托高土病毒核蛋白的異源表達(dá)、 純化與結(jié)晶

文章編號(hào)：1671-3559（2024）06-0707-06DOI：10.13349/j.cnki.jdxbn.20240308.001

摘要： 為了獲得托高土病毒核蛋白氮端結(jié)構(gòu)域的蛋白（THOV-NPN）晶體， 進(jìn)一步探究其結(jié)構(gòu)和功能， 依次采用鎳親和層析、 肝素親和層析方法純化大腸桿菌異源表達(dá)獲得的THOV-NPN， 利用凝膠過濾層析及十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測THOV-NPN的均一性和純度， 分別用坐滴法和懸滴法篩選和優(yōu)化THOV-NPN結(jié)晶條件， 采用質(zhì)譜法驗(yàn)證所得的晶體。 結(jié)果表明： 所使用的提取方法可以獲得純度較高、 性質(zhì)均一的THOV-NPN， 在培養(yǎng)溫度16 ℃， THOV-NPN的質(zhì)量濃度為25.0 g/L， 池液中磷酸氫二銨、 檸檬酸鈉、 氯化鈉的濃度分別為0.8、 0.1、 0.2 mol/L及pH=5.0的條件下可以獲得粒徑為0.05 mm、 形狀近似正方體的THOV-NPN晶體。

關(guān)鍵詞： 托高土病毒； 核蛋白； 異源表達(dá)； 純化； 結(jié)晶

中圖分類號(hào)： Q71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Heterologous Expression， Purification and Crystallization of Thogoto Virus Nucleoprotein

MA Lin， JU Jinxin， LI Lin， QIN Xiaochun， DONG Shishang

（School of Biological Science and Technology， University of Jinan， Jinan 250022， Shandong， China）

Abstract： To obtain crystals of the N-terminal domain of the nucleoprotein of Thogoto virus （THOV-NPN） for further exploration of their structure and function， nickel affinity chromatography and heparin affinity chromatography methods were sequentially used to purify THOV-NPN expressed heterologously in Escherichia coli. Gel filtration chromatography and sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis were employed to assess the homogeneity and purity of THOV-NPN. Crystallization conditions for THOV-NPN were screened and optimized using both sitting-drop and hanging-drop methods， and the obtained crystals were validated usingmassspectrometry.Theresultsshowthatthemethodsemployed enabled the purification of high-purity and homogeneous THOV-NPN. Under the conditions of cultivation temperature of 16 ℃， mass concentration of 25.0 g/L of THOV-NPN， and concentration of 0.8， 0.1， and 0.2 mol/L for ammonium dihydrogen phosphate， sodium citrate， and sodium chloride in the pool liquid respectively， with pH of 5.0， THOV-NPN crystals with particle size of 0.05 mm and a shape approximating can be obtained.

Keywords： Thogoto virus; nucleoprotein; heterologous expression; purification; crystallization

托高土病毒（Thogoto virus， THOV）屬于正黏病毒科托高土病毒屬， 是一種以蜱蟲為媒介進(jìn)行傳播的人畜共患病毒， 感染后可導(dǎo)致發(fā)熱性疾病和偶爾的流產(chǎn)， 嚴(yán)重威脅人類的生命健康和經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展［1-5］。 THOV通過與宿主細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合而進(jìn)入宿主細(xì)胞， 隨后病毒基因組轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞核中啟動(dòng)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制， 新形成的病毒粒子從宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜上以出芽的方式釋放出來［6］。

THOV基因組是由6個(gè)單股負(fù)鏈核糖核酸（RNA）組成，其中5個(gè)較大的RNA片段分別編碼核蛋白（NP）、 糖蛋白（GP）以及聚合酶的3個(gè)亞基（PA、 PB1和PB2）， 第6個(gè)片段編碼2種基質(zhì)蛋白質(zhì)（M）。 所有6個(gè)基因組片段均與NP結(jié)合， 并與病毒的聚合酶共同形成病毒核糖核蛋白復(fù)合體（ribonucleoprotein， RNP）［7-8］。其中，病毒的NP在介導(dǎo)RNP復(fù)合體進(jìn)入宿主細(xì)胞核的過程中起著至關(guān)重要的作用。研究［9-10］表明，THOV-NP氮端存在具有核定位信號(hào)（NLSs）功能的氨基酸序列，負(fù)責(zé)引導(dǎo)病毒RNP進(jìn)入細(xì)胞核。此外，人體在對抗THOV增殖時(shí)，需要MxA蛋白的參與。MxA蛋白可以識(shí)別并結(jié)合感染細(xì)胞中進(jìn)入的NP組分，從而阻斷病毒RNP的核輸入［11-14］，但是，截至目前THOV-NP的三維空間結(jié)構(gòu)尚不明確。

本文中通過對THOV-NP氮端第1—150位氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域的蛋白（THOV-NPN）進(jìn)行原核表達(dá)與純化，獲得性質(zhì)均一、 純度較高的蛋白質(zhì)樣品； 采用蛋白質(zhì)晶體學(xué)方法篩選和優(yōu)化樣品的結(jié)晶條件，以期獲得THOV-NPN晶體，為進(jìn)一步解析其三維空間結(jié)構(gòu)奠定重要基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、 質(zhì)粒、 基因與引物

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α菌株和BL21（DE3）均購自于北京博邁德基因技術(shù)有限公司； pET28a質(zhì)粒購自于美國賽默飛世爾科技公司； THOV-NP全長基因由蘇州金唯智生物科技有限公司合成； 引物由青島擎科生物科技有限公司合成，其中上游引物： 5′-CGGGATCCATGGCCACAGATCAGATG-3′，下游引物： 5′-CCCTCGAGTTAGAT-TTCTAAGCTGTT-3′。

1.1.2主要試劑與材料

瓊脂糖凝膠脫氧核糖核酸（DNA）回收試劑盒與快速質(zhì)粒小提試劑盒， 購自天根生化科技（北京）有限公司； 高保真DNA聚合酶Prime STAR Max， 購自寶生物工程（大連）有限公司； T4 DNA連接酶、 BamH I以及Xho I， 購自美國賽默飛世爾科技公司； 蛋白標(biāo)示物，購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司； 鎳離子親和層析柱（Ni-NTA）、 SuperdexTM 200 Increase10/300 GL凝膠過濾層析柱，購自美國通用電氣公司； 超濾離心管，購自德國默克密理博公司； IndexTM、 Cystal ScreenTM、 Cystal ScreenTM 2、 PEG/Ion ScreenTM、 PEG/Ion 2 ScreenTM、 Salt RxTM 1和Salt RxTM 2結(jié)晶篩選試劑盒，購自美國Hampton Research公司；Wizard Classic-1、 Wizard Classic-2、 Wizard Classic-3、 Wizard Classic-4結(jié)晶篩選試劑盒，購自日本理學(xué)株式會(huì)社。

1.1.3主要儀器

GXZ型智能培養(yǎng)箱，上海知楚有限公司； 低溫恒溫培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司； Avanti J-26S XP型高速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司； Scientz-ⅡD型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技公司； JH-02 HC型高壓勻質(zhì)機(jī)，廣州聚能納米生物科技股份有限公司； KTA pure25 L1型蛋白純化系統(tǒng)，美國通用電氣公司； NanoDrop型微量紫外-可見分光光度計(jì)，美國賽默飛公司。

1.2方法

1.2.1THOV-NPN的原核表達(dá)載體構(gòu)建

以人工合成的THOV-NP全長基因?yàn)槟０?，參?Prime STAR Max標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃保持30 s—56 ℃保持15 s—72 ℃保持40 s（共33個(gè)循環(huán)）。 PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收后， 與pET28a空載體一起經(jīng)BamH I/Xhol I雙酶切， 并由T4 DNA連接酶將切后的兩者連接， 獲得pET28a-THOV-NPN重組表達(dá)載體。 隨后， 重組載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞， 并涂布于Luria-Bertani（LB， 卡納青霉素的質(zhì)量濃度為50 mg/L）平板， 篩選陽性克隆菌株。 挑取單個(gè)菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒后， 經(jīng)雙酶切鑒定無誤后， 將重組質(zhì)粒對應(yīng)的菌液送至青島擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2THOV-NPN的誘導(dǎo)表達(dá)

將測序正確的pET28a-THOV-NPN重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)型E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞， 并涂布于LB平板， 于37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。 挑取平板上的單克隆菌斑接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)溫度為37 ℃， 轉(zhuǎn)速為220 r/min培養(yǎng)5 h后轉(zhuǎn)接至800 mL液體LB培養(yǎng)基內(nèi)， 培養(yǎng)溫度為37 ℃， 轉(zhuǎn)速為220 r/min培養(yǎng)6 h后取200 μL菌液， 記為誘導(dǎo)前樣。 加入400 μL濃度為1.0 mol/L的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于培養(yǎng)溫度為16 ℃、 轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下培養(yǎng)16 h后取200 μL菌液，記為誘導(dǎo)后樣。分別將誘導(dǎo)前樣和誘導(dǎo)后樣離心分離，將沉淀于100 ℃煮沸10 min后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測。

1.2.3鎳離子親和層析

在溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為6 000 r/min條件下離心收集誘導(dǎo)后的菌體，棄上清，沉淀用收菌緩沖液［4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的濃度為20 mmol/L， pH=7.0， 氯化鈉的濃度為300 mmol/L， 甘油的體積分?jǐn)?shù)為5%］均勻懸起后， 經(jīng)低溫高壓勻質(zhì)機(jī)破碎， 并于溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為12 000 r/min的條件下離心收集上清液， 并將沉淀和上清液分別取樣。 將上清液與經(jīng)收菌緩沖液預(yù)先平衡的鎳介質(zhì)在溫度為4 ℃時(shí)充分混合2 h， 然后轉(zhuǎn)移到鎳離子層析柱中洗雜， 從層析柱流出的前幾滴溶液中取樣， 即為流穿樣。 用3倍柱體積的收菌緩沖液清洗殘留溶液，

在向?qū)游鲋屑尤氲? 次收菌緩沖液時(shí)懸浮介質(zhì)并取樣， 即為介質(zhì)樣。 利用含低濃度咪唑（50 mmol/L）的收菌緩沖液漂洗雜蛋白。 最后用3倍柱體積的鎳離子層析洗脫液（HEPES的濃度為20 mmol/L，pH=7.0，氯化鈉的濃度為300 mmol/L，甘油的體積分?jǐn)?shù)為5%，咪唑的濃度為500 mmol/L）洗脫目的蛋白。 采用SDS-PAGE檢測所得的目的蛋白和各步驟中留取的樣品。

1.2.4肝素親和層析

使用濃縮管將鎳離子親和層析柱純鹽獲得的目的蛋白于溫度為4 ℃、 轉(zhuǎn)速為3 500 r/min條件下離心濃縮至1 mL后，向濃縮管中加入等體積的緩沖液（HEPES的濃度為20 mmol/L， pH=7.0， 氯化鈉的濃度為20 mmol/L， 甘油的體積分?jǐn)?shù)為5%）， 繼續(xù)離心濃縮至1 mL， 反復(fù)操作8次，將獲得蛋白溶液中的氯化鈉的濃度降低至20 mmol/L。 利用蛋白純化系統(tǒng)（體積流速為0.5 mL/min， 上限壓強(qiáng)為2.0 MPa）對所得目的蛋白濃縮液進(jìn)行肝素親和層析， 在60 min內(nèi)將洗脫氯化鈉的濃度由20 mmol/L線性升高到1.0 mol/L。 收集蛋白樣品峰所對應(yīng)的洗脫液， 并將洗脫液樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.5凝膠過濾層析純化

預(yù)先用凝膠過濾層析緩沖液（HEPES的濃度為20 mmol/L，pH=7.0，氯化鈉的濃度為300 mmol/L）平衡層析柱，隨后將經(jīng)肝素親和層析純化所得的蛋白樣品濃縮并換液至凝膠過濾層析緩沖液中。設(shè)置體積流速為0.5 mL/min，上限壓強(qiáng)為2.0 MPa，使用SuperdexTM 200 Increase10/300 GL凝膠過濾層析柱收集目的蛋白。最后用SDS-PAGE檢測層析獲得的目的蛋白，并將目的蛋白濃縮后用NanoDrop微量紫外-可見分光光度計(jì)測定蛋白含量。

1.2.6蛋白結(jié)晶條件的篩選、 優(yōu)化與驗(yàn)證

采用坐滴法初步篩選所得純化蛋白樣品的結(jié)晶條件。篩選選用蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為25 g/L的溶液，池液與蛋白質(zhì)溶液按照體積比1∶1混合，結(jié)晶溫度為16 ℃，結(jié)晶試劑盒為IndexTM、 Crystal ScreenTM、 Crystal ScreenTM 2、 PEG/Ion ScreenTM、 PEG/Ion 2 ScreenTM、 Wizard Classic-1、 Wizard Classic-2、 Wizard Classic-3和Wizard Classic-4， 總計(jì)672種條件。 待晶體長出后， 選取形狀規(guī)則、 體積較大的晶體所對應(yīng)的生長條件用于后續(xù)優(yōu)化， 即通過梯度調(diào)整蛋白溶液濃度， 池液中沉淀劑濃度、 緩沖試劑種類、 酸堿度以及結(jié)晶生長溫度， 最終獲得生長較好的蛋白晶體。

為了驗(yàn)證優(yōu)化所得晶體是否為目的蛋白的結(jié)晶， 將所獲得的晶體（約50顆）從生長溶液中移至10 μL緩沖液（HEPES的濃度為20 mmol/L，pH=7.0，氯化鈉的濃度為200 mmol/L，甘油的體積分?jǐn)?shù)為5%），于100 ℃煮沸10 min后用SDS-PAGE檢測，并將目的蛋白所處凝膠部位切下，送上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司開展質(zhì)譜鑒定分析。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1目的基因的擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1為THOV-NPN基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)瓊脂糖電泳圖。由圖可見，THOV-NPN基因長度約為450 bp，圖1中THOV-NPN基因位置符合目的基因長度，表明PCR擴(kuò)增成功。重組后的表達(dá)載體pET28a-THOV-NPN經(jīng)雙酶切（BamH Ⅰ/Xho Ⅰ）鑒定，結(jié)果如圖2所示。 由圖可見，在基因長度約為450、 5200bp處各出現(xiàn)一條明顯的基因條帶，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)測序正確后可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2THOV-NPN重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

THOV-NPN重組蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，相較于誘導(dǎo)前樣，誘導(dǎo)后樣出現(xiàn)分子質(zhì)量約為18 kDa的誘導(dǎo)蛋白，該蛋白位置與預(yù)期目的蛋白的分子質(zhì)量18 kDa相符，表明THOV-NPN重組蛋白可在該條件下誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3鎳離子親和層析純化

THOV-NPN鎳離子親和層析純化過程各組分的SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖4所示。由圖可知，當(dāng)咪唑的濃度為50 mmol/L時(shí)，大量雜質(zhì)蛋白被洗脫，洗脫后的鎳離子親和層析柱所含THOV-NPN純度較高，但仍存在少量雜質(zhì)，須要進(jìn)一步地純化。

2.4肝素柱親和層析純化

將目的蛋白濃縮換液后進(jìn)行THOV-NPN肝素親和層析，結(jié)果如圖5所示，圖中曲線為目的蛋白在波長280 nm處的吸光度。由圖可知，除少量蛋白未能與肝素親和層析柱結(jié)合外，大部分蛋白已經(jīng)結(jié)合到純化柱中，層析過程觀察到2個(gè)峰型分別記為峰I和峰II。

采用SDS-PAGE檢測所收集的峰I、 峰II對應(yīng)的蛋白，結(jié)果如圖6所示。2個(gè)峰對應(yīng)的蛋白均為THOV-NPN，將蛋白分別收集濃縮后進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選，在篩選中峰I對應(yīng)的蛋白結(jié)晶晶體形狀更規(guī)則，所以將峰I對應(yīng)的蛋白用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5THOV-NPN重組蛋白的凝膠過濾層析

利用凝膠過濾層析表征THOV-NPN的聚集狀態(tài)及分子質(zhì)量。將肝素親和層析純化后的THOV-NPN溶液繼續(xù)濃縮并更換溶液至凝膠過濾層析緩沖液中，采用凝膠過濾層析柱進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖7所示，圖中曲線為峰I對應(yīng)的蛋白在波長280 nm處的吸光度。

根據(jù)凝膠過濾層析柱的工作原理，如果THOV-NPN為單體形式存在， 則應(yīng)在洗脫體積15 mL之后出現(xiàn)目的蛋白吸收峰， 而實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)吸收峰出現(xiàn)的位置為洗脫體積11.57 mL， 可以判斷THOV-NPN主要以多聚體的形式存在。 此外， 在整個(gè)層析過程僅出現(xiàn)1個(gè)主要吸收峰， 表明THOV-NPN的聚集狀態(tài)較為均一。 收集目的蛋白并經(jīng)超濾管濃縮后， 使用NanoDrop微量紫外-可見分光光度計(jì)測定THOV-NPN的含量， 并最終稀釋至質(zhì)量濃度為45 g/L后在液氮速凍， 置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6THOV-NPN結(jié)晶條件初篩與優(yōu)化

利用多種蛋白結(jié)晶試劑盒初步篩選THOV-NPN的結(jié)晶條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)THOV-NPN在4種條件下均可以長出晶體，具體條件如表1所示。

進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在Wizard Classic-2的第33號(hào)條件下長出的晶體形狀相對規(guī)則， 隨后針對該條件通過分別改變其中沉淀劑的濃度、 池液pH和蛋白濃度繼續(xù)優(yōu)化結(jié)晶條件， 最終在培養(yǎng)溫度為16 ℃， THOV-NPN的質(zhì)量濃度為25.0 g/L， 池液中磷酸氫二銨的濃度為0.8 mol/L、 檸檬酸鈉的濃度為0.1 mol/L、 pH為5.0、 氯化鈉的濃度為0.2 mol/L的條件下獲得了體積相對較大且形狀較為規(guī)則的THOV-NPN晶體， 晶體的光學(xué)顯微鏡圖像如圖8所示。從圖中可以看到： 優(yōu)化前的THOV-NPN晶體呈多面體且表面不規(guī)則， 粒徑約為0.02 mm； 優(yōu)化后晶體形狀近似正方體，最大個(gè)體粒徑約為0.05 mm。

2.7THOV-NPN晶體的質(zhì)譜鑒定分析

為了判斷優(yōu)化所得晶體是否為THOV-NPN的結(jié)晶，SDS-PAGE檢測所得晶體，結(jié)果如圖9所示。圖中主要目的條帶的分子質(zhì)量與結(jié)晶前的蛋白質(zhì)分子量基本一致（約18 kDa）。 主要條帶的質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖10所示。由圖可見，肽段的總體覆蓋率約為40.67%，可以斷定Wizard Classic-2的第33號(hào)條件優(yōu)化所得的晶體即為THOV-NPN晶體。

3結(jié)語

THOV作為正黏病毒科中的一員，其傳播范圍雖然沒有同科的流感病毒廣泛，但也是威脅人類生命健康的一種重要病原體。

本文中通過PCR、 載體構(gòu)建獲得了pET28a-THOV-NPN重組蛋白表達(dá)載體； 經(jīng)大腸桿菌異源表達(dá)、 親和層析以及凝膠過濾層析純化獲得了純度較高的THOV-NPN； 純化后的THOV-NPN經(jīng)晶體篩選與優(yōu)化， 獲得了體積相對較大、 形狀較規(guī)整的蛋白晶體， 具體條件： 培養(yǎng)溫度為16 ℃， THOV-NPN的質(zhì)量濃度為25.0 g/L，池液中磷酸氫二銨的濃度為0.8 mol/L， 檸檬酸鈉的濃度為0.1 mol/L， pH為5.0， 氯化鈉的濃度為0.2 mol/L。對所得蛋白晶體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，經(jīng)質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)其肽段覆蓋率約為40.67%，表明優(yōu)化所得的晶體即為THOV-NPN晶體。

本文中盡管沒有對所得THOV-NPN晶體進(jìn)行X射線衍射分析，但目前的研究結(jié)果可以為后續(xù)的三維空間結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)收集以及解析工作奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為開展基于THOV-NPN三維空間結(jié)構(gòu)的藥物研發(fā)提供了可能。

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（責(zé)任編輯：于海琴）

收稿日期： 2023-08-27網(wǎng)絡(luò)首發(fā)時(shí)間：2024-03-11T13：22：24

基金項(xiàng)目： 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2020QC057）； 泰山學(xué)者青年專家計(jì)劃項(xiàng)目（tsqn201812079）

第一作者簡介： 馬林（1998—），男，貴州銅仁人。碩士研究生，研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail： 632724135@qq.com。

通信作者簡介： 秦曉春（1980—），女，山東濟(jì)寧人。教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣夂献饔门c高光效農(nóng)業(yè)。E-mail： bio_qinxc@ujn.edu.cn。

董士尚（1987—），男，山東泰安人。講師，博士，研究方向?yàn)樯锎蠓肿拥慕Y(jié)構(gòu)與功能。E-mail： bio_dongss@ujn.edu.cn。

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