摘要:【目的】西番蓮是一種具有很高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熱帶和亞熱帶水果,但無性繁殖方式導(dǎo)致病毒病成為西番蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重威脅。為了更好地監(jiān)控田間西番蓮病毒病的發(fā)生,特開展本研究,以期建立針對西番蓮夜來香花葉病毒(telosma mosaic virus,TeMV)、東亞西番蓮病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)和黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)的多重RT-PCR檢測方法?!痉椒ā扛鶕?jù)已在GenBank上登記的3種病毒CP基因的保守序列,分別設(shè)計(jì)了針對TeMV、EAPV和CMV的3對特異性檢測引物,通過試驗(yàn)確定了引物濃度、循環(huán)數(shù)、退火溫度等條件,從而獲得優(yōu)化的多重RT-PCR反應(yīng)體系,并驗(yàn)證了多重RT-PCR的檢測靈敏度,然后應(yīng)用優(yōu)化體系對廣西田間采集的40個(gè)西番蓮葉片樣品進(jìn)行3種病毒的檢測?!窘Y(jié)果】通過優(yōu)化篩選,在20 μL的PCR反應(yīng)體系中實(shí)現(xiàn)了西番蓮TeMV、EAPV、CMV 3種病毒的多重檢測,最優(yōu)反應(yīng)條件是引物體積TeMV和EAPV各2 μL、CMV3 μL,循環(huán)數(shù)35次,退火溫度54.9 ℃;驗(yàn)證結(jié)果表明,檢測靈敏度最高可達(dá)104拷貝/μL。檢測結(jié)果表明,3對特異性檢測引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為496 bp、279 bp、157 bp。對西番蓮葉片樣品病毒進(jìn)行檢測的結(jié)果表明,TeMV、EAPV和CMV的檢測結(jié)果分別是97.5%(39/40),95%(38/40)和2.5%(1/40),而用單一RT-PCR的檢測結(jié)果分別是100%(40/40),95%(38/40)和2.5%(1/40),多重RT-PCR檢測結(jié)果和單一RT-PCR檢測結(jié)果的符合度為99.16%(119/120)。同時(shí),TeMV和EAPV傾向于復(fù)合侵染,其復(fù)合侵染率高達(dá)95%(38/40)?!窘Y(jié)論】本研究建立了西番蓮病毒多重RT-PCR檢測的優(yōu)化體系,能夠同時(shí)快速、靈敏和可靠地檢測TeMV、EAPV和CMV,為這3種西番蓮病毒田間控制、檢疫規(guī)劃和診斷提供了基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞:西番蓮;TeMV;EAPV;CMV;多重RT-PCR
中圖分類號:S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
Establishment and Application of a Multiplex RT-PCR Detection Method for Virus in Passion Fruit
ZHANG LiJuan1,2,3,4, WU Feng1,2,3,4*, HUANG ChanChan1,2,3,4, XIE Jin1,,2,3,4,
LI JinZhao1,2,3,4, SHAN Bin1,2,3,4, LU QinYu1,2,3,4
(1Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001, China; 2Agricultural Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning , Guangxi 530001, China; 3Subtropical Fruit and Vegetable Quality Supervision, Inspection and Testing Center of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning , Guangxi 530001, China; 4Key Laboratory of Quality and Safety Control for Subtropical Fruit and Vegetable, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanning , Guangxi 530001, China)
Abstract:【Objective】Passion fruit is a tropical and subtropical fruit with significant economic value. However, the viral diseases due to its asexual reproduction pose a serious threat to the development of passion fruit industry. This study aimed to enhance field monitoring of passion fruit virus disease by establishing a multiplex RT-PCR assay capable of detecting telosma mosaic virus (TeMV), East Asian passiflora virus (EAPV), and cucumber mosaic virus (CMV).【Methods】Three pairs of primers were designed based on conserved motifs within the CP gene sequences of TeMV, EAPV, and CMV available on GenBank. The primers concentration, number of cycles and annealing temperature in the multiplex RT-PCR reaction system were optimized. this study further verified the detection sensitivity of multiplex RT-PCR assay. This optimized RT-PCR system was applied to detect viruses in 40 passionfruit leaf samples collected from fields in Guangxi. 【Results】After optimization and screening experiments, a 20 μL PCR reaction system was established for successful detection of TeMV, EAPV, and CMV. The optimal reaction conditions included primer volumes of 2 μL TeMV, 2 μL EAPV and 3 μL CMV; 35 cycles with annealing temperature 54.9℃. Verification showed the detection sensitivity could be up to 104 copies/μL. The amplified product sizes were 496 bp, 279 bp, and 157 bp, respectively, for TeMV, EAPV, and CMV. The virus detection results for the field samples of passionfruit leaves showed that TeMV, EAPV and CMV were 97.5% (39/40), 95% (38/40) and 2.5% (1/40), respectively. The results detection with single RT-PCR were 100% (40/40), 95% (38/40) and 2.5% (1/40), respectively. The coincidence between the results of multiple RT-PCR and single RT-PCR was 99.16% (119/120). The detection results showed that TeMV and EAPV tended to be combined in infection, and the combined infection rate was as high as 95% (38/40). 【Conclusion】An optimized multiplex RT-PCR assay system was established in this study, and it can be used to detect TeMV, EAPV and CMV rapidly, sensitively and reliably at the same time, which provides the foundation for field control, quarantine planning and diagnosis of these three passion fruit viruses.
Keywords: Passion fruit; TeMV; EAPV; CMV; multiplex RT-PCR
0 引言
【研究意義】西番蓮(Passiflora edulis)屬于西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora),原產(chǎn)于南美洲,是一種多年生藤本植物,在熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培。由于氣候條件適宜,廣西成為主要的西番蓮產(chǎn)區(qū)之一(邢相楠等,2020)。在西番蓮的生產(chǎn)過程中,經(jīng)常發(fā)生各種病害問題,尤其是病毒感染對產(chǎn)量和品質(zhì)造成了顯著影響,這已經(jīng)成為制約該行業(yè)發(fā)展的重要因素(黃愛軍等,2019)。【前人研究進(jìn)展】已報(bào)道的廣西西番蓮病毒種類有夜來香花葉病毒(telosma mosaic virus,TeMV)、東亞西番蓮病毒(East Asian passiflora virus,EAPV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)(謝慧婷等,2020)、西番蓮重型斑駁病毒(passion fruit severe mottle virus,PFSMoV)(莫翠萍等,2023)、廣東番木瓜曲葉病毒(papaya leaf curl Guangdong virus,PaLCuGdV)(李戰(zhàn)彪等,2022)、一品紅曲葉病毒(euphorbia leaf curl virus,EuLCV),其中只有TeMV、EAPV和CMV在田間流行(謝慧婷等,2020),PaLCuGdV、PFSMoV和EuLCV只在武鳴和賓陽西番蓮果園里的葉片和果實(shí)上檢出。本研究就廣西田間流行的3種病毒,建立多重RT-PCR檢測方法,為田間控制、檢疫規(guī)劃和診斷提供依據(jù)。目前世界上報(bào)道感染西番蓮的病毒至少有44種(陳禮浪等,2022),在中國報(bào)道的至少12種(YANG et al.,2018;謝麗雪等,2019;張紹康等,2019;XIE et al.,2019;謝慧婷等,2020;CHEN et al.,2021;李戰(zhàn)彪等,2022;陳禮浪等,2022;莫翠萍等,2023;BAO et al.,2023;GOU et al.,2023;閆藝心等,2024)。病毒檢測方法是研究病毒的關(guān)鍵技術(shù)手段,也是病毒病害控制的一種有力措施,特別是對于如西番蓮這類無性繁殖的植物。多重RT-PCR檢測方法,與單一RT-PCR檢測方法相比,除了具有相同的靈敏度外,還能在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)高效地檢測多種病毒病,檢測效率大大提高,是一種快速、靈敏、可靠的檢測方法,其在大多數(shù)植物病毒病檢測上均有應(yīng)用。吐遜艾力·艾孜提力等(2021)建立了無花果斑點(diǎn)相關(guān)病毒(fig fleck-associated virus, FFkaV)、無花果葉斑相關(guān)病毒(fig leaf mottle associated virus,F(xiàn)LMaV)和無花果花葉病毒(fig mosaic virus,F(xiàn)MV)3種病毒的多重RT-PCR檢測方法;XU和MING(2022)開發(fā)了同時(shí)檢測百合中百合潛隱病毒(lily symptomless virus,LSV)、百合斑駁病毒(lily mottle virus,LMoV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、車前草亞洲花葉病毒(plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)4種病毒的多重RT - PCR檢測方法;CHEN等(2022)開發(fā)了金桂中浙貝母病毒Y(fritillary virus Y,F(xiàn)VY)、百合斑駁病毒(LMoV)、 浙貝母花葉病毒(thunberg fritillary mosaic virus,TFMV)、hop yellow virus (HYV)4種病毒的多重RT - PCR檢測方法。這些多重RT-PCR檢測方法促進(jìn)了相關(guān)病毒的檢出,對防控病毒流行起到積極作用。在西番蓮病毒上已建立了TeMV的qRT-PCR(謝慧婷等,2019)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法(FU et al.,2021)和抗體檢測技術(shù)(李雪,2022),開發(fā)有EAPV的TC-RT-PCR(謝麗雪等,2022)和抗體檢測方法。焦楠等(2019)建立了TeMV和CMV的雙重RT-PCR檢測方法?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于TeMV、EAPV和CMV的多重RT-PCR檢測方法鮮見有報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】針對廣西地區(qū)檢出較多的三種RNA病毒TeMV、EAPV和CMV,本研究通過用生物信息學(xué)軟件在CP序列保守區(qū)設(shè)計(jì)3對檢測引物。通過優(yōu)化引物濃度、循環(huán)數(shù)、退火溫度等參數(shù),建立了針對這3種病毒的多重RT-PCR檢測方法,為西番蓮田間病毒檢測提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 病葉采集
于2023年8月—2023年9月,在廣西柳州市、桂林市、賀州市和百色市共采集40個(gè)表現(xiàn)花葉或皺縮等癥狀的西番蓮幼嫩葉片,帶回農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,液氮速凍后-80 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
在勻漿管中加入1 mL的RNA提取液(Servicebio),置冰上預(yù)冷,取100 mg葉片樣品,加入到勻漿管中,冷凍研磨儀充分研磨至無可見組織塊,然后參照Servicebio? RNA 提取液說明書提取西番蓮葉片總RNA。提取到的RNA,用15 μL Nuclease-Free水溶解后,使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度。將濃度過高的RNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋,使其終濃度為200 ng/μL。最后參照說明書,使用SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。
1.3 引物設(shè)計(jì)
前期在廣西采集有癥狀的葉片樣品,測序分析病毒種類,獲得14條TeMV的CP蛋白核苷酸序列(GenBank登錄號:OR786355-OR786368),13條EAPV的部分CP蛋白核苷酸序列(GenBank登錄號:OR786342-OR786354),3條CMV的CP蛋白核苷酸序列(GenBank登錄號:OR786338-OR786340),將獲得的病毒序列和登錄在GenBank上的3種病毒的部分CP序列整理成3個(gè)數(shù)據(jù)集(TeMV-CP、EAPV-CP和CMV-CP),使用MEGA 6.0軟件中的序列比對分別對這3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行多重序列比對,鑒定出其中的保守區(qū)域(圖1)。利用Primer Premier 6.0軟件在保守區(qū)設(shè)計(jì)病毒檢測引物,從中選出3種擴(kuò)增產(chǎn)物有差異且易通過瓊脂糖凝膠電泳分離的檢測引物(表1)。
1.4 單一RT-PCR引物用量優(yōu)化
應(yīng)用單一RT-PCR檢測方法,對表1的病毒檢測引物使用量進(jìn)行優(yōu)化。20 μL擴(kuò)增體系中,上下游引物(10 μmol/L)同時(shí)設(shè)置8個(gè)濃度梯度:0.25 μL /0.25 μL、0.5 μL /0.5 μL、0.75 μL /0.75 μL、1.0 μL /1.0 μL、1.25 μL /1.25 μL、1.5 μL /1.5 μL、1.75 μL /1.75 μL、2.0 μL /2.0 μL,其他條件不變。
1.5 多重RT-PCR反應(yīng)條件優(yōu)化
應(yīng)用3種病毒(見表1)檢測引物建立多重RT-PCR檢測方法,20 μL反應(yīng)體系中,對退火溫度(49.0 ℃、50.8 ℃、52.4 ℃、53.8 ℃、54.9 ℃、56.2 ℃、58.0 ℃、60.0 ℃)、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(15×,20×,25×,30×,35×,40×)等因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。單一條件優(yōu)化時(shí),其他條件不變。
1.6 多重RT-PCR產(chǎn)物的克隆與序列測定
擴(kuò)增出的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收片段,連接到pCE3末端載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑選陽性克隆子,提取質(zhì)粒送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLASTN比對分析。
1.7 多重RT-PCR靈敏度檢測
用公式計(jì)算拷貝數(shù),拷貝數(shù) =(質(zhì)粒濃度ng/μL × 6.02 × 1023 copies/mol)/(重組質(zhì)粒堿基數(shù) × 660 g/mol × 109)(王坤等,2020),載體長度為插
入的片段長度分別為:TeMV(496 bp)、EAPV(279 bp)、CMV(157 bp)。根據(jù)公式將含3種質(zhì)粒混合液依次稀釋成1.0×1011、1.0×1010、1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101、1.0×100(拷貝/μL),以dd H2O為空白對照,檢測靈敏度。
1.8 多重RT-PCR與單一RT-PCR的比較及應(yīng)用分析
分別用多重RT-PCR方法與單一RT-PCR方法進(jìn)行檢測西番蓮葉片樣品,并對比這2種方法的檢出率。
2 結(jié)果與分析
2.1 單一RT-PCR檢測
以含3種病毒的cDNA為模板,分別用表1的3對引物進(jìn)行檢測,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后得到大小為496 bp、279 bp、157 bp的3條條帶(圖2),與預(yù)期大小相符合,條帶單一,無雜帶,產(chǎn)物大小易于區(qū)分,適用于后續(xù)多重RT-PCR方法的構(gòu)建。
2.2 雙重和多重RT-PCR
以含有2種或3種病毒的混合cDNA為模板,將3種病毒進(jìn)行兩兩組合和多重組合。結(jié)果證明任意2個(gè)引物對都能擴(kuò)增出大小相符的條帶,任意非配對引物未擴(kuò)增出雜帶,即不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增(圖2)。
2.3 多重RT-PCR產(chǎn)物的克隆及測序
分別對多重RT-PCR擴(kuò)增得到的3條特異性條帶進(jìn)行克隆及測序。結(jié)果表明,TeMV、EAPV、CMV片段大小分別是496 bp、279 bp、157 bp,符合預(yù)期。序列分別與GenBank中來自江西贛州西番蓮上的分離物TeMV YD(登錄號:ON932196)的核苷酸一致性達(dá)100%,與臺灣西番蓮上的分離物EAPV-IB-dpd(登錄號:KT724930)的核苷酸一致性達(dá)98.21%,與湖南辣椒上的分離物CMV-H1(登錄號:KP744988.1)的核苷酸一致性達(dá)100%,說明多重RT-PCR擴(kuò)增出的特異性片段確實(shí)來自于這3種病毒。
2.4 單一RT-PCR引物用量優(yōu)化
如圖3 所示,單一RT-PCR引物用量優(yōu)化結(jié)果表明,TeMV上下游引物用量(10 μmol/L) 各1 μL,EAPV上下游引物用量(10 μmol/L) 各1 μL,CMV上下游引物用量(10 μmol/L) 各1.5 μL,條帶亮度接近,擴(kuò)增效率較高,因此選擇引物最佳用量組合為:上下游引物分別為TeMV(10 μmol/L) 各1 μL,EAPV(10 μmol/L) 各1 μL,CMV(10 μmol/L) 各1.5 μL。
2.5 多重RT-PCR檢測方法條件優(yōu)化
如圖4 A所示,退火溫度為49.0 ℃、50.8 ℃、52.4 ℃、53.8 ℃、54.9 ℃、56.2 ℃、58.0 ℃、60.0 ℃,體系都能夠擴(kuò)增出目的條帶。綜合考慮,本研究選擇54.9℃為體系退火溫度。如圖4 B所示,體系循環(huán)次數(shù)為15、20、25、30、35時(shí),3種病毒的條帶亮度不斷增加,循環(huán)次數(shù)為35和40時(shí)條帶亮度相當(dāng),綜合考慮選擇最佳循環(huán)次數(shù)為35。
2.6 多重RT-PCR檢測的靈敏度
如圖5所示,將含3種病毒基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的模板,驗(yàn)證多重RT-PCR實(shí)驗(yàn)的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在多重RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,TeMV、EAPV、CMV的檢測靈敏度分別為103、103、104拷貝/μL,總體上,該方法可實(shí)現(xiàn)對3種病毒最低104 拷貝/μL水平的檢測。
2.7 多重RT-PCR與單一RT-PCR的比較及應(yīng)用分析
分別利用優(yōu)化好的多重RT-PCR方法(圖6 A)和單一RT-PCR方法(圖6 B,圖6 C,圖6 D)對采集自廣西的40個(gè)疑似病毒感染的西番蓮葉片樣品進(jìn)行單一RT-PCR檢測,發(fā)現(xiàn)TeMV、EAPV、CMV的檢出率分別為100%(40/40),95%(38/40)和2.5%(1/40)。除了TeMV有單一侵染之外(2/40),其余2個(gè)病毒都是復(fù)合侵染。其中,TeMV和EAPV的復(fù)合侵染率為95%(38/40),TeMV、EAPV、CMV的復(fù)合侵染率為2.5%(1/40)(圖6 E)。
多重RT-PCR的檢測結(jié)果與單一RT-PCR相比,準(zhǔn)確度高達(dá)99.16%(119/120),其對TeMV、EAPV、CMV的檢出率分別為97.5%(39/40),95.0%(38/40),2.5%(1/40)。
3 討論
多重RT-PCR方法的成功建立,引物的設(shè)計(jì)和篩選是關(guān)鍵。多重RT-PCR的引物設(shè)計(jì)既要滿足常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)的要求,又需滿足以下幾個(gè)條件:除了避免產(chǎn)生引物二聚體之外,還要避免多條引物間產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,保證檢測的準(zhǔn)確性;引物對退火溫度盡量接近,具有相似的擴(kuò)增效率;不同引物對擴(kuò)增的多個(gè)片段長度相差不宜過大,長度也不宜過長,但在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)又必須容易區(qū)分(SINT et al.,2012)。
筆者從廣西西番蓮樣品擴(kuò)增到TeMV、EAPV和CMV 的CP核酸序列(已提交至GenBank,未發(fā)表數(shù)據(jù)),加上從GenBank上下載的從其他地區(qū)樣品擴(kuò)增的CP序列,然后利用Primer Premier 6.0軟件在這些序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)這3種病毒的檢測引物,既保證了引物的特異性,又兼顧了引物的普適性。本研究設(shè)計(jì)的3對多重RT-PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為496 bp、279 bp、157 bp,易通過瓊脂糖凝膠電泳分離。3對引物的退火溫度和GC含量都相近,保證擴(kuò)增效率一致。后續(xù)可以根據(jù)生產(chǎn)需要在本研究基礎(chǔ)上將檢測的病毒種類增加至4種、5種甚至更多種。
多重RT-PCR的靈敏度和特異性也是評價(jià)多重RT-PCR方法的重要參數(shù),在本研究中,多重RT-PCR能檢測104拷貝/μL的病毒含量,與李文宗等(2022)建立的甘薯3種病毒SPLCV、SPFMV、SPCSV的靈敏度相當(dāng)。本研究比較了單一RT-PCR與多重RT-PCR對40個(gè)田間樣品的病毒檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)2種檢測方法的結(jié)果幾乎一致,符合度達(dá)99.16%(119/120)(圖5),說明這套多重RT-PCR檢測引物具有高靈敏度和準(zhǔn)確性。應(yīng)用該多重RT-PCR方法檢測田間樣品時(shí),能同時(shí)檢出3種、2種或1種病毒,說明該方法能適用于檢測田間西番蓮病毒病單一侵染或復(fù)合侵染的情況。綜上所述,本研究建立的TeMV、EAPV和CMV多重RT-PCR檢測方法的靈敏度、特異性和檢測效率都能適用于田間大規(guī)模檢測,可以為種苗檢測、田間苗木的病毒病害監(jiān)測提供幫助,特別是應(yīng)用于西番蓮病毒檢測,可為西番蓮產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)支持。
4 結(jié)論
本研究建立了一個(gè)簡單、靈敏、高效、可靠的TeMV、EAPV和CMV多重RT-PCR檢測系統(tǒng),在最優(yōu)化條件下能檢測到最低病毒含量為104拷貝/μL,與單一RT-PCR結(jié)果比較,準(zhǔn)確率達(dá)99%以上。
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(責(zé)任編輯 謝紅輝)
DOI:10.20191/j.cnki.2095-0764.2024030029
基金項(xiàng)目:廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(桂農(nóng)科2022YM14);科技先鋒隊(duì)‘強(qiáng)農(nóng)富民’‘六個(gè)一’專項(xiàng)行動(dòng)(桂農(nóng)科盟202316-1);廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目(桂農(nóng)科2022JM94)。
第一作者:張莉娟(1992—),女,碩士,助理研究員,主要從事植物病毒學(xué)致病機(jī)理和病害流行情況研究,E-mail:1591452317@qq.com。
*通信作者:吳鳳(1990—),女,碩士,工程師,主要從事植物病原微生物致病機(jī)理和防控研究,E-mail:895913834@qq.com。
收稿日期:2024-03-05