三種藥用水蛭的染色體制備及核型分析

摘" 要：為探究寬體金線蛭、天津醫(yī)蛭和菲牛蛭等3種藥用水蛭的染色體制備及核型分析方法，豐富對(duì)水蛭染色體數(shù)目及核型組成的認(rèn)知，以精巢細(xì)胞為材料，采用空氣干燥法制作前述3種水蛭的染色體玻片，并進(jìn)行鏡檢和核型分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，3種水蛭的染色體數(shù)目和核型公式分別為寬體金線蛭：2n=22=8m+4sm+4st+6t，天津醫(yī)蛭：2n=22=12m+4sm+2st+4t，菲牛蛭：2n=26=4m+4sm+6st+12t；核型不對(duì)稱系數(shù)分別為寬體金線蛭71.27%，天津醫(yī)蛭65.70%，菲牛蛭78.99%；核型分類標(biāo)準(zhǔn)分別為寬體金線蛭“3A”型，天津醫(yī)蛭“2A”型，菲牛蛭“3A”型。結(jié)果說明，核型分析結(jié)果與這3種水蛭所在的系統(tǒng)分類地位相符，3種水蛭的進(jìn)化程度有一定差別。

關(guān)鍵詞：寬體金線蛭；天津醫(yī)蛭；菲牛蛭；染色體；核型

doi：10.16446/j.fsti.20231000103

收稿日期：2023-10-03

作者簡(jiǎn)介：施鳳（2001—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱抿晤愘Y源開發(fā)與利用。E-mail：1607152305@qq.com

通信作者：劉子超（1997—），男，副教授，研究方向?yàn)樗幱抿晤愘Y源開發(fā)與利用。E-mail：abclzc@aliyun.com

項(xiàng)目資助：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32260132）；云南省萬人計(jì)劃青年拔尖人才專項(xiàng)（YNWR-QNBJ-2018-161）；云南省地方本科高校基" 礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)（202301BA070001-105，202101BA070001-164）；昆明學(xué)院2023年科研特色團(tuán)隊(duì)。

水蛭俗稱螞蝗，隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門（Annelida）、蛭綱（Hirudinea）［1］。全世界記述了4亞綱5目13科144屬約700種水蛭［2］，中國(guó)分布有2亞綱3目9科33屬111種［3］。水蛭在我國(guó)有悠久的臨床藥用歷史。漢代的《神農(nóng)本草經(jīng)》即記載了水蛭的藥效，“水蛭，味咸，平。主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕，積聚，無子，利水道”。《傷寒論》《本草綱目》等古代醫(yī)學(xué)名著也對(duì)水蛭的藥效有詳細(xì)記載。《中國(guó)藥典》2020年版將寬體金線蛭（Whitmania pigra）、日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponica）和尖細(xì)金線蛭（Whitmania acranulata）收載，用于治療血瘀經(jīng)閉、癓瘕痞塊、中風(fēng)偏癱、跌撲損傷等［4］。其中，寬體金線蛭和日本醫(yī)蛭的市場(chǎng)占有率較大，尖細(xì)金線蛭則極為少見。本文作者結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和分子分類學(xué)研究，證實(shí)目前中藥材市場(chǎng)上的日本醫(yī)蛭其實(shí)是以天津醫(yī)蛭（Hirudo tianjinensis）為主，真正的日本醫(yī)蛭十分少見［5］。此外，分布于我國(guó)廣東、廣西、海南等地的菲牛蛭（Poecilobdella manillensis）因具有個(gè)體大、抗凝血酶活性高、易于養(yǎng)殖等優(yōu)勢(shì)，近年來在中藥材市場(chǎng)上也逐漸占據(jù)了較大的比例［6］。因此，目前我國(guó)藥材市場(chǎng)上常見的水蛭主要為寬體金線蛭、天津醫(yī)蛭和菲牛蛭3種。

核型是染色體組在有絲分裂中期的表型，包括染色體數(shù)目、倍性、大小、形態(tài)特征等內(nèi)容。核型分析是分類學(xué)、群體遺傳學(xué)、物種進(jìn)化等研究的重要工具。目前，雖然對(duì)水蛭的核型研究既包括了淡水蛭類和海洋蛭類，也包括吸血蛭類和肉食性蛭類［7］，但是研究的種類很少，在已經(jīng)報(bào)道的600多種水蛭中，僅有約30種水蛭的染色體數(shù)目被報(bào)道，且尚未見對(duì)水蛭染色體形態(tài)的研究報(bào)道［8-10］。本試驗(yàn)以精巢細(xì)胞為材料，對(duì)寬體金線蛭、天津醫(yī)蛭和菲牛蛭等3種藥用水蛭的核型進(jìn)行分析，旨在豐富對(duì)水蛭染色體數(shù)目及核型組成的認(rèn)知，為我國(guó)藥用蛭類資源的開發(fā)利用提供資料。

1" 材料和方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用寬體金線蛭購(gòu)買自山東省濟(jì)寧市；天津醫(yī)蛭采集自云南省昆明市滇池流域；菲牛蛭購(gòu)買自廣東省中山市。3種水蛭均在昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院水蛭養(yǎng)殖室正常暫養(yǎng)10 d以上，以確保其處于正常的生理狀態(tài)（見圖1）。

1.2" 染色體制備

取健康水蛭于50 mL錐形離心管中，用15%乙醇麻醉后取出并置于蠟盤中，在體視顯微鏡下進(jìn)行解剖。用手術(shù)刀從后往前將水蛭背部的皮膚劃開，并用昆蟲針固定，用尖頭鑷子將精巢組織取出，立即放入1 mg/mL秋水仙素中處理18 h。取出并適當(dāng)研磨破碎精巢組織，然后在0.4% KCl低滲液中處理30 min，以1 000 r/min離心10 min。將沉淀物放入卡諾氏固定液中固定20 min。再次離心，將沉淀用少量卡諾氏固定液制成細(xì)胞懸液。采用空氣干燥法制作玻片，用10% Gimsa染液染色30 min，用蔡司熒光顯微鏡Axioplan 2（Zeiss company， USA）進(jìn)行染色體拍照，用圖像分析軟件CytoVision system（Applied Imaging Corp， UK）進(jìn)行染色體分析。

1.3" 染色體計(jì)數(shù)與核型分析

挑選染色體分散均勻、形態(tài)完整的二倍體分裂相細(xì)胞，選擇形態(tài)大小接近的染色體進(jìn)行配對(duì)、編號(hào)、計(jì)數(shù)，并用Photoshop軟件制作核型圖。每個(gè)物種選取30個(gè)以上細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中85%以上細(xì)胞具有的染色體數(shù)確定為該物種的染色體數(shù)［11］。根據(jù)CytoVision system測(cè)量的數(shù)據(jù)計(jì)算染色體的相對(duì)長(zhǎng)度和臂比，公式為：相對(duì)長(zhǎng)度＝（每條染色體長(zhǎng)度/染色體組總長(zhǎng)度）×100%，臂比＝長(zhǎng)臂長(zhǎng)度/短臂長(zhǎng)度；根據(jù)Levan等的方法對(duì)染色體進(jìn)行分類和核型公式計(jì)算，并用EXCEL軟件制作核型模式圖［12］。以Stebbins［13］提出的最長(zhǎng)染色體與最短染色體之比和臂比值＞2的染色體所占比例為核型分類原則；以Arano［14］提出的核型不對(duì)稱系數(shù)，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行核型分析，公式為：核型不對(duì)稱系數(shù)＝（長(zhǎng)臂總長(zhǎng)/全組染色體總長(zhǎng)）×100%。用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2" 結(jié)果和分析

2.1" 水蛭染色體數(shù)

3種水蛭選取的二倍體分裂相細(xì)胞數(shù)分別為：寬體金線蛭65個(gè)，天津醫(yī)蛭49個(gè)，菲牛蛭43個(gè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：寬體金線蛭2n=22占比為93.85%；天津醫(yī)蛭2n=22占比為90.00%；菲牛蛭2n=26占比為93.02%。上述結(jié)果均大于85%，因此確定，3種藥用水蛭的染色體數(shù)目分別為：寬體金線蛭2n=22，天津醫(yī)蛭2n=22，菲牛蛭2n=26（見圖2）。

2.2" 寬體金線蛭核型分析

根據(jù)65個(gè)細(xì)胞的測(cè)量結(jié)果數(shù)據(jù)，寬體金線蛭的染色體數(shù)目為11對(duì)22條（見圖3），由第3、5、6、11對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體（m），第7、10對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體（sm），第1、2對(duì)近端部著絲點(diǎn)染色體（st），以及第4、8、9對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體（t）組成。染色體組的相對(duì)長(zhǎng)度在3.52%～5.67%，染色體臂比值在1.04～15.13，平均臂比值為4.76（見表1）。

2.3" 天津醫(yī)蛭核型分析

根據(jù)49個(gè)細(xì)胞的測(cè)量數(shù)據(jù)，天津醫(yī)蛭的染色體數(shù)目為11對(duì)22條（見圖4），由第3、4、6、79對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體（m），第10、11對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體（sm），第1對(duì)近端部著絲點(diǎn)染色體（st），以及第2、5對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體（t）組成。染色體組的相對(duì)長(zhǎng)度為3.66%～5.53%，染色體臂比值在1.03～12.4，平均臂比值為3.38（見表2）。

2.4" 菲牛蛭核型分析

根據(jù)43個(gè)細(xì)胞的測(cè)量數(shù)據(jù)，菲牛蛭的染色體數(shù)目為13對(duì)26條（見圖5），由第12、13對(duì)中部著絲點(diǎn)染色體（m），第7、9對(duì)近中部著絲點(diǎn)染色體（sm），第2、4、11對(duì)近端部著絲點(diǎn)染色體（st），以及第1、3、5、6、8、10對(duì)端部著絲點(diǎn)染色體（t）組成。染色體組的相對(duì)長(zhǎng)度為3.19%～4.55%，染色體臂比值在1.05～12.82，平均臂比值為6.43（見表3）。

2.5" 三種水蛭的染色體核型特征分析

通過對(duì)精巢染色體玻片進(jìn)行鏡檢，結(jié)果表明，以上述方法制備的水蛭染色體分散效果良好，并且3種水蛭的染色體均為二倍體，未發(fā)現(xiàn)多倍體染色體、性染色體和隨體（見圖3～圖5）。供試的3種水蛭中，寬體金線蛭和天津醫(yī)蛭均以m染色體為主，菲牛蛭則是以t染色體為主。寬體金線蛭中m染色體的占比為36.4%，sm染色體的占比為18.2%，st染色體的占比為18.2%，t染色體的占比為27.3%；天津醫(yī)蛭中m染色體的占比為

54.5%，sm染色體的占比為18.2%，st染色體的占比為9.1%，t染色體的占比為18.2%；菲牛蛭中m染色體的占比為15.4%，sm染色體的占比為15.4%，st染色體的占比為23.1%，t染色體的占比為46.2%（見表1～表3）。

在一定的分類階元中，物種的進(jìn)化程度與其t型、m型和sm型染色體的數(shù)量密切相關(guān)。通常認(rèn)為，t型染色體數(shù)量較多的物種，其進(jìn)化程度較低，而m型和sm型染色體數(shù)量較多則表明了物種較高的進(jìn)化程度，這一結(jié)論已經(jīng)在魚類研究中被證實(shí)［15］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，天津醫(yī)蛭的m型和sm型染色體數(shù)量較多，其次是寬體金線蛭，而菲牛蛭則相對(duì)較少。這一趨勢(shì)與《中國(guó)動(dòng)物志（蛭綱）》中“醫(yī)蛭科較進(jìn)化，黃蛭科較原始”的觀點(diǎn)相符合。

2.6" 三種水蛭的核型進(jìn)化趨勢(shì)分析

由表4可知，寬體金線蛭臂比大于2的染色體比例為54.55%，染色體核型公式為2n=22=8m+4sm+4st+6t，屬于3A核型。天津醫(yī)蛭臂比大于2的染色體比例為36.36%，染色體核型公式為2n=22=12m+4sm+2st+4t，屬于2A核型。菲牛蛭臂比大于2的染色體比例為76.92%，染色體核型公式為2n=26=4m+4sm+6st+12t，屬于3A核型。

Stebbins［13］曾指出，物種的進(jìn)化是從對(duì)稱向不對(duì)稱進(jìn)化的，即1個(gè)物種染色體越對(duì)稱，則其進(jìn)化程度越原始；反之，染色體對(duì)稱性越低則其進(jìn)化程度越高。本試驗(yàn)中3種水蛭的核型不對(duì)稱系數(shù)為65.70%～78.99%（見表4），排列順序?yàn)椋悍婆ｒ蝕t;寬體金線蛭gt;天津醫(yī)蛭。根據(jù)核型不對(duì)稱系數(shù)來看3種水蛭的進(jìn)化程度：菲牛蛭進(jìn)化程度較高，寬體金線蛭次之，天津醫(yī)蛭最低。這一結(jié)果也與醫(yī)蛭科和黃蛭科的進(jìn)化方向相符。

3" 討論

水蛭是我國(guó)重要的動(dòng)物類中藥材。水蛭中藥飲片和以水蛭為主要原材料的復(fù)方藥被應(yīng)用于臨床，治療腦梗、心梗、靜脈血栓、高血壓等多種凝血相關(guān)疾病。隨著我國(guó)人口老齡化和人均壽命的延長(zhǎng)，水蛭的市場(chǎng)份額呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。然而，水蛭遺傳學(xué)信息的缺乏成為創(chuàng)新藥物研發(fā)的瓶頸，在很大程度上限制了其市場(chǎng)推廣應(yīng)用。核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的重要方法，染色體數(shù)目、形態(tài)及分類是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的核心內(nèi)容，而核型分析和帶型研究是最為重要的切入點(diǎn)［16］。

水蛭的體型會(huì)隨著環(huán)境和饑餓程度的變化而發(fā)生較大改變，其受到刺激時(shí)也會(huì)分泌出大量黏液，使體表呈現(xiàn)出極其黏滑的狀態(tài)。由于這些特征的存在，對(duì)水蛭特定組織進(jìn)行取樣變得異常困難，同時(shí)在制作玻片時(shí)也難以形成均勻的單層細(xì)胞，因此，對(duì)水蛭染色體進(jìn)行深入研究的相關(guān)報(bào)道十分少見。目前全世界已知水蛭約700種，僅有10多種被報(bào)道了染色體數(shù)目，對(duì)染色體進(jìn)行配對(duì)和分型研究的報(bào)道則更少，國(guó)內(nèi)僅見楊潼等［17］對(duì)日本醫(yī)蛭的染色體進(jìn)行過研究，其研究結(jié)果表明，日本醫(yī)蛭的染色體2n=16，并且還記錄到日本醫(yī)蛭的桿狀、點(diǎn)狀、環(huán)狀染色體，但是部分染色體的形態(tài)與其他常見物種染色體的形態(tài)差異較大，其原因尚不清楚。從已知結(jié)果看，不同物種水蛭的染色體數(shù)目變化較大，分類地位較近的物種，其染色體數(shù)目也存在較大差異，如澤蛭的染色體數(shù)目最少為2n=12，最多為2n=32。這在一定程度上與當(dāng)前水蛭分類學(xué)的發(fā)展水平有關(guān)，同時(shí)也反映出該領(lǐng)域在我國(guó)還有待進(jìn)一步深入研究。由于水蛭分布范圍較廣、數(shù)量眾多且種類繁多，而在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中，核型分析是一項(xiàng)至關(guān)重要的方法，因此，對(duì)水蛭進(jìn)行核型分析十分有必要。

盡管中國(guó)水蛭已有悠久的臨床藥用歷史，但分類學(xué)研究起步較晚，相關(guān)資料稀缺，對(duì)于藥用水蛭的物種鑒定也缺乏明確的認(rèn)識(shí)。蛭類經(jīng)典分類學(xué)專著《螞蟥》［18］和《中國(guó)動(dòng)物志（蛭綱）》［1］對(duì)于日本醫(yī)蛭的描繪和插圖有明顯的差異。近年來，隨著生物技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開始關(guān)注水蛭的核型問題并開展深入研究。Wang等［5］結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和分子分類學(xué)方法得出結(jié)論，大多數(shù)中藥材市場(chǎng)上的“日本醫(yī)蛭”實(shí)際上是天津醫(yī)蛭。從染色體核型的角度來看，本研究進(jìn)一步證實(shí)了天津醫(yī)蛭與日本醫(yī)蛭在物種鑒定方面存在顯著差異，這為我國(guó)藥用水蛭的鑒定提供了重要的理論依據(jù)。Utevsky等［19］對(duì)3種醫(yī)蛭屬染色體的研究結(jié)果為：H. medicinalis n=14，H. verbena n=13，H. orientalis n=12。天津醫(yī)蛭的單倍體染色體數(shù)n=11，與其較為接近，也說明其系統(tǒng)發(fā)育存在一定的同源性。

本研究以水蛭的精巢組織為材料，成功制備了藥用水蛭寬體金線蛭、天津醫(yī)蛭和菲牛蛭的二倍體染色體，這為水蛭的染色體和細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了新的思路。此外，本研究還對(duì)3種水蛭的二倍體染色體進(jìn)行了核型分析，進(jìn)一步豐富了目前對(duì)水蛭染色體數(shù)目及核型組成的認(rèn)知，有助于水蛭系統(tǒng)發(fā)育和遺傳學(xué)研究。本研究對(duì)于水蛭的物種鑒定、親緣關(guān)系、基因組學(xué)等相關(guān)研究具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價(jià)值。

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Chromosome preparation and karyotype analysis

of three medicinal leeches

SHI Feng1，2， SHEN Luyao1， LIU Zichao1， HU Qingmei1， TONG Xiangrong1， BI Xiaoxu1， LI Junyu3

（1. Engineering Research Center for Exploitation and Utilization of Leech Resources in

Universities of Yunnan Province，College of Agriculture and Life Sciences，

Kunming University，Kunming" 650214，China; 2. School of

Medicine， Kunming University，Kunming" 650214，China;

3. Department of Ultrasound，People’s Hospital of Fengdu

County，Chongqing City，F(xiàn)engdu" 408200，China）

Abstract： To investigate the methods of chromosome preparation and karyotype analysis of three medicinal leech species，Whitmania pigra，Hirudo tianjinensis，and Poecilobdella manillensis，and to further enrich the knowledge of the number of chromosomes and karyotype composition of leeches.The spermatocytes were used as material to make chromosome slides of the three leech species by air-drying method，and microscopic examination and karyotype analysis were carried out.The results showed that the chromosome number and karyotype formulas of the three leech species were as follows：W. pigra：2n=22=8m+4sm+4st+6t，H. tianjinensis：2n=22=12m+4sm+2st+4t，P. manillensis：2n=26=4m+4sm+6st+12t.Karyotype asymmetry coefficients were 71.27%，65.70% and 78.99%，respectively.The karyotype classification criteria were the “3A” type of W. pigra，“2A”type of H. tianjinensis and “3A” type of the P. manillensis.The results indicated that the karyotype analysis was consistent with the phylogenetic status of the three leech species，which was different in their degree of evolution to some extent.

Key words： Whitmania pigra; Hirudo tianjinensis; Poecilobdella manillensis; chromosome; karyotype