nèi)遺傳距離很小、 遺傳信息差異不明顯（陳信忠等，2016），傳統(tǒng)的組學(xué) 研究對象多為組織或個體，細胞間存在的異質(zhì)性通 常被忽略。盤麗魚皮膚組織中的細胞群體，尤其是色素細胞的差異和互作關(guān)系對體色的形成與調(diào)控影 響極大，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能對單個細胞 進行測序，捕獲單個細胞的基因表達信息，更深入地 理解細胞群體內(nèi)部的多樣性和復(fù)雜性，提供更全面 的基因表達圖譜，而有助于揭示影響盤麗魚體色形 成的分子機制。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建單細胞轉(zhuǎn) 錄組測序的盤麗魚皮膚組織圖譜，篩選出皮膚組織 細胞潛在的標(biāo)記基因，并從天子藍和阿蓮卡品系盤 麗魚皮膚組織中篩選出與體色有關(guān)的DEGs，為深入 研究魚類體色及選育優(yōu)良物種提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為 盤麗魚或其他水產(chǎn)魚類進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序提供 技術(shù)借鑒。

1材料與方法

1.1材料取樣與轉(zhuǎn)錄組測序

供試動物為人工選育的雌性天子藍盤麗魚（體 色為深藍色，簡稱TZL）和野生型雌性阿蓮卡盤麗魚（體色為紅棕色，簡稱為AD），2種盤麗魚體色均穩(wěn) 定遺傳（圖1），由上海海洋大學(xué)觀賞水族養(yǎng)殖實驗室 提供。取樣時，將盤麗魚置于低溫環(huán)境中，每尾魚選 取3塊2cm2左右的區(qū)域，刮除表面鱗片后用無菌手 術(shù)刀將皮膚組織切割成若干小塊，以PBS沖洗2遍，放入2mL的EP管中，并立即加入組織保存液，確保樣品全部浸潤。隨后將EP管插入碎冰中固定，送至 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成懸液制備和轉(zhuǎn) 錄組測序。上機采用10×Genomics平臺的油滴包裹單細胞微反應(yīng)體系GEMs，實現(xiàn)cDNA擴增和片段化處理，利用Qubit構(gòu)建并定量二代測序文庫，構(gòu)建完 成的文庫采用PE150測序模式在Illumina HiSeq平 臺完成測序。

1.2測序數(shù)據(jù)評估及預(yù)處理

下機后的原始數(shù)據(jù)（Raw data）通過fastp進行基本的統(tǒng)計和質(zhì)量評估，隨后使用10×Genomics官方 提供的Cell Ranger進行預(yù)處理。運用Cell Ranger中的mkref子命令對盤麗魚的參考基因組（由wtdbg2組裝和EVidenceModeler預(yù)測而得）和GTF注釋文 件建立索引，隨后使用另一子命令Count對數(shù)據(jù)質(zhì) 量進行評估和測定，并將下機后的fastq文件通過 STAR功能比對到索引上，最終生成用于單細胞下游分析的單細胞表達矩陣文件（Dobin et al.，2013）。

1.3多樣本整合及批次效應(yīng)去除

采用Seura自帶的CCA方法整合TZL組和AD 組數(shù)據(jù)集并去除批次效應(yīng)。尋找批次間的最小互近鄰（Mutual nearest neighbor，MNN），使用FindInte- grationAnchors函數(shù)識別錨點細胞，然后將這些錨點傳遞給IntegrateData函數(shù)，再根據(jù)這些細胞對計算 校正因子，用于整合樣本和校正批次效應(yīng)。

1.4降維聚類與細胞類型注釋

采用R的 Seurat 包創(chuàng)建分析對象，在質(zhì)控基礎(chǔ) 上進一步過濾，過濾掉捕獲基因數(shù)量大于2500和基 因數(shù)量小于200及線粒體基因比例大于5%的細胞； 隨后采用全局縮放歸一化方法“l(fā)og Normalize”，設(shè) 參數(shù)“scale.factor=10000”標(biāo)準(zhǔn)化處理，使用FindVari- ableFeatures函數(shù)抓取顯著差異的2000個高度可變 特征基因，用于主成分分析（PCA）。使用RunPCA對數(shù)據(jù)集進行降維處理，隨后通過ElbowPlot函數(shù)選定肘點，以此確定降維聚類的PC值，接著以Find- Neighbors 函數(shù)構(gòu)建K鄰近（K-nearest neighbor，KNN） 網(wǎng)絡(luò)圖，dims參數(shù)設(shè)為確定的PC值。聚類分析時利用FindClusters函數(shù)通過調(diào)節(jié)分辨率大小（0.4～1.2）對KNN網(wǎng)絡(luò)圖進行分群，Seurat提供多種非線性降 維方法，包括UMAP和TSNE；通過函數(shù)RunUMAP和RunTSNE分別進行UMAP和TSNE降維聚類分 析，再利用Vlnplot、Featureplot和dotplot 等方法將 FindMarker檢索到細胞簇（Cluster）中高表達基因的 表達情況可視化，以斑馬魚和尼羅羅非魚（與盤麗魚 同慈鯛科）為參考，通過BLASTp方式注釋基因，細胞 類型識別使用斑馬魚研究或報道過的標(biāo)記基因，以 及FishGET數(shù)據(jù)庫進行輔助鑒定（Guo et al.，2023）。

1.5DEGs篩選及其功能注釋分析

使用Seurat的 AverageExpression 函數(shù)獲取所有 基因在不同分組或分群下的表達均值列表，通過DEGseq包的DEGexp2函數(shù)，選用MARS基于MA圖的隨機抽樣模型方法（Wang et al.，2010），將其他參數(shù)設(shè)為默認值，以TZL為試驗組，AD為對照組，DEGs篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2Fold Changegt;1且Plt;0.05。然后，利用DAVID工具對DEGs進行GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析，并以R中的ClusterPro-filer、enrichplot和ggplot2包進行可視化。

2結(jié)果與分析

2.1單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜構(gòu)建情況

2.1.1數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果 通過fastp對10xGenomics 下機后的TZL組和AD組Raw data進行質(zhì)控并統(tǒng) 計。TZL組和AD組獲得的原始序列（Raw reads）分別為815237286和728886552條。2個樣本的Q20超過96.00%、Q30超過91.00%，GC含量分別為48.58%和47.28%，堿基錯誤率在0.02%～0.04%（未超過 1.00%的標(biāo)準(zhǔn)線），即測序數(shù)據(jù)符合下游分析要求。 通過Cell Ranger的Count子命令生成單細胞下游分 析的表達矩陣，儲存在barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz 和matrix.mtx.gz的3個壓縮文件，同時對數(shù)據(jù)集進行 統(tǒng)計和評估，得知2個樣本捕獲的細胞數(shù)分別為 8856和8255個，基因中位數(shù)為655和791個。

2.1.2數(shù)據(jù)整合及批次效應(yīng)去除效果

通過merge 將TZL組和AD組2個樣本數(shù)據(jù)整合成1個數(shù)據(jù)集 進行分析（以下簡稱Discus 2），共捕獲17035個細 胞。首先要去除批次效應(yīng)，若不去除，合并數(shù)據(jù)在降 維后樣本與樣本分開，無法很好地混合（圖2），而導(dǎo) 致后續(xù)分簇時基因表達變化的定量分析受批次效應(yīng) 影響，使得原本聚類在一起的細胞被分成不同簇，進 而影響細胞亞群鑒定的準(zhǔn)確性及下游分析結(jié)果。

2.1.3降維聚類和細胞類型注釋結(jié)果

Discus 2降維后選取PC值為15，選擇的分辨率為0.5，共鑒定出 18個細胞簇。由圖3可知，部分基因只在特定的細 胞簇中表達，可將此類基因作為潛在的Marker用于 注釋細胞類型。為了更好地鑒定細胞類型，標(biāo)記基 因主要選自于斑馬魚。相對于盤麗魚，斑馬魚的研究更廣泛，標(biāo)記基因的功能和表達模式分析更全面， 是一個很好的參考標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)pt.size為2時繪制出的細胞圖譜（圖4-A），細胞簇編號分別為C0～C17，共18個細胞簇，其中部分細胞簇聚集在一起（C0～C5），故推測這6個細胞 簇是相同的細胞類型；其余細胞簇則分離散開， 可能是獨立的細胞類型。通過與參考標(biāo)記基因 的比對分析，發(fā)現(xiàn)18個細胞簇分別被注釋為表皮細 胞（Epidermal cells，C0～C5）、基底細胞（Basal cells， C6）、上皮細胞（Epithelial cells，C7）、成纖維類上皮 細胞（Fibroblasts-epithelial cells，C8）、類上皮細胞 （Epithelial-related cells，C9）、紅細胞（Erythroid cells， C10）、杯狀細胞（Goblet cells，C11）、成纖維細胞 （Fibroblasts，C12）、免疫細胞（Immune cells，C13）、 表皮巨噬細胞（Epidermal-macrophage cells，C14）、內(nèi) 皮細胞（Endothelial cells，C15）、黑色素細胞（Mela- nocyte，C16）及虹彩細胞（Iridophore，C17）（圖4-B）。 其中，紅細胞的出現(xiàn)可能是取樣過程中劃破皮膚導(dǎo) 致血液滲出，也可能是取樣時生物體應(yīng)激導(dǎo)致皮膚 毛細血管擴充造成皮膚充血，而導(dǎo)致取樣時有紅細 胞混入。大部分細胞群的細胞類型是通過細胞已知的標(biāo)記基因進行注釋，僅少數(shù)類群通過多個潛在的 Marker綜合評估以完成細胞鑒定。

2.2DEGs篩選及其功能注釋分析結(jié)果

2.2.1未去批次效應(yīng)前的DEGs分析

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn) 錄組只能對整個組織或器官進行測序分析，獲得每 個基因在整個樣本的平均表達情況。經(jīng)偽批量（Pseudo-bulk）處理后（Chaffin et al.，2022），從2個單 細胞測序樣本間篩選出20個DEGs，相對于AD組而言，TZL組中有8個DEGs上調(diào)表達、12個DEGs下調(diào)表達。GO功能注釋分析結(jié)果（圖5）顯示，20個DEGs 被注釋到分子功能（Molecular function）、細胞組分（Cellular component）及生物學(xué)過程（Biologicalprocess）三大功能類別上。在分子功能類別上，主要注釋到核糖體結(jié)構(gòu)成分（Structural componentof ribosome）、氧載體活性（Oxygen carrier activity）及氧結(jié)合功能（Oxygen binding）等GO功能條目;在細胞組分類別上，主要注釋到核糖體亞基（Ribosomalsubunit）、血紅蛋白復(fù)合物（Hemoglobin complex）、核糖體（Ribosome）等 GO功能條目;在生物學(xué)過程類別上，注釋到與氧氣運輸（Oxygen transport）、氣體運輸（Gas transport）、過氧化氫分解過程（Hydrogenperoxide cotabolic process）等GO功能條目。KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，20個DEGs只富集到1條信號通路核糖體通路（Ribosome pathway）。

2.2.2去批次效應(yīng)后的 DEGs分析

由于已完成降維聚類和細胞類型注釋，因此以同種細胞的不同樣本進行DEGs篩選及 GO功能注釋分析和KEGG信號通路富集分析。選擇黑色素細胞和虹彩細胞 為重點研究對象，結(jié)果顯示：在黑色素細胞中存在 8個DEGs，其中4個DEGs呈上調(diào)表達、4個DEGs呈 下調(diào)表達；GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)主要注釋到熱應(yīng) 答、細胞質(zhì)、未折疊蛋白結(jié)合、生長因子活性、金屬 離子結(jié)合等功能條目。在虹彩細胞中鑒定出25個 DEGs，其中19個DEGs呈上調(diào)表達、6個DEGs呈下調(diào)表達；GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在生物學(xué)過程類別 上主要涉及細胞生物學(xué)、應(yīng)激響應(yīng)、蛋白質(zhì)折疊和調(diào) 控等GO功能條目，在細胞組分類別上主要涉及細 胞的基本功能和結(jié)構(gòu)；KEGG信號通路富集分析發(fā) 現(xiàn)主要富集于凋亡、沙門氏菌感染和MAPK信號通 路等，涉及細胞生存、應(yīng)激響應(yīng)及信號傳導(dǎo)等功能。

3討論

3.1細胞類型鑒定及圖譜構(gòu)建

本研究共捕獲細胞數(shù)17035個，降維聚類后得 到18個細胞簇；經(jīng)細胞類型鑒定，18個細胞簇被注 釋為13種細胞類型及其亞型。其中，某些細胞亞群鑒定有一定難度，如C7、C8、C9、C12和C14等。krt8基因是上皮細胞的標(biāo)記基因（Orkin and Zon，2008），但在C7和C9中的表達量均遠高于其他細胞簇，因此將C7和C9均鑒定為上皮細胞。此外，C9中還存 在1個高表達基因ttc36，是顱神經(jīng)脊細胞的標(biāo)記基因（Lukowicz-Bedford et al.，2022），且只在C9中 表達，但該細胞類型只出現(xiàn)在胚胎階段。collala基 因常用于表征成纖維細胞（Metikala et al.，2021），除了在C8中高表達外，在C7和C12中也有表達C8中 還有1個高表達基因icn2，是上皮細胞的標(biāo)記基因 （Orkin and Zon，2008），而C12中的高表達基因都是表征成纖維細胞的潛在標(biāo)記基因。C14也是如此， 其高表達基因中既有表皮細胞的標(biāo)記基因，又有表 征巨噬細胞的標(biāo)記基因。因此，綜合評估可將C7注釋為上皮細胞，C8注釋為成纖維上皮細胞，C9注釋為類上皮細胞，C12注釋為成纖維化細胞，C14注釋 為表皮類巨噬細胞。

本研究構(gòu)建的盤麗魚皮膚組織單細胞轉(zhuǎn)錄組圖 譜基本涵蓋了魚類皮膚組織中的大部分細胞類型， 為了提高細胞類型注釋的準(zhǔn)確性，針對每個細胞簇 的識別與鑒定盡量不局限于個別的標(biāo)記基因。與此 同時，發(fā)現(xiàn)在已確定細胞類型的細胞中還存在很多 特異性高表達的基因，可能是這類型細胞的潛在標(biāo) 記基因。表1展示了本研究用于鑒定細胞類型的標(biāo) 記基因及挖掘出的潛在標(biāo)記基因。

3.2天子藍盤麗魚皮膚組織DEGs鑒定

天子藍盤麗魚品系因其色澤及純藍程度而取名 天子藍。經(jīng)過多代近親交配與繁殖，選育出的天子藍品系基因穩(wěn)定且能遺傳。這種基因突變可能發(fā)生 在與色素合成相關(guān)的基因上，使得魚體表面鱗片和 表皮層的虹彩細胞及相關(guān)色素共同作用，而促使魚體呈現(xiàn)出嬌艷的藍彩。本研究選用的對照為阿蓮卡 盤麗魚，是一種未經(jīng)改良的野生型古老品系，其體色 主要呈紅棕色，條紋少，主要散布在頭頸部及魚鰭上（Farias et al.，2003）。通過對2個樣本的Pseudo-bulk處理，在上調(diào)的DEGs中發(fā)現(xiàn)TSPAN3A基因，其編碼1個四跨膜蛋白，參與離子交換、色團相互作用和色素模式，具有細胞結(jié)合分子的功能（Djurdjevic et al.，2019）。已有研究表明，同家族的TSPAN3C基因在黑色素細胞和黃色素細胞中均高表達，但TSPAN3A基因只呈弱表達（Inoue et al.，2014）。另一上調(diào)基因PTGES被發(fā)現(xiàn)在黑色素細胞中呈低水平表達（Inoueet al.，2014），下調(diào)基因中JUNBB、FOSAB、ATF3同為AP-1家族成員，與黑色素的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)運密切相關(guān)（Sitaram et al.，2012;Campagne et al.，2018）。TSPAN3A基因在天子藍盤麗魚品系中高表達，表明其體內(nèi)的黑色素細胞、黃色素細胞較少。此外，黑色素細胞及黑色素合成和轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因也呈下調(diào)表達趨勢，皮膚組織中黃色素細胞或胞內(nèi)色素團的缺乏、黑色素細胞和黑色素含量較少，是藍色體色形成的重要原因之一（Bagnara et al.，2007）。在阿蓮卡盤麗魚品系中，AP-1家族基因表達水平較高，協(xié)助黑色素合成和轉(zhuǎn)運的相關(guān)基因也呈上調(diào)變動趨勢，導(dǎo)致黑色素含量更高，皮膚色素沉著更多。

GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，在2個樣本間篩選獲得的DEGs主要注釋到與氣體傳遞、氧化代謝相關(guān)的GO功能條目上，下調(diào)的DEGs中也包含有血紅蛋白 基因，說明人工選育的天子藍盤麗魚品系和野生型 阿蓮卡盤麗魚品系在色素合成、氧氣結(jié)合及氧化應(yīng) 激方面存在明顯差異，相關(guān)研究也表明慈鯛魚類皮 膚色素沉積受氧化應(yīng)激的影響（Cahn et al.，2015）。 聚焦于同種細胞不同樣本間的差異分析，能揭示細 胞間的異質(zhì)性。黑色素細胞的DEGs主要富集于熱 應(yīng)答、細胞質(zhì)、未折疊蛋白結(jié)合、生長因子活性、金屬 離子結(jié)合反應(yīng)等信號通路，其中熱應(yīng)答過程可能會 影響皮膚體色（Costin and Hearing，2007）。下調(diào)的DEGs中的PTN基因會抑制酪氨酸酶和MITF蛋 白表達，減少黑色素細胞中黑色素的生成（Choi et al.，2015）。富集在金屬離子結(jié)合反應(yīng)通路上的DEGs有DNAJA、CRIP1及MB等基因，金屬離子可 能通過調(diào)節(jié)黑色素細胞內(nèi)的相關(guān)酶活性，而影響黑 色素的合成與沉積（Borovansky，1994）。

在虹彩細胞中存在25個DEGs，其中19個DEGs呈上調(diào)表達、6個DEGs呈下調(diào)表達。KEGG信號通 路富集分析發(fā)現(xiàn)主要富集于細胞凋亡、沙門氏菌感 染和MAPK信號通路等，涉及細胞生存、應(yīng)激響應(yīng)及信號傳導(dǎo)等功能。其中，MAPK信號通路是在 動物體色形成過程中起重要作用的通路。有研究表明，MAPK信號通路可調(diào)控酪氨酸酶活性，是參與黑色素形成和沉著的主要途徑之一（Well- brock and Arozarena，2015;許藝蘭等，2023）。富集于 MAPK信號通路的DEGs分別是JUNK、GADD45GA、HSP70L和FOSAB基因，其中，GADD45GA和 FOSAB基因在其他有關(guān)黑色素的研究中也被差異 富集（Lumaquin-Yin et al.，2023），JUN和FOSAB基 因也是AP-1家族基因成員，參與黑色素細胞轉(zhuǎn)化和致癌的相關(guān)過程，還能間接下調(diào)MITF基因表達，是調(diào)控黑色素合成的關(guān)鍵基因之一（Maurus et al.，2017）。HSP7OL基因已被證明能抑制MITF基因表達，最終降低酪氨酸酶活性及抑制黑色素生成（Kim et al.，2021）?？梢姡谏睾铣刹换钴S可能會導(dǎo)致 天子藍盤麗魚的體色較阿蓮卡盤麗魚更加鮮艷和絢 麗。該結(jié)論為后續(xù)研究盤麗魚色素細胞發(fā)育及體色 形成機制奠定了基礎(chǔ)，也為非模式水產(chǎn)魚類的單細 胞轉(zhuǎn)錄組測序提供了參考借鑒。

4結(jié)論

TSPAN3A、 PTGES、 ATF3、JUNK、 GADD45GA、 HSP7OL、FOSAB等基因在調(diào)節(jié)天子藍盤麗魚皮膚體 色、色素合成與沉著等方面發(fā)揮重要作用，而黑色素 合成不活躍可能是導(dǎo)致天子藍盤麗魚體色較阿蓮卡 盤麗魚更加鮮艷和絢麗的主要原因之一。

參考文獻（References）：

陳信忠，袁芳，許奕宸，郭書林，龔艷清，楊俊萍.2016.七彩神仙魚和神仙魚的DNA條形碼研究[J].檢驗檢疫學(xué)刊，26（6）：1-6. [Chen X Z，Yuan F，Xu Y C，Guo S L， Gong Y Q， Yang J P. 2016. Study on the DNA barcode of the discuses and angelfish[J]. Journal of Inspection and Quarantine，26（6）：1-6.]

程云生，侯冠軍，楊坤，陳靜，高雷，何吉祥.2015.人工雌核發(fā) 育紅草金魚體色的定向發(fā)育研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，46（3）：518-522. [Cheng Y S，Hou G J，Yang K，Chen J，Gao L， He J X. 2015. Directional development of artificial gynogenetic red goldfish body color[J]. Journal of Southern Agriculture， 46 （3） ： 518-522.] doi： 10.3969/j： issn.2095-1191.2015.3.518.

馮彩，胡菊，李俊茹，劉廣勤，關(guān)銘軒，何一晴，王良炎.2020.

不同體色草金魚（Carassius auratus）鱗片色素細胞的觀 察[J].河南水產(chǎn)，（2）：19-21.[Feng C，Hu J，LiJR，Liu G Q，Guan M X， He Y Q， Wang L Y. 2020. Observation on scale chromatophore of Carassius auratus [J]. Henan Fi- sheries，（2）：19-21.]

黃璞，賈銘宇，劉濤，于洪賢.2011.蝦青素對七彩神仙魚生長 和形體的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)，（3）：93-94.[Huang P，Jia M Y， Liu T， Yu H X. 2011. Effects of astaxanthin on

growth and morphology of Symphysodon haraldi [J]. Jilin Agriculture， （3）：93-94.]

吉鈺，陳再忠，溫彬，高建忠.2023.野生型和人工選育全藍型 七彩神仙魚群體的遺傳多樣性分析[J/OL].廣東農(nóng)業(yè)

科學(xué).https：//link.cnki.net/urlid/44.1267.S.20231027.0953.

004. [Ji Y， Chen Z Z， Wen B， Gao J Z. 2023. Genetic diversity analysis of wild and artificially bred blue populations in discus fish [J/OL]. Guangdong Agricultural Sciences.

https：//link.cnki.net/urlid/44.1267.S.20231027.0953.004.]

李中軍，溫彬，馬騰飛，劉鑫，高建忠，陳再忠.2022.藍色七彩 神仙魚虹彩細胞呈色相關(guān)基因的發(fā)掘[J/OL].水產(chǎn)學(xué)報.https：//kns.cnki.net/kcms/detail//31.1283.S.20221214.

0951.001.html. [Li Z J， Wen B， Ma T F， Liu X， Gao J Z， Chen Z Z. 2022. Exploration of candidate genes related to iridophore presenting blue skin in discus fish （Symphysodon haraldi） [J/OL]. Journal of Fisheries of China. https：//kns.

cnki.net/kcms/detail//31.1283.S.20221214.0951.001.html.]doi： 10.11964/jfc.20220113265.

劉曉東，陳再忠.2008.七彩神仙魚皮膚色素細胞觀察及類胡 蘿卜素組分分析[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，17（3）：339-343.

[Liu X D， Chen Z Z. 2008. Study on the chromatophores and the carotenoid components in the skin of discus fish （Symphysodon spp.） [J]. Journal of Shanghai Ocean University，17（3）：339-343.]

劉怡南，溫彬，陳再忠.2020.七彩神仙魚腦組織轉(zhuǎn)錄組 mRNAs差異表達分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，51（11）：2827-

2835. [Liu Y N， Wen B， Chen Z Z. 2020. Differential expression analysis of mRNAs based on brain transcriptome in the discus fish （Symphysodon haraldi） [J]. Journal of Southern Agriculture，51（11）：2827-2835.] doi： 10.3969/

j.issn.2095-1191.2020.11.027.

田浚杉，唐雨馨，王晨旭，王德壽.2024.硬骨魚類虹彩細胞的 研究進展[J].水產(chǎn)學(xué)報，48（1）：1-16.[TianJS，Tang Y X， Wang C X， Wang D S. 2024. Research advances of iri- dophores in Teleosts [J]. Journal of Fisheries of China， 48

（1）：1-16.] doi：10.11964/jfc.20230213903.

王磊，陳再忠，冷向軍，高建忠，劉穎，劉漢鵬，宋雪露.2016.

飼料中添加雨生紅球藻對七彩神仙魚生長、體色及抗氧 化力的影響[J].淡水漁業(yè)，46（6）：92-97.[WangL，Chen Z Z， Leng X J， Gao J Z， Liu Y， Liu H P， Song X L. 2016. Effect of Haematococcus pluvialis on growth， body color and antioxidation capacity of discus fish Symphysodon haraldi[J]. Freshwater Fisheries， 46 （6） ： 92-97.] doi： 10.3969/j.issn.1000-6907.2016.06.016.

韋玲靜，呂業(yè)堅，鄒輝，文衍紅，甘寶江，張桂姣，張盛，嚴雪 瑜，葉香塵.2020.金邊鯉皮膚黑色素合成及轉(zhuǎn)運相關(guān)基 因表達分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，51（2）：453-460.[WeiL J，Lü Y J，Zou H，Wen Y H，Gan B J，Zhang G J，Zhang S， Yan X Y， Ye X C. 2020. Skin melanin synthesis of Jinbian carp and expression analysis of transport related genes[J].

Journal of Southern Agriculture， 51 （2） ： 453-460.] doi： 10.3969/j.issn.2095-1191.2020.02.027.

許藝蘭，文露婷，黃姻，陳忠，覃俊奇，潘賢輝，周康奇，林勇，鄧潛，武霞，杜雪松.2023.全州禾花鯉皮膚轉(zhuǎn)錄組特征 分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，52（6）：150-159.[Xu Y L，Wen L T，Huang Y，Chen Z， Qin J Q，Pan X H，Zhou K Q， Lin Y， Deng Q， Wu X， Du X S. 2023. Transcriptome characte- ristics analysis of skin of Cyprinus carpio var. Quanzhou- nensis[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences， 52（6）：

150-159.] doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2023.06.016.

周康奇，潘賢輝，牟春艷，鄭曙明.2020.血鸚鵡魚鱗片及色素 細胞的顯微和超微結(jié)構(gòu)研究[J].淡水漁業(yè)，50（5）：47-54. [Zhou K Q， Pan X H， Mou C Y， Zheng S M. 2020. Study on the microstructure and ultrastructure of Cichlasoma synspilum？×C. citrinellum? scales and pigment cells [J]. Freshwater Fisheries， 50 （5） ： 47-54.] doi： 10.3969/j.issn.1000-6907.2020.05.007.

Bagnara J T， Fernandez P J， Fujii R. 2007. On the blue coloration of vertebrates[J]. Pigment Cell Research，20（1）：14-26. doi： 10.1111/j.1600-0749.2006.00360.x.

Borovansky J. 1994. Zinc in pigmented cells and structures， interactions and possible roles [J]. Sbornik Lekarsky， 95（4）：309-320.

Cahn M D， Brown A C， Clotfelter E D. 2015. Guanine-based structural coloration as an indicator of oxidative stress in a cichlid fish [J]. Journal of Experimental Zoology. Part A： Ecological Genetics and Physiology， 323 （6） ： 359-367.doi： 10.1002/jez.1926.

Campagne C， Ripoll L， Gilles-Marsens F， Raposo G， Delevoye

C. 2018. AP-1/KIF13A blocking peptides impair melanosome maturation and melanin synthesis [J]. International Journal of Molecular Sciences， 19 （2） ： 568. doi： 10.3390/ijms19020568.

Chaffin M， Papangeli I， Simonson B， Akkad A D， Hill M C， Arduini A， Fleming S J， Melanson M， Hayat S， KostAlimova M， Atwa O， Ye J C， Bedi Jr K C， Nahrendorf M， Kaushik V K，Stegmann C M，Margulies K B，Tucker N R， Ellinor P T. 2022. Single-nucleus profiling of human dilated and hypertrophic cardiomyopathy [J] Nature， 608

（7921）：174-180. doi：10.1038/s41586-022-04817-8.

Choi W J， Kim M，Park J Y，Park T J，Kang H Y. 2015. Pleiotrophin inhibits melanogenesis via Erk1/2-MITF signaling in normal human melanocytes[J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，28（1）：51-60. doi： 10.1111/pcmr.12309.

Costin G E， Hearing V J. 2007. Human skin pigmentation： Melanocytes modulate skin color in response to stress[J].

The FASEB Journal， 21 （4） ： 976-994. doi ： 10.1096/fj.066649rev.

Djurdjevic I， Furmanek T， Miyazawa S，Bajec S S. 2019. Comparative transcriptome analysis of trout skin pigment cells [J]. BMC Genomics， 20： 359. doi： 10.1186/s12864-019-5714-1.

Dobin A， Davis C A， Schlesinger F， Drenkow J， Zaleski C， Jha S， Batut P， Chaisson M， Gingeras T R. 2013. STAR： Ultrafast universal RNA-Seq aligner[J]. Bioinformatics， 29（1）： 15-21. doi：10.1093/bioinformatics/bts635.

Fadeev A， Krauss J， Singh A P， Nusslein-Volhard C. 2016. Zebrafish leucocyte tyrosine kinase controls iridophore establishment， proliferation and survival [J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，29（3）：284-296. doi： 10.1111/pcmr.

12454. Farias I P， Hrbek T， Brinkmann H， Sampaio I， Meyer A. 2003. Characterization and isolation of DNA microsatellite primers for Arapaima gigas， an economically important but severely over-exploited fish species of the Amazon basin [J]. Molecular Ecology Notes，3（1）：128-130. doi：10.1046/j.1471-8286.2003.00375.x.

Guo C，Duan Y，Ye W D，Zhang W T，Cheng Y Y，Shi M J，Xia

X Q. 2023. FishGET： A fish gene expression and transcriptome database with improved accuracy and visualization [J]. iScience， 26（4）： 106539. doi： 10.1016/j.isci.2023.106

539. Inoue S， Kondo S， Parichy D M， Watanabe M. 2014. Tetraspanin 3c requirement for pigment cell interactions and boundary formation in zebrafish adult pigment stripes[J].

Pigment Cell amp; Melanoma Research，27（2） ：190-200. doi： 10.1111/pcmr.12192.

Kim H M，Oh S，Choi C H，Yang J Y，Kim S，Kang D，Son K H， Byun K. 2021. Attenuation effect of radiofrequency irradiation on UV-B-induced skin pigmentation by decreasing melanin synthesis and through upregulation of heat shock protein 70[J]. Molecules， 26（24） ： 7648. doi： 10.3390/molecules26247648.

Lukowicz-Bedford R M， Farnsworth D R， Miller A C. 2022. Connexinplexity： The spatial and temporal expression of connexin genes during vertebrate organogenesis [J]. Genes | Genomes| Genetics， 12（5）：jkac062. doi： 10.1093/g3jour-

nal/jkac062.

Lumaquin-Yin D， Montal E， Johns E， Baggiolini A， Huang T H， Ma Y， LaPlante C， Suresh S， Studer L， White R M. 2023. Lipid droplets are a metabolic vulnerability in melanoma [J]. Nature Communications， 14 （1） ： 3192. doi： 10.

1038/s41467-023-38831-9.

Maurus K， Hufnagel A， Geiger F， Graf S， Berking C， Heinemann A， Paschen A， Kneitz S， Stigloher C， Geissinger E， Otto C， Bosserhoff A， Schartl M， Meierjohann S. 2017. The AP-1 transcription factor FOSL1 causes melanocyte reprogramming and transformation[J]. Oncogene，36：5110-5121. doi：10.1038/onc.2017.135.

Metikala S， Chetty S C，Sumanas S. 2021. Single-cell transcriptome analysis of the zebrafish embryonic trunk[J]. PLoS One， 16（7）：e0254024. doi： 10.1371/journal.pone.0254024.

Ng T T， Lau C C， Tan M P， Wong L L，Sung Y Y， Muhammad T S T， de Peer Y V， Sui L Y，Danish-Daniel M. 2023. Cutaneous transcriptomic profiling and candidate pigment genes in the wild discus （Symphysodon spp.） [J]. New Zealand Journal of Zoology，50（4） ：478-496. doi： 10.1080/03

014223.2023.2180763.

Orkin S H， Zon L I. 2008. Hematopoiesis： An evolving paradigm for stem cell biology[J]. Cell， 132（4）：631-644. doi： 10.1016/j.cell.2008.01.025.

Patterson L B， Parichy D M. 2019. Zebrafish pigment pattern

formation： Insights into the development and evolution of adult form[J]. Annual Review of Genetics， 53： 505-530.

doi： 10.1146/annurev-genet-112618-043741.

Sitaram A，Dennis M K， Chaudhuri R， de Jesus-Rojas W， Tenza D，Setty S R G，Wood C S，Sviderskaya E V，Bennett D C， Raposo G， Bonifacino J S， Marks M S. 2012. Differential recognition of a dileucine-based sorting signal by AP-1 and AP-3 reveals a requirement for both BLOC-1 and AP-3 in delivery of OCA2 to melanosomes[J]. Molecular Biology of the Cell， 23 （16）： 3178-3192. doi： 10.1091/mbc.E11-06-0509.

Song X L， Wang L， Li X Q， Chen Z Z， Liang G Y， Leng X J.

2017. Dietary astaxanthin improved the body pigmentation and antioxidant function， but not the growth of discus fish （Symphysodon spp.） [J]. Aquaculture Research， 48 （4） ：

1359-1367. doi： 10.1111/are.13200.

Wang L K，F(xiàn)eng Z X，Wang X，Wang X W，Zhang X G. 2010. DEGseq： An R package for identifying differentially expressed genes from RNA-Seq data [J]. Bioinformatics， 26（1）： 136-138. doi： 10.1093/bioinformatics/btp612.

Wellbrock C， Arozarena I. 2015. Microphthalmia-associated transcription factor in melanoma development and MAPkinase pathway targeted therapy[J]. Pigment Cell amp; Melanoma Research，28（4）：390-406. doi： 10.1111/pcmr.12370.

Yang B T，Wen B，Ji Y， Wang Q，Zhang H R，Zhang Y，Gao J Z， Chen Z Z. 2021. Comparative metabolomics analysis of pigmentary and structural coloration in discus fish （Symphysodon haraldi）[J]. Journal of Proteomics，233：104085.

doi：10.1016/j.jprot.2020.104085.

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